骨髓塑料包埋新技术对骨髓增生异常综合征诊断和分型价值的系列研究
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)21-2973-04
骨髓增生异常综合征(MDS)是一组典型的灰区(grey zone)病，表现一系或多系外周血细胞减少，骨髓功能异常而致三系血细胞病态发育以及骨髓增生异常活跃但又伴显著无效造血为特征。
我国和亚洲其它地区人群中MDS的发病率每年为10～12人/10万，较急性白血病(3～4人/10万)和再障(0.5～1人/10万)显著为高。MDS的发病涉及紊乱的干细胞及其造血微环境间的交互作用所致无效分化。此种异常发育必然导致三种主要骨髓结构与形态变异，即:(1)细胞发育与增生的异常;(2)骨髓组织结构的破坏;(3)骨髓基质的变异。可见，FAB组提出的单纯以骨髓涂片结合外周血液检查为依据的纯形态学分类标准无疑是十分不全面的，近些年来，无法列入FAB组原五亚型(期)的另一些MDS边缘型、诸如增生减退型和纤维增生型MDS等相继提出并渐获公认，而此组边缘型病例单靠骨髓涂片是绝对无法确诊的，从而显示出这一分类的不足，必须要有所修正。我们10多年来的研究工作表明，MDS的诊断必须经由规范染色的外周血与骨髓涂片，骨髓活检塑包切片三者间的有机结合。本系列研究试图于国内首次探索骨髓活检塑料切片在MDS的FAB分型以及诊断中的意义。
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1 本研究的目的和内容
已知，MDS患者的骨髓切片内均伴不同程度的组织正常结构破坏所致局部解剖学异常，以及其基质的变异。例如，正常切片内原始与早幼粒常单个散在分布于小梁旁区，倘若3～5个聚集成簇，定位于小梁间区，即称幼稚前体细胞异位(ALIP)，≥3mm 2 处为阳性。已证明，高危MDS各例均可检出ALIP，而低危MDS仅约50%切片内存在ALIP，且内中部分并非由粒系前体细胞构成，如何对“真性”与“假性”ALIP作出鉴别，是摆在血液病工作者面前的首要课题。再如，合并纤维化的MDS近年很常见，骨髓抽吸易致“干抽”或“血抽”，再次穿刺病人不易接受，那么，切片上是否也可替代涂片进行MDS的FAB分型?据上所述，本系列研究着重探索以下诸问题。
1.1 MDS骨髓切片上FAB分型的应用并与涂片作比较，看涂片与切片分型是否一致;当涂片取材不佳，切片是否可替代涂片作出MDS的诊断?
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1.2 于Hemapun865热塑包切片上，探索粒系、巨粒系和红系细胞局部解剖异常以及Gomori染色在MDS诊断中的意义。(1)切片内ALIP(+)是低危MDS的骨髓组织病理学特征。本质是由粒-单系细胞的祖细胞构成，对其阳性检出率及意义进行了探讨。(2)切片由处于同一发育阶段的幼红细胞岛(簇)定位于小梁旁区或小梁表面，称为“同期幼红细胞岛”，是MDS红系病态造血的特征，本研究探索其阳性率和意义。(3)已知约80%的MDS患者切片可见巨核系病态造血，一般在切片上较之涂片更易查出，主要与涂片上的巨核系细胞数量较少，而切片巨核细胞丰富有关。作为MDS骨髓组织学的特征之一，是微巨核以及2～5个小圆核的多核型小巨核的检出，本研究对这一病理形态进行了多年的探索。(4)已知约50%MDS患者骨髓切片经Gomori染色示轻至中度(+～++)网硬蛋白型纤维组织增生，另11%～15%病例病程中合并骨髓纤维化，并常因此致干抽，可发生在5种MDS亚型中。此即所谓纤维增生型MDS，本研究对此进行探索。(5)15(7～19)%的MDS属增生减退型，当骨髓切片造血组织容积<0.25(25%)即属本型。以RA和RAEB亚型最为常见，需与再障进行鉴别。本研究探讨这一边缘型在国内的发生率。
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1.3 骨髓切片免疫组织形态学在MDS诊断中意义的研究 骨髓活检切片内免疫组织化学和免疫组织形态学的检测是近些年来MDS诊断中的一项重要操作技术。过去，因GMA包埋过程中的“高温”和“遮蔽”现象，使塑包切片上无法进行免疫标记检测，尽管塑包切片上的细胞形态明显优于石蜡切片，但免疫组化染色还得在石蜡切片上进行。因此，到今天为止，国外多数实验室必须将所得骨髓活组织块纵向分割为二(塑料模具切割架)一份置于Bouin液内固定后作GMA包埋供常规染色用;另一份置PGA复合醛固定剂或其它特殊固定剂内固定后做石蜡包埋，供免疫组化染色用，后者还必须脱钙，工作量增加一倍，费用也大大增加。为了解决在同一活检块切割的切片上既能进行常染色又能施行免疫标记检测，我们于国内领先合成了第二代HEMAˉPUN948和959多功能包埋剂。以此为载体，进行了一系列有关MDS这一“灰区病”领域内众多争论不休而又悬而未决的问题进行了下列初步探索，另有一些问题尚待进一步深入研究。(1)低危MDS(RA，RARS)切片内特殊部位检出ALIP，其中<50%并非由髓系前体细胞所构成，此即“假性”ALIP，如何与“真性”ALIP鉴是?我们试图采用一组髓性分化抗体和系列特异性单抗，在同一ALIP集簇切割的不同切片(胞片)上进行常染色和免疫酶标(APAAP)检测，这一技术国外多数作者只能在石蜡切片上进行。我们可在HEMAPUN948和959上实施。这种方法极易在基层推广。(2)本研究进而又探索切片内采用CD61和CD41单抗，通过APAAP酶标技术，是否有助于病态多形性巨核细胞，尤其是直径<12(10～15)μm不典型淋巴样微巨核的识别?如成功，就有助于低危MDS的诊断，也易于在各级医院推广。(3)正常切片内幼红细胞岛(簇)主要定位于小梁间区，如果小梁旁区鉴出处于同一发育阶段的中、晚幼红细胞集簇(同期原红细胞岛)，就要与淋巴小结(滤泡)鉴别;如果处于同一发育阶段的原始、早幼红细胞集簇，就要与ALIP相鉴别。故而我们试图探索以抗血型糖蛋白A相关抗原之单抗，经APAAP免疫标记技术，看是否有助于同期原红细胞岛与淋巴小结或真性ALIP的鉴别。
