苯异羟肟酸类化合物的合成及其抗肿瘤活性的研究
【文献标识码】 B 【文章编号】 1606-8106(2003)19-2817-02
异羟肟酸也称氧肟酸，具有两种互变异构体，即异羟肟酸和羟肟酸，并且以异羟肟酸为主要成分。异羟肟酸结构式为R-CO-NHOH，是一种有机螯合剂，能与Cu 2+ 、Zn 2+ 、Co 2+ 、Ni 2+ 、Fe 3+ 离子形成稳定的金属螯合物 [1] 。
由于其特殊的结构和功能，异羟肟酸已成为化学和生物学的一类重要化合物，他们具有广泛的生物活性，并存在若干天然药用化合物中，因而日益引起药物化学家和生物化学家的关注 [2] ，其显著的络合能力不仅使之构成现代冶金学上广泛使用的一大类浮选剂，而且在新药物的研制方面存在着可喜的应用前景，是值得深入研究和开发的一类新药。
, 百拇医药 60年代以来，在异羟肟酸及其盐类用作选矿中的浮选剂方面，科学工作者进行了大量的研究，也取得了很好的成果 [3～5] ，但是有关异羟肟酸及其衍生物的生物活性方面的研究是近几年才刚刚开始的。有关文献报导了一些异羟肟酸的生理活性，特别是报导了其具有抗癌作用 [6，7] ，但是这 些异羟肟酸均是大分子化合物，合成非常困难，又难以工业化。本文合成了五种小分子的苯异羟肟酸，并进行了体内、体外的抗肿瘤作用的研究，取得了很好的效果。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器 付里叶变换红外光谱仪(美国PE-spectrum One B)，高效液相色谱仪(日本岛津LC-10A)，气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent6890N/5973N)，熔点测定仪(X4北京第三光学仪器厂)，元素分析仪(美国PE-2400)，核磁共振波谱仪(德国布鲁克400兆)，电磁搅拌器，恒温水浴，常用玻璃仪器。
, 百拇医药
1.1.2 试剂 取代的苯甲酸乙酯(自己合成)，苯(AR，天津化学试剂厂)，NaOH(AR天津化学试剂厂)，Na 2 CO 3 (AR，天津化学试剂厂)，乙醚(AR，天津化学试剂厂)，乙烷(AR，天津化学试剂厂)，盐酸羟胺(AR，北京化工厂)，浓H 2 SO 4 (AR，哈尔滨市化工试剂厂)，NaCl(AR，哈尔滨市化工试剂厂)，乙醇(AR，哈尔滨市化工试剂厂)。
1.2 苯异羟肟酸类化合物的合成 [7] 见分子式。
1.2.1 乙酯的制备 取不同取代基团的苯甲酸各0.2mol，溶于100ml乙醇中，加入10g催化剂和10ml带水剂，回流4～8h(不同原料回流时间不同)，减压蒸馏除去溶剂，得到黄色溶液，用Na 2 CO 3 调pH至碱性，再用己烷萃取，蒸去己烷得乙酯的粗产品，若产品为液体，将粗产品减压蒸馏，收集所需要的馏分，得纯品;若产品是固体，通过过滤、水洗得到纯品。产品用GC/MS分析，确定是我们所需要的化合物纯度为99%，产率为85%。
, 百拇医药
1.2.2 苯异羟肟酸的制备 将20gNaOH溶于50ml30%乙醇中，将0.2mol的盐酸羟胺溶于50ml30%乙醇中，再将两者混合搅拌2h，使NaOH与盐酸羟胺完全反应，然后冷却至0℃，过滤，在滤液中加入0.1mol乙酯，50℃下放置4h，用稀H 2 SO 4 调至pH为6.0，有浅粉红色固体析出，过滤得粗产品，用水-乙醇重结晶得纯品，产率为80%，产品经高效液相色谱分析，得纯度为99.2%，通过熔点测定仪、付里叶变换红外光谱仪、核磁共振波谱仪、元素分析仪的分析，确定了五种化合物的结构。
2 MTT实验
将所合成的化合物用生理盐水配成母液，-20℃冰箱保存备用，每种化合物均设0.1、1.0、10×PPC三个浓度，临用前配制。将肿瘤细胞浓度调为10 4 ～10 5 个/ml，并置于96孔平底培养板中(100ml/孔)，加入不同浓度的化合物10μl/孔，每个浓度设3个平行孔，对照孔不加药。震荡10min后，置37℃，5%湿化CO 2 培养箱中培养3天，加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，继续培养4h，用快速翻板法 [8] 去除培养液及药液，加入DMSO100μl/孔，震荡10min，用酶标仪测OD值(λ490nm)，计算抑制率。
, http://www.100md.com
抑制率=(1-对照孔平均吸收加药孔平均吸收)×100%，当抑制率≥50%时，判断该药敏感。
3 结果
(1)用一种肿瘤细胞在每孔(0.2～1.1)×10 5 范围内，细胞数与MTT甲月赞化合物的比值正相关，不同肿瘤细胞产生的MTT甲月赞化合物量差异较大。(2)所合成的化合物的体外抑瘤率与细胞种类无关。(3)5种化合物A、B、C、D、E中，其中E的抑瘤率最大，平均达到77.1%(Hela、SGC-7910、8910、8910PM和BGC-823的抑制率的平均值)。化合物B的抑瘤率为最低，平均达到37.8%。
4 讨论
虽然通过MTT法得到了化合物A、B、C、D、E的抑瘤率，但MTT方法本身存在着某些不足 [9] ，因此，还需要其它实验来证实其抑瘤率。
, 百拇医药
参考文献
1 范小英，戴子林.异羟肟酸的合成方法.广东有色金属学报，1997，7(2):100-105.