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1.4 探讨涂片细胞形态与切片组织病理相结合的诊断与分类标准 在亚洲，MDS的发病率较急性白血病约高4～6倍，推算每年我国新发病的MDS病例数将高达20多万人。如何根据国情，因地制宜的正确诊断MDS，是摆在广大血液病工作者面前的重任。FAB组提出的标准是非常不全面的。本研究多年来对这一问题进行探索，提出了涂片与切片相结合的诊断标准。
2 资料与方法
2.1 活检切片FAB分型的应用及其与涂片之比较 收集30例MDS患者，男21例，女9例，12～74岁。按FAB标准作出诊断。RA18例，RARS4例，RAEB4例，RAEB-T3例，CMML1例。
以活检针作一步法双标本取材，Bouin液固定，脱水后作塑料包埋，2μm或3μm厚切片作HGF和MGG染色，5μm厚行铁染色和Gomori染色。进而判断:(1)造血组织面积与增生度;(2)原始细胞观察及分型比较;切片按目测分区分类记数法，与涂片同一标准制定MDS分型，比较两种标本分型之差异;(3)造血组织病理形态的判定;(4)巨核与肥大细胞记数;(5)骨小梁与静脉窦变化;(6)网硬蛋白纤维染色。
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2.2 GMA塑包切片上三系细胞局部解剖，网状纤维和增生度异常的评价 本研究共收集49例低危MDS(内RA41例，RARS8例)和17例高危MDS(RAEB8例，RAEB-T6例，CMML3例)。活检块经Bouin液固定，酒精梯度脱水，Hemapun865和948包埋，切片3μm厚行HGF和MGG染色。5μm厚作Gomori染色和Masson染色。按下法进行骨髓组织学和细胞形态学观察，以及组织形态数值之测量;并设正常骨髓切片10例和增生性贫血30例进行对照。
2.2.1 观察与计数低危MDS切片内ALIP 当切片内发现3 ～5个以上的原始与早幼粒集簇位于小梁间区或旁区，即称LAIP，3～5个为小簇，大于5个为大簇。记数时经直尺式镜台测微器标定的网形目镜测微器，每36个视野为1mm 2 ，记数2～3mm 2 内之ALIP数，取平均值，每mm 2 骨髓面积中至少检出≥3处定为ALIP(+)，且均为大、小簇混合出现。
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2.2.2 同期幼红细胞岛(簇)的观察 幼红细胞族(岛)异常定位是指同一发育阶段的幼红细胞以集簇形式定位于小梁旁区，≥3/mm 2 簇判定为阳性。
2.2.3 巨核系发育异常的观察 观察切片内巨核系细胞形态异常和微小巨核细胞的存在，计数巨核细胞数/mm 2 ，并与正常对照组进行比较。三抗为APAAP酶标复合物。三者均于湿盒内室温下孵育30min，滴加碱性磷酸酶底物显色液20μl后37℃下孵育显色20min，水洗后甘油明胶封片镜检。对照切片用正常AB血清替代一抗进行相应染色。
2.3 涂片细胞形态与切片组织病理相结合的诊断与分型标准 本文通过40例MDS(RA26例，RAS6例，RAEB4例，RAEB-T3例，CMML1例)骨髓组织病理学和与涂片的比较研究，提出了涂片细胞形态与切片组织病理相结合的诊断标准。
3 实验结果
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3.1 切片FAB分型的应用及其与涂片之比较
3.1.1 原始细胞观察和分型比较 本文30例涂片与切片按FAB标准的综合型分布之比较见表1。
表1 30例MDS涂片与切片分型分布之比较
本组25例涂片与切片内两者测得之原始细胞量类似，结果一致。另5例切片原始细胞百分率高于涂片，导致诊断矛盾。内4例涂片原始细胞<0.05，符合RA，而切片在0.05～0.10间，组织学上符合RAEB;另1例涂片RAEB，切片RAEB-T。
3.1.2 粒系病态造血之比较 涂片19例，而切片20例检出粒系病态。本组22例(8例RA，4例RARS，6例RAEB，4例RAEB-T)呈ALIP(+)。其中全部低危病例涂片上均无原始细胞过多现象。
3.1.3 红系病态造血之比较 本组30例涂片与切片均可检出红系病态。12例检出小梁旁区同期幼红细胞异常定位。
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3.1.4 巨核系病态造血之比较 17例(57%)涂片可检出微巨核及其它病态现象，而切片检出巨核系病态者27例(90%)，各例均见微巨核细胞。
3.2 GMA切片上三系细胞局部解剖，网状纤维和增生度异常的判定。
3.2.1 低危组MDS切片内ALIP 低危49例中阳性24例，阳性率49%，而对照组40例中ALIP均(-)。
3.2.2 同期幼红细胞岛(簇)的观察 低危49例中，32例呈同期幼红细胞异位(+)，阳性率为65%。而对照组40例中阳性3例，阳性率8%，两组差异有显著性(χ 2 =4.3，P<0.05)。
3.2.3 巨核系发育异常观察 本组低危49例中43例可检出不同程度的巨核系病态和微巨核细胞，阳性率为88%。
, 百拇医药 3.2.4 网硬蛋白纤维的判定 本研究低危49例和高危15例，合计64例中，正常者(-～±)6例，(+)者42例，(++)者11例，(+++)者5例，但三者染色阴性提示本组纤维增生型占7.8%。40例正常对照组中仅3例(+)，16例(±)，其余均(-)。