2 段文贵，陶元器.甲异羟肟酸与甲羟肟酸互变异构的MNDO的研究.广西大学学报(自然科学版)，1995，20(2):148-151.
3 李祥生，刘蓓，刘光华.稀上-二酰异羟肟酸配合物的合成及应用研究.南昌大学学报(理科版)，2001，25(2):192-196.
4 王示范，李村，谢复新，等.2，2′-(1，4-亚乙二氧基)-二苯甲酰异羟肟酸的谱学研究.华东冶金学报，1998，15(1):74-78.
5 阳华，秦圣英，吕志凤，等.异羟肟酸类氧载体新模型化合物研究.化学研究及应用，1998，10(1):86-88.
, 百拇医药
6 杨频，李青山.芳香异羟肟酸二烃基锡配合物的合成、表征及其抗癌活性的研究.结构化学，1996，15(2):163-169.
7 庞华，张君仁，邵瑞琪，等.苯异羟肟酸类抗肿瘤新药的合成.山东医药工业，1993，12(2):1-2.
8 温汉平.肿瘤细胞体外药敏试验MTT分析法.中华肿瘤杂志，1993，15(6):470.
9 辛华雯.40例胃癌乳腺癌化疗药物敏感性MTT法研究.中国肿瘤临床，1994，21(9):699.
作者单位:150040哈尔滨医科大学第三临床医学院
(编辑秋 实), 百拇医药(娄)
异羟肟酸也称氧肟酸，具有两种互变异构体，即异羟肟酸和羟肟酸，并且以异羟肟酸为主要成分。异羟肟酸结构式为R-CO-NHOH，是一种有机螯合剂，能与Cu 2+ 、Zn 2+ 、Co 2+ 、Ni 2+ 、Fe 3+ 离子形成稳定的金属螯合物 [1] 。
由于其特殊的结构和功能，异羟肟酸已成为化学和生物学的一类重要化合物，他们具有广泛的生物活性，并存在若干天然药用化合物中，因而日益引起药物化学家和生物化学家的关注 [2] ，其显著的络合能力不仅使之构成现代冶金学上广泛使用的一大类浮选剂，而且在新药物的研制方面存在着可喜的应用前景，是值得深入研究和开发的一类新药。
, 百拇医药 60年代以来，在异羟肟酸及其盐类用作选矿中的浮选剂方面，科学工作者进行了大量的研究，也取得了很好的成果 [3～5] ，但是有关异羟肟酸及其衍生物的生物活性方面的研究是近几年才刚刚开始的。有关文献报导了一些异羟肟酸的生理活性，特别是报导了其具有抗癌作用 [6，7] ，但是这 些异羟肟酸均是大分子化合物，合成非常困难，又难以工业化。本文合成了五种小分子的苯异羟肟酸，并进行了体内、体外的抗肿瘤作用的研究，取得了很好的效果。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器 付里叶变换红外光谱仪(美国PE-spectrum One B)，高效液相色谱仪(日本岛津LC-10A)，气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent6890N/5973N)，熔点测定仪(X4北京第三光学仪器厂)，元素分析仪(美国PE-2400)，核磁共振波谱仪(德国布鲁克400兆)，电磁搅拌器，恒温水浴，常用玻璃仪器。
, 百拇医药
1.1.2 试剂 取代的苯甲酸乙酯(自己合成)，苯(AR，天津化学试剂厂)，NaOH(AR天津化学试剂厂)，Na 2 CO 3 (AR，天津化学试剂厂)，乙醚(AR，天津化学试剂厂)，乙烷(AR，天津化学试剂厂)，盐酸羟胺(AR，北京化工厂)，浓H 2 SO 4 (AR，哈尔滨市化工试剂厂)，NaCl(AR，哈尔滨市化工试剂厂)，乙醇(AR，哈尔滨市化工试剂厂)。
1.2 苯异羟肟酸类化合物的合成 [7] 见分子式。
1.2.1 乙酯的制备 取不同取代基团的苯甲酸各0.2mol，溶于100ml乙醇中，加入10g催化剂和10ml带水剂，回流4～8h(不同原料回流时间不同)，减压蒸馏除去溶剂，得到黄色溶液，用Na 2 CO 3 调pH至碱性，再用己烷萃取，蒸去己烷得乙酯的粗产品，若产品为液体，将粗产品减压蒸馏，收集所需要的馏分，得纯品;若产品是固体，通过过滤、水洗得到纯品。产品用GC/MS分析，确定是我们所需要的化合物纯度为99%，产率为85%。