3.2.5 增生程度判定 本研究低危49例和高危15例，合计64例中，切片造血组织容积<0.25(25VOL%)者3例，故增生减退型占4.7%。其中2例RA，另1例为RAEB。
3.3 切片免疫组织形态学的研究
3.3.1 检测真性ALIP之结果 18例治疗前的MDS中，低危(RA+RARS)16例，高危(RAEB)2例;在HGF染色下，高危2例和低危9例可检出ALIP样集簇。但在CD34和CD33免疫酶标染色下，2例高危和5例低危MDS之第二代GMA塑包切片上，可识别出带有强烈髓系前体细胞标记的“真性”ALIP，且此种“真性”ALIP均为>6个前体细胞构成之巨大集簇。另4例低危MDS切片内常染色下所见之ALIP样(≤5个前体细胞)均呈CD34和CD33标记阴性，提示“假性”ALIP。
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3.3.2 检测病态微巨核之结果 在本研究18例MDS的第二代塑包切片中，包括微巨核在内的多形性巨核细胞，使用CD41和(或)CD61抗体，经APAAP免疫标记染色后，各例(100%)切片上均呈阳性显示并可作出正确识别。
3.3.3 检测同期幼红细胞岛 本研究6例MDS(RA5例，RAEB1例)使用血型糖蛋白A抗体，经APAAP免疫标记染色后，证明各切片中小染旁区分布的中、晚幼红细胞岛，核周胞浆均染成环状或模糊玫瑰或深红色阳性反应，从而有助于与同一切片内的淋巴细胞集簇间的鉴别。
3.4 涂片与切片相结合的诊断、分型标准 经过多年的研究，作者于1990年起就相继在骨髓增生异常综合征(白血病前期)、骨髓增生异常综合征的基础与临床以及21世纪课程教材内科学有关MDS章节中就提出了涂片与切片相结合的诊断标准:(1)以贫血症状为主，可兼有发热和(或)出血;(2)外周血一系、二系或全血细胞减少，并伴病态造血之形态学表现，白细胞增多或血小板增多偶见，血片内粒细胞检查易检出获得性佩-许异常;(3)骨髓涂片示增生活跃或异常活跃，少数也可增生减退，但必须以切片判定为准，以除外因合并纤维化而致“血抽”或“干抽”的可能性。涂片上至少有二系细胞病态造血之形态学证据，或涂片上病态造血<2系。但切片中有≥2系细胞出现病态造血的形态学特征;仅有红系病态诊断MDS应慎重;(4)骨髓切片中ALIP阳性，以及涂片和(或)切片内微巨核细胞的检出对诊断有较大特异性;(5)诊断MDS为排除性的，且病态造血并非MDS所特有，应除外其它能引起病态造血的疾病，如红白血病、亚急性和慢性粒细胞白血病、营养性巨幼细胞性贫血，药物不良反应等。(6)必要时应给予维生素B 12 1000μg/d，叶酸5mg/d和盐酸吡哆醇50mg/d试验治疗21天无效。
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4 讨论
MDS是一组异质性疾病，FAB组提出的诊断与分型标准主要以血液和骨髓涂片检查为依据，究竟活检切片上能否同样有效地使用此标准尚有争议。本研究30例MDS中的25例，切片组织学与涂片细胞学检查基本一致，另5例出现矛盾，4例涂片符合RA，而切片符合RAEB，另1例涂片为RAEB，切片为RAEB-T。考虑与抽吸涂片易遭静脉窦血液稀释，加之发育成熟的血细胞易于抽出，而原始细胞与基质的粘着力较发育成熟的细胞更强致使抽吸涂片内出现细胞分类计数的误差。可见切片对涂片所见起有补充与修正作用。如果一步法涂片取材失败，切片可替代涂片作出正确诊断，病人减少痛苦和经济负担。此外，涂片内巨核细胞病态的检出率较切片为低，可能与涂片可供辨认的巨核细胞数量较少有关。故在进行MDS诊断时，应提倡常规做骨髓活检，如果涂片仅一系病态，而切片有二系以上病态，应以活检切片结果为准。在实践中常有这样的情况，涂片与切片均符合RAEB-T，全切片却显示髓性白血病区与MDS区相交织，两区交界线十分明显。在MDS区内可见大量残存的幼红细胞簇和代偿性巨核细胞增生现象。
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此种病例往往于短期内即进展为典型的AML期，故实际已属 RAEB-T与AML间的过渡型阶段，虽则涂片内原始细胞<30%，但切片已有片状白血病细胞区，已进入早期AML，骨髓活检有助于此种病例的识别。
切片ALIP(+)是低危MDS的骨髓组织病理学特征。本研究49例低危MDS中29例(49%)呈ALIP(+)，而正常对照组均阴性。此外，本研究16例低危MDS中的9例和高危2例常染色下检出的ALIP样集簇。用同一塑包块切割的切片在CD34和CD33免疫酶标染色下，2例高危和5例低危MDS切片上可识别出带有髓系前体细胞标记的“真性”ALIP大簇。本系列研究证明，经本室改良的GMA冷-真空包埋操作为研究固着于切片小染旁区等特殊部位的细胞群体提供了一种有效手段。因为此处的主质细胞通常不易进入抽吸物涂片内，加上恶性血液病患者常合并不同程度的纤维组织增生，易致“血抽”或“干抽”，这时仅能在切片上进行免疫标记物表达的检测与研究。本研究又证明，切片内的ALIP与由原+早幼红以及巨核系前列细胞构成的集簇在形态学上较难鉴别。这时，CD34和CD33等免疫酶标染色即可识别此种“真性”ALIP。此外，集簇的大小也有助于“真性”和“假性”ALIP的识别，检出>6个前体细胞构成之巨大集簇，常属“真性”ALIP。如果两者之间在同一切片内并存，就能解答长期以来争议不休的问题，即如何将“假性”ALIP与“真性”ALIP作出可靠鉴别。
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骨髓活检切片内形态测量分析已广泛应用于CML和MDS不典型微巨核的检测。MDS巨核系病态发育的特点是由直径<30μm的中、小型侏儒巨核细胞为主要组分。本研究结果证明，经切片免疫酶标检测，100%MDS患者切片内均可检出直径<12(10～15)μm的淋巴样微巨核，有助于低危MDS的诊断。微巨核在常染色下形态上与ALL-L2型原淋巴十分类似，但前者是以病态发育结合强的PAS和α-萘酚醋酸酯酶(ANAE)组化阳性，外加CD61和CD41染色阳性为特征。此种不典型微巨核细胞群在MDS时约占总巨核细胞数的10%～20%。我们的结果证明，所有CD61阳性“单个核细胞”，一旦其直径<15μm，均应划入微巨核一档。本研究使用CD41和CD61免疫酶标方法，检出HGF或MGG常染色下难以识别的淋巴样微巨核，从而有助于良性和恶性血液病的鉴别，尤其有助于MDS的诊断。
正常骨髓切片内的幼红细胞岛(簇)主要定位于小染间区。MDS时，红系病态造血的表现之一是各例均可检出处于同一发育阶段的幼红细胞岛(簇)，即所谓“同期幼红细胞岛”位于小染旁区。如果岛内以原始和早幼红细胞为主，就易与LAIP相混淆;反之，如果岛中以中、晚幼红细胞为主，就易与淋巴细胞集簇相混淆。已知，切片中的淋巴细胞属于较难识别的细胞，它既可单个或2～3个散在分布于造血基质与脂肪细胞间，也可聚集形成集簇，可见以下4种构形，即:(1)生发中心小结;(2)境界清晰之小结;(3)边缘不规则小结;(4)小淋巴细胞集簇。这些构形如果定位于小染旁区，极易与中、晚幼红细胞构成之同期幼红细胞岛相混淆。本研究在我们自己研制的Hemapun948塑包切片上，于国内外首次经由血型糖蛋白A相关抗原的免疫酶标染色，解决了同一切片内幼红细胞岛与淋巴细胞集簇间的鉴别。
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按照国际惯例，在系统论和控制论中，以颜色显示信息度，凡信息确定(已知)的为白色，信息不确定(未知)的为黑色，部分确定、部分不确定的为灰色。灰色理论就是以信息不完全确定的灰色系统为主要研究对象，运用特定方法去研究和描述信息不完全确定的疾病或系统，并进行预测、决策和控制的一种崭新理论就称为灰学。在血液学领域内，MDS是一种典型的“灰区”病。本系列研究有计划、有步骤跨越10多年时段，对本征众多悬而未决的问题进行了初步探索。MDS是最常见的恶性克隆性疾病，我国年发病20余万人，首先必须要解决正确的诊断问题。
作者自1990年起，在各种场合，以及一系列论文和专著中提出MDS的诊断与分型必须以涂片细胞形态和切片组织病理相结合为原则。随后，世界卫生组织(WHO)在1997年11月，于弗吉尼亚召开了造血和淋巴组织恶性疾病分类和血液病理学讨论会，会上对先前的分类加以复习和讨论。
有关MDS分型与FAB组分型方案基本类似，但提出了以下修正意见:(1)首先，过去FAB组将原始细胞(Ⅰ+Ⅱ)>30%(0.3)作为MDS和AML划分的界限，但多年的实践证明，原始细胞介于0.2～0.3(20%～30%)的RAEB-T患者，与原始细胞>0.3(30%)的AMI病例具有相似的临床表现和预后;因此，WHO建议将原始细胞>0.2(>20%)作为定义AML的诊断条件，取消MDS中的RAEB-T亚型。(2)其次，某些MDS病例无法按原FAB标准归入相应的亚型中，需作相应修正，包括:①伴多系病态，造血的难治性血细胞减少症(RCMD);②RARS再分型;③CMML的再分型等。(3)再次，由于骨髓活检塑料包埋技术在全球的普及与推广，根据切片增生度，网硬蛋白量，真性ALIP有无、外加切片免疫酶标检测。WHO提出了一些特殊的MDS形态学或组织学“边缘型”，作为对FAB分型的又一补充，包括:①增生减退型MDS;②纤维增生型MDS;③治疗相关型MDS等，此等边缘型如不常规进行一步法双标本取材作骨髓切片的检查，肯定是要漏诊的。由此可见，FAB协作组提出的单纯以骨髓抽取物涂片结合外周血片作为依据的纯形态学分类标准，无疑要有所修正。本研究十多年来一直强调只有涂片细胞形态与切片组织病理相结合的分类系统，才能全面而精确的诊断MDS是非常正确的预言。
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5 结论
(1)本研究设计以Hemapun865塑包切片、HGF或MGG染色，结合目测分区血细胞分类计数技术，在切片上同样可进行MDS的FAB分型。当涂片因合并纤维化而“干抽”或“血抽”，切片可替代涂片作分型。(2)切片内由髓系前体细胞构成的“真性”ALIP，与由红系或巨核系前体细胞构成的“假性”ALIP在形态上较难鉴别。国外多数作者只能在石蜡切片上进行此种鉴别。本研究在我们自行研制的Hemaˉpun948和959塑包切片中，使用一组髓性分化抗原可进行此种鉴别。(3)集簇的大小也有助于“真性”和“假性”ALIP的鉴别。凡检出>6个前体细胞构成的巨大的集簇，常属“真性”。如两者在同一切片内并存，对正确诊断有重要意义。(4)切片内CD61和CD41免疫标记技术有助于病态多形性巨核细胞，尤其是直径<12(10～15)μm微巨核的识别，从而对低危MDS的诊断，尤其与再障的鉴别有意义。(5)切片内使用血型糖蛋白A相关抗原的免疫酶标技术有助于小梁旁区的“同期幼红细胞岛”与淋巴小结的鉴别。(6)我们于国内、外首次提出，单纯以血液和骨髓涂片细胞 形态作为MDS诊断依据的FAB标准是不全面的，十多年来，我们一贯主张MDS的诊断必须将涂片细胞形态与切片组织病理相结合。也只有这样，才能使1997年WHO提议的一些组织学“边缘型”不至于漏诊。
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作者单位:200233上海交通大学医学院附属医院，
上海市第六人民医院血液科及血液病理研究室