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1.2.2 苯异羟肟酸的制备 将20gNaOH溶于50ml30%乙醇中，将0.2mol的盐酸羟胺溶于50ml30%乙醇中，再将两者混合搅拌2h，使NaOH与盐酸羟胺完全反应，然后冷却至0℃，过滤，在滤液中加入0.1mol乙酯，50℃下放置4h，用稀H 2 SO 4 调至pH为6.0，有浅粉红色固体析出，过滤得粗产品，用水-乙醇重结晶得纯品，产率为80%，产品经高效液相色谱分析，得纯度为99.2%，通过熔点测定仪、付里叶变换红外光谱仪、核磁共振波谱仪、元素分析仪的分析，确定了五种化合物的结构。
2 MTT实验
将所合成的化合物用生理盐水配成母液，-20℃冰箱保存备用，每种化合物均设0.1、1.0、10×PPC三个浓度，临用前配制。将肿瘤细胞浓度调为10 4 ～10 5 个/ml，并置于96孔平底培养板中(100ml/孔)，加入不同浓度的化合物10μl/孔，每个浓度设3个平行孔，对照孔不加药。震荡10min后，置37℃，5%湿化CO 2 培养箱中培养3天，加入MTT(5mg/ml)20μl/孔，继续培养4h，用快速翻板法 [8] 去除培养液及药液，加入DMSO100μl/孔，震荡10min，用酶标仪测OD值(λ490nm)，计算抑制率。
, http://www.100md.com
抑制率=(1-对照孔平均吸收加药孔平均吸收)×100%，当抑制率≥50%时，判断该药敏感。
3 结果
(1)用一种肿瘤细胞在每孔(0.2～1.1)×10 5 范围内，细胞数与MTT甲月赞化合物的比值正相关，不同肿瘤细胞产生的MTT甲月赞化合物量差异较大。(2)所合成的化合物的体外抑瘤率与细胞种类无关。(3)5种化合物A、B、C、D、E中，其中E的抑瘤率最大，平均达到77.1%(Hela、SGC-7910、8910、8910PM和BGC-823的抑制率的平均值)。化合物B的抑瘤率为最低，平均达到37.8%。
4 讨论
虽然通过MTT法得到了化合物A、B、C、D、E的抑瘤率，但MTT方法本身存在着某些不足 [9] ，因此，还需要其它实验来证实其抑瘤率。
, 百拇医药
参考文献
1 范小英，戴子林.异羟肟酸的合成方法.广东有色金属学报，1997，7(2):100-105.
2 段文贵，陶元器.甲异羟肟酸与甲羟肟酸互变异构的MNDO的研究.广西大学学报(自然科学版)，1995，20(2):148-151.
3 李祥生，刘蓓，刘光华.稀上-二酰异羟肟酸配合物的合成及应用研究.南昌大学学报(理科版)，2001，25(2):192-196.
4 王示范，李村，谢复新，等.2，2′-(1，4-亚乙二氧基)-二苯甲酰异羟肟酸的谱学研究.华东冶金学报，1998，15(1):74-78.
5 阳华，秦圣英，吕志凤，等.异羟肟酸类氧载体新模型化合物研究.化学研究及应用，1998，10(1):86-88.
, 百拇医药
6 杨频，李青山.芳香异羟肟酸二烃基锡配合物的合成、表征及其抗癌活性的研究.结构化学，1996，15(2):163-169.
7 庞华，张君仁，邵瑞琪，等.苯异羟肟酸类抗肿瘤新药的合成.山东医药工业，1993，12(2):1-2.
8 温汉平.肿瘤细胞体外药敏试验MTT分析法.中华肿瘤杂志，1993，15(6):470.
9 辛华雯.40例胃癌乳腺癌化疗药物敏感性MTT法研究.中国肿瘤临床，1994，21(9):699.
作者单位:150040哈尔滨医科大学第三临床医学院
(编辑秋 实), 百拇医药(娄)