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骨髓增生异常综合征(MDS)是一组典型的灰区(grey zone)病，表现一系或多系外周血细胞减少，骨髓功能异常而致三系血细胞病态发育以及骨髓增生异常活跃但又伴显著无效造血为特征。
我国和亚洲其它地区人群中MDS的发病率每年为10～12人/10万，较急性白血病(3～4人/10万)和再障(0.5～1人/10万)显著为高。MDS的发病涉及紊乱的干细胞及其造血微环境间的交互作用所致无效分化。此种异常发育必然导致三种主要骨髓结构与形态变异，即:(1)细胞发育与增生的异常;(2)骨髓组织结构的破坏;(3)骨髓基质的变异。可见，FAB组提出的单纯以骨髓涂片结合外周血液检查为依据的纯形态学分类标准无疑是十分不全面的，近些年来，无法列入FAB组原五亚型(期)的另一些MDS边缘型、诸如增生减退型和纤维增生型MDS等相继提出并渐获公认，而此组边缘型病例单靠骨髓涂片是绝对无法确诊的，从而显示出这一分类的不足，必须要有所修正。我们10多年来的研究工作表明，MDS的诊断必须经由规范染色的外周血与骨髓涂片，骨髓活检塑包切片三者间的有机结合。本系列研究试图于国内首次探索骨髓活检塑料切片在MDS的FAB分型以及诊断中的意义。
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1 本研究的目的和内容
已知，MDS患者的骨髓切片内均伴不同程度的组织正常结构破坏所致局部解剖学异常，以及其基质的变异。例如，正常切片内原始与早幼粒常单个散在分布于小梁旁区，倘若3～5个聚集成簇，定位于小梁间区，即称幼稚前体细胞异位(ALIP)，≥3mm 2 处为阳性。已证明，高危MDS各例均可检出ALIP，而低危MDS仅约50%切片内存在ALIP，且内中部分并非由粒系前体细胞构成，如何对“真性”与“假性”ALIP作出鉴别，是摆在血液病工作者面前的首要课题。再如，合并纤维化的MDS近年很常见，骨髓抽吸易致“干抽”或“血抽”，再次穿刺病人不易接受，那么，切片上是否也可替代涂片进行MDS的FAB分型?据上所述，本系列研究着重探索以下诸问题。
1.1 MDS骨髓切片上FAB分型的应用并与涂片作比较，看涂片与切片分型是否一致;当涂片取材不佳，切片是否可替代涂片作出MDS的诊断?
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1.2 于Hemapun865热塑包切片上，探索粒系、巨粒系和红系细胞局部解剖异常以及Gomori染色在MDS诊断中的意义。(1)切片内ALIP(+)是低危MDS的骨髓组织病理学特征。本质是由粒-单系细胞的祖细胞构成，对其阳性检出率及意义进行了探讨。(2)切片由处于同一发育阶段的幼红细胞岛(簇)定位于小梁旁区或小梁表面，称为“同期幼红细胞岛”，是MDS红系病态造血的特征，本研究探索其阳性率和意义。(3)已知约80%的MDS患者切片可见巨核系病态造血，一般在切片上较之涂片更易查出，主要与涂片上的巨核系细胞数量较少，而切片巨核细胞丰富有关。作为MDS骨髓组织学的特征之一，是微巨核以及2～5个小圆核的多核型小巨核的检出，本研究对这一病理形态进行了多年的探索。(4)已知约50%MDS患者骨髓切片经Gomori染色示轻至中度(+～++)网硬蛋白型纤维组织增生，另11%～15%病例病程中合并骨髓纤维化，并常因此致干抽，可发生在5种MDS亚型中。此即所谓纤维增生型MDS，本研究对此进行探索。(5)15(7～19)%的MDS属增生减退型，当骨髓切片造血组织容积<0.25(25%)即属本型。以RA和RAEB亚型最为常见，需与再障进行鉴别。本研究探讨这一边缘型在国内的发生率。
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1.3 骨髓切片免疫组织形态学在MDS诊断中意义的研究 骨髓活检切片内免疫组织化学和免疫组织形态学的检测是近些年来MDS诊断中的一项重要操作技术。过去，因GMA包埋过程中的“高温”和“遮蔽”现象，使塑包切片上无法进行免疫标记检测，尽管塑包切片上的细胞形态明显优于石蜡切片，但免疫组化染色还得在石蜡切片上进行。因此，到今天为止，国外多数实验室必须将所得骨髓活组织块纵向分割为二(塑料模具切割架)一份置于Bouin液内固定后作GMA包埋供常规染色用;另一份置PGA复合醛固定剂或其它特殊固定剂内固定后做石蜡包埋，供免疫组化染色用，后者还必须脱钙，工作量增加一倍，费用也大大增加。为了解决在同一活检块切割的切片上既能进行常染色又能施行免疫标记检测，我们于国内领先合成了第二代HEMAˉPUN948和959多功能包埋剂。以此为载体，进行了一系列有关MDS这一“灰区病”领域内众多争论不休而又悬而未决的问题进行了下列初步探索，另有一些问题尚待进一步深入研究。(1)低危MDS(RA，RARS)切片内特殊部位检出ALIP，其中<50%并非由髓系前体细胞所构成，此即“假性”ALIP，如何与“真性”ALIP鉴是?我们试图采用一组髓性分化抗体和系列特异性单抗，在同一ALIP集簇切割的不同切片(胞片)上进行常染色和免疫酶标(APAAP)检测，这一技术国外多数作者只能在石蜡切片上进行。我们可在HEMAPUN948和959上实施。这种方法极易在基层推广。(2)本研究进而又探索切片内采用CD61和CD41单抗，通过APAAP酶标技术，是否有助于病态多形性巨核细胞，尤其是直径<12(10～15)μm不典型淋巴样微巨核的识别?如成功，就有助于低危MDS的诊断，也易于在各级医院推广。(3)正常切片内幼红细胞岛(簇)主要定位于小梁间区，如果小梁旁区鉴出处于同一发育阶段的中、晚幼红细胞集簇(同期原红细胞岛)，就要与淋巴小结(滤泡)鉴别;如果处于同一发育阶段的原始、早幼红细胞集簇，就要与ALIP相鉴别。故而我们试图探索以抗血型糖蛋白A相关抗原之单抗，经APAAP免疫标记技术，看是否有助于同期原红细胞岛与淋巴小结或真性ALIP的鉴别。
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1.4 探讨涂片细胞形态与切片组织病理相结合的诊断与分类标准 在亚洲，MDS的发病率较急性白血病约高4～6倍，推算每年我国新发病的MDS病例数将高达20多万人。如何根据国情，因地制宜的正确诊断MDS，是摆在广大血液病工作者面前的重任。FAB组提出的标准是非常不全面的。本研究多年来对这一问题进行探索，提出了涂片与切片相结合的诊断标准。
2 资料与方法
2.1 活检切片FAB分型的应用及其与涂片之比较 收集30例MDS患者，男21例，女9例，12～74岁。按FAB标准作出诊断。RA18例，RARS4例，RAEB4例，RAEB-T3例，CMML1例。
以活检针作一步法双标本取材，Bouin液固定，脱水后作塑料包埋，2μm或3μm厚切片作HGF和MGG染色，5μm厚行铁染色和Gomori染色。进而判断:(1)造血组织面积与增生度;(2)原始细胞观察及分型比较;切片按目测分区分类记数法，与涂片同一标准制定MDS分型，比较两种标本分型之差异;(3)造血组织病理形态的判定;(4)巨核与肥大细胞记数;(5)骨小梁与静脉窦变化;(6)网硬蛋白纤维染色。
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2.2 GMA塑包切片上三系细胞局部解剖，网状纤维和增生度异常的评价 本研究共收集49例低危MDS(内RA41例，RARS8例)和17例高危MDS(RAEB8例，RAEB-T6例，CMML3例)。活检块经Bouin液固定，酒精梯度脱水，Hemapun865和948包埋，切片3μm厚行HGF和MGG染色。5μm厚作Gomori染色和Masson染色。按下法进行骨髓组织学和细胞形态学观察，以及组织形态数值之测量;并设正常骨髓切片10例和增生性贫血30例进行对照。
2.2.1 观察与计数低危MDS切片内ALIP 当切片内发现3 ～5个以上的原始与早幼粒集簇位于小梁间区或旁区，即称LAIP，3～5个为小簇，大于5个为大簇。记数时经直尺式镜台测微器标定的网形目镜测微器，每36个视野为1mm 2 ，记数2～3mm 2 内之ALIP数，取平均值，每mm 2 骨髓面积中至少检出≥3处定为ALIP(+)，且均为大、小簇混合出现。
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2.2.2 同期幼红细胞岛(簇)的观察 幼红细胞族(岛)异常定位是指同一发育阶段的幼红细胞以集簇形式定位于小梁旁区，≥3/mm 2 簇判定为阳性。
2.2.3 巨核系发育异常的观察 观察切片内巨核系细胞形态异常和微小巨核细胞的存在，计数巨核细胞数/mm 2 ，并与正常对照组进行比较。三抗为APAAP酶标复合物。三者均于湿盒内室温下孵育30min，滴加碱性磷酸酶底物显色液20μl后37℃下孵育显色20min，水洗后甘油明胶封片镜检。对照切片用正常AB血清替代一抗进行相应染色。
2.3 涂片细胞形态与切片组织病理相结合的诊断与分型标准 本文通过40例MDS(RA26例，RAS6例，RAEB4例，RAEB-T3例，CMML1例)骨髓组织病理学和与涂片的比较研究，提出了涂片细胞形态与切片组织病理相结合的诊断标准。
3 实验结果
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3.1 切片FAB分型的应用及其与涂片之比较
3.1.1 原始细胞观察和分型比较 本文30例涂片与切片按FAB标准的综合型分布之比较见表1。
表1 30例MDS涂片与切片分型分布之比较
本组25例涂片与切片内两者测得之原始细胞量类似，结果一致。另5例切片原始细胞百分率高于涂片，导致诊断矛盾。内4例涂片原始细胞<0.05，符合RA，而切片在0.05～0.10间，组织学上符合RAEB;另1例涂片RAEB，切片RAEB-T。
3.1.2 粒系病态造血之比较 涂片19例，而切片20例检出粒系病态。本组22例(8例RA，4例RARS，6例RAEB，4例RAEB-T)呈ALIP(+)。其中全部低危病例涂片上均无原始细胞过多现象。
3.1.3 红系病态造血之比较 本组30例涂片与切片均可检出红系病态。12例检出小梁旁区同期幼红细胞异常定位。
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3.1.4 巨核系病态造血之比较 17例(57%)涂片可检出微巨核及其它病态现象，而切片检出巨核系病态者27例(90%)，各例均见微巨核细胞。
3.2 GMA切片上三系细胞局部解剖，网状纤维和增生度异常的判定。
3.2.1 低危组MDS切片内ALIP 低危49例中阳性24例，阳性率49%，而对照组40例中ALIP均(-)。
3.2.2 同期幼红细胞岛(簇)的观察 低危49例中，32例呈同期幼红细胞异位(+)，阳性率为65%。而对照组40例中阳性3例，阳性率8%，两组差异有显著性(χ 2 =4.3，P<0.05)。
3.2.3 巨核系发育异常观察 本组低危49例中43例可检出不同程度的巨核系病态和微巨核细胞，阳性率为88%。
, 百拇医药 3.2.4 网硬蛋白纤维的判定 本研究低危49例和高危15例，合计64例中，正常者(-～±)6例，(+)者42例，(++)者11例，(+++)者5例，但三者染色阴性提示本组纤维增生型占7.8%。40例正常对照组中仅3例(+)，16例(±)，其余均(-)。
3.2.5 增生程度判定 本研究低危49例和高危15例，合计64例中，切片造血组织容积<0.25(25VOL%)者3例，故增生减退型占4.7%。其中2例RA，另1例为RAEB。
3.3 切片免疫组织形态学的研究
3.3.1 检测真性ALIP之结果 18例治疗前的MDS中，低危(RA+RARS)16例，高危(RAEB)2例;在HGF染色下，高危2例和低危9例可检出ALIP样集簇。但在CD34和CD33免疫酶标染色下，2例高危和5例低危MDS之第二代GMA塑包切片上，可识别出带有强烈髓系前体细胞标记的“真性”ALIP，且此种“真性”ALIP均为>6个前体细胞构成之巨大集簇。另4例低危MDS切片内常染色下所见之ALIP样(≤5个前体细胞)均呈CD34和CD33标记阴性，提示“假性”ALIP。
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3.3.2 检测病态微巨核之结果 在本研究18例MDS的第二代塑包切片中，包括微巨核在内的多形性巨核细胞，使用CD41和(或)CD61抗体，经APAAP免疫标记染色后，各例(100%)切片上均呈阳性显示并可作出正确识别。
3.3.3 检测同期幼红细胞岛 本研究6例MDS(RA5例，RAEB1例)使用血型糖蛋白A抗体，经APAAP免疫标记染色后，证明各切片中小染旁区分布的中、晚幼红细胞岛，核周胞浆均染成环状或模糊玫瑰或深红色阳性反应，从而有助于与同一切片内的淋巴细胞集簇间的鉴别。
3.4 涂片与切片相结合的诊断、分型标准 经过多年的研究，作者于1990年起就相继在骨髓增生异常综合征(白血病前期)、骨髓增生异常综合征的基础与临床以及21世纪课程教材内科学有关MDS章节中就提出了涂片与切片相结合的诊断标准:(1)以贫血症状为主，可兼有发热和(或)出血;(2)外周血一系、二系或全血细胞减少，并伴病态造血之形态学表现，白细胞增多或血小板增多偶见，血片内粒细胞检查易检出获得性佩-许异常;(3)骨髓涂片示增生活跃或异常活跃，少数也可增生减退，但必须以切片判定为准，以除外因合并纤维化而致“血抽”或“干抽”的可能性。涂片上至少有二系细胞病态造血之形态学证据，或涂片上病态造血<2系。但切片中有≥2系细胞出现病态造血的形态学特征;仅有红系病态诊断MDS应慎重;(4)骨髓切片中ALIP阳性，以及涂片和(或)切片内微巨核细胞的检出对诊断有较大特异性;(5)诊断MDS为排除性的，且病态造血并非MDS所特有，应除外其它能引起病态造血的疾病，如红白血病、亚急性和慢性粒细胞白血病、营养性巨幼细胞性贫血，药物不良反应等。(6)必要时应给予维生素B 12 1000μg/d，叶酸5mg/d和盐酸吡哆醇50mg/d试验治疗21天无效。
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4 讨论
MDS是一组异质性疾病，FAB组提出的诊断与分型标准主要以血液和骨髓涂片检查为依据，究竟活检切片上能否同样有效地使用此标准尚有争议。本研究30例MDS中的25例，切片组织学与涂片细胞学检查基本一致，另5例出现矛盾，4例涂片符合RA，而切片符合RAEB，另1例涂片为RAEB，切片为RAEB-T。考虑与抽吸涂片易遭静脉窦血液稀释，加之发育成熟的血细胞易于抽出，而原始细胞与基质的粘着力较发育成熟的细胞更强致使抽吸涂片内出现细胞分类计数的误差。可见切片对涂片所见起有补充与修正作用。如果一步法涂片取材失败，切片可替代涂片作出正确诊断，病人减少痛苦和经济负担。此外，涂片内巨核细胞病态的检出率较切片为低，可能与涂片可供辨认的巨核细胞数量较少有关。故在进行MDS诊断时，应提倡常规做骨髓活检，如果涂片仅一系病态，而切片有二系以上病态，应以活检切片结果为准。在实践中常有这样的情况，涂片与切片均符合RAEB-T，全切片却显示髓性白血病区与MDS区相交织，两区交界线十分明显。在MDS区内可见大量残存的幼红细胞簇和代偿性巨核细胞增生现象。
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此种病例往往于短期内即进展为典型的AML期，故实际已属 RAEB-T与AML间的过渡型阶段，虽则涂片内原始细胞<30%，但切片已有片状白血病细胞区，已进入早期AML，骨髓活检有助于此种病例的识别。
切片ALIP(+)是低危MDS的骨髓组织病理学特征。本研究49例低危MDS中29例(49%)呈ALIP(+)，而正常对照组均阴性。此外，本研究16例低危MDS中的9例和高危2例常染色下检出的ALIP样集簇。用同一塑包块切割的切片在CD34和CD33免疫酶标染色下，2例高危和5例低危MDS切片上可识别出带有髓系前体细胞标记的“真性”ALIP大簇。本系列研究证明，经本室改良的GMA冷-真空包埋操作为研究固着于切片小染旁区等特殊部位的细胞群体提供了一种有效手段。因为此处的主质细胞通常不易进入抽吸物涂片内，加上恶性血液病患者常合并不同程度的纤维组织增生，易致“血抽”或“干抽”，这时仅能在切片上进行免疫标记物表达的检测与研究。本研究又证明，切片内的ALIP与由原+早幼红以及巨核系前列细胞构成的集簇在形态学上较难鉴别。这时，CD34和CD33等免疫酶标染色即可识别此种“真性”ALIP。此外，集簇的大小也有助于“真性”和“假性”ALIP的识别，检出>6个前体细胞构成之巨大集簇，常属“真性”ALIP。如果两者之间在同一切片内并存，就能解答长期以来争议不休的问题，即如何将“假性”ALIP与“真性”ALIP作出可靠鉴别。
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骨髓活检切片内形态测量分析已广泛应用于CML和MDS不典型微巨核的检测。MDS巨核系病态发育的特点是由直径<30μm的中、小型侏儒巨核细胞为主要组分。本研究结果证明，经切片免疫酶标检测，100%MDS患者切片内均可检出直径<12(10～15)μm的淋巴样微巨核，有助于低危MDS的诊断。微巨核在常染色下形态上与ALL-L2型原淋巴十分类似，但前者是以病态发育结合强的PAS和α-萘酚醋酸酯酶(ANAE)组化阳性，外加CD61和CD41染色阳性为特征。此种不典型微巨核细胞群在MDS时约占总巨核细胞数的10%～20%。我们的结果证明，所有CD61阳性“单个核细胞”，一旦其直径<15μm，均应划入微巨核一档。本研究使用CD41和CD61免疫酶标方法，检出HGF或MGG常染色下难以识别的淋巴样微巨核，从而有助于良性和恶性血液病的鉴别，尤其有助于MDS的诊断。
正常骨髓切片内的幼红细胞岛(簇)主要定位于小染间区。MDS时，红系病态造血的表现之一是各例均可检出处于同一发育阶段的幼红细胞岛(簇)，即所谓“同期幼红细胞岛”位于小染旁区。如果岛内以原始和早幼红细胞为主，就易与LAIP相混淆;反之，如果岛中以中、晚幼红细胞为主，就易与淋巴细胞集簇相混淆。已知，切片中的淋巴细胞属于较难识别的细胞，它既可单个或2～3个散在分布于造血基质与脂肪细胞间，也可聚集形成集簇，可见以下4种构形，即:(1)生发中心小结;(2)境界清晰之小结;(3)边缘不规则小结;(4)小淋巴细胞集簇。这些构形如果定位于小染旁区，极易与中、晚幼红细胞构成之同期幼红细胞岛相混淆。本研究在我们自己研制的Hemapun948塑包切片上，于国内外首次经由血型糖蛋白A相关抗原的免疫酶标染色，解决了同一切片内幼红细胞岛与淋巴细胞集簇间的鉴别。
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按照国际惯例，在系统论和控制论中，以颜色显示信息度，凡信息确定(已知)的为白色，信息不确定(未知)的为黑色，部分确定、部分不确定的为灰色。灰色理论就是以信息不完全确定的灰色系统为主要研究对象，运用特定方法去研究和描述信息不完全确定的疾病或系统，并进行预测、决策和控制的一种崭新理论就称为灰学。在血液学领域内，MDS是一种典型的“灰区”病。本系列研究有计划、有步骤跨越10多年时段，对本征众多悬而未决的问题进行了初步探索。MDS是最常见的恶性克隆性疾病，我国年发病20余万人，首先必须要解决正确的诊断问题。
作者自1990年起，在各种场合，以及一系列论文和专著中提出MDS的诊断与分型必须以涂片细胞形态和切片组织病理相结合为原则。随后，世界卫生组织(WHO)在1997年11月，于弗吉尼亚召开了造血和淋巴组织恶性疾病分类和血液病理学讨论会，会上对先前的分类加以复习和讨论。
有关MDS分型与FAB组分型方案基本类似，但提出了以下修正意见:(1)首先，过去FAB组将原始细胞(Ⅰ+Ⅱ)>30%(0.3)作为MDS和AML划分的界限，但多年的实践证明，原始细胞介于0.2～0.3(20%～30%)的RAEB-T患者，与原始细胞>0.3(30%)的AMI病例具有相似的临床表现和预后;因此，WHO建议将原始细胞>0.2(>20%)作为定义AML的诊断条件，取消MDS中的RAEB-T亚型。(2)其次，某些MDS病例无法按原FAB标准归入相应的亚型中，需作相应修正，包括:①伴多系病态，造血的难治性血细胞减少症(RCMD);②RARS再分型;③CMML的再分型等。(3)再次，由于骨髓活检塑料包埋技术在全球的普及与推广，根据切片增生度，网硬蛋白量，真性ALIP有无、外加切片免疫酶标检测。WHO提出了一些特殊的MDS形态学或组织学“边缘型”，作为对FAB分型的又一补充，包括:①增生减退型MDS;②纤维增生型MDS;③治疗相关型MDS等，此等边缘型如不常规进行一步法双标本取材作骨髓切片的检查，肯定是要漏诊的。由此可见，FAB协作组提出的单纯以骨髓抽取物涂片结合外周血片作为依据的纯形态学分类标准，无疑要有所修正。本研究十多年来一直强调只有涂片细胞形态与切片组织病理相结合的分类系统，才能全面而精确的诊断MDS是非常正确的预言。
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5 结论
(1)本研究设计以Hemapun865塑包切片、HGF或MGG染色，结合目测分区血细胞分类计数技术，在切片上同样可进行MDS的FAB分型。当涂片因合并纤维化而“干抽”或“血抽”，切片可替代涂片作分型。(2)切片内由髓系前体细胞构成的“真性”ALIP，与由红系或巨核系前体细胞构成的“假性”ALIP在形态上较难鉴别。国外多数作者只能在石蜡切片上进行此种鉴别。本研究在我们自行研制的Hemaˉpun948和959塑包切片中，使用一组髓性分化抗原可进行此种鉴别。(3)集簇的大小也有助于“真性”和“假性”ALIP的鉴别。凡检出>6个前体细胞构成的巨大的集簇，常属“真性”。如两者在同一切片内并存，对正确诊断有重要意义。(4)切片内CD61和CD41免疫标记技术有助于病态多形性巨核细胞，尤其是直径<12(10～15)μm微巨核的识别，从而对低危MDS的诊断，尤其与再障的鉴别有意义。(5)切片内使用血型糖蛋白A相关抗原的免疫酶标技术有助于小梁旁区的“同期幼红细胞岛”与淋巴小结的鉴别。(6)我们于国内、外首次提出，单纯以血液和骨髓涂片细胞 形态作为MDS诊断依据的FAB标准是不全面的，十多年来，我们一贯主张MDS的诊断必须将涂片细胞形态与切片组织病理相结合。也只有这样，才能使1997年WHO提议的一些组织学“边缘型”不至于漏诊。
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作者单位:200233上海交通大学医学院附属医院，
上海市第六人民医院血液科及血液病理研究室
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