姜黄素诱导白血病细胞HL 60 凋亡的研究
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中华中西医杂志 2003年10月 第4卷 第19期
【摘要】 目的 研究姜黄素对白血病细胞HL 60 的促凋亡作用。方法 应用MTT法检测姜黄素对细胞的细胞毒作用;流式细胞仪、荧光显微镜观察细胞凋亡。结果 姜黄素明显抑制白血病细胞HL 60 的生长，24h，48h，72h的IC 50 分别为8.79μg/ml、5.21μg/ml、3.92μg/ml，荧光显微镜观察见核浓缩等凋亡特征性改变;Annexin V-FITC/PI双染见AnnexinV-FITC单阳性细胞高达19.64%。结论 姜黄素具有诱导白血病细胞HL 60 凋亡的作用。
关键词 姜黄素 白血病细胞 细胞凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)19-2774-02
Study on apoptosis of leukemia cell line HL 60 induced by curcumin
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HuangJunqiong，Yu Yongli，Sun Wanbang
Zunyi Medical College，Zunyi563003.
【Abstract】 Objective To study on apoptosis of leukemia cell line HL 60 induced by curcumin.Methods The suppression of curcumin on leukemia cell line HL 60 was studied by MTT;the apoptosis was studied by flow cytometric Annexin V/PI dual labeling technique and fluorescence microscope.Results Curcumin suppressed the growth of HL 60 obviously.These IC 50 were8.79μg/ml，5.21μg/ml，3.92μg/ml，for24h，48h，72h respectively.The morphologic characteristics of apoptotic cells were observed in the treated group.Conclusion Curcumin induced HL 60 cell to apoptosis death.
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Key words curcumin HL 60 cell line apoptosis
姜黄素(curcumin，cur)是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚类色素，由于其色泽稳定且毒性低，目前已广泛用于食品添加剂中。它还具有广泛的药理作用，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤等。国内外大量研究表明姜黄素对多种体外培养的肿瘤细胞有生长抑制作用 [1] 。本研究旨在探讨姜黄素对白血病细胞系HL 60 的促凋亡作用，为临床治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 姜黄素，瑞士Alexis公司产品，纯度>99%;溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)，丫啶橙(OA)，RPˉMI1640培养液，美国Amresco公司产品;二甲基亚砜，国产分析纯;小牛血清，购自上海第二医科大学科技中心实验室二室;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒，美国BD公司产品。
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1.2 细胞株 HL 60 细胞购自中国医学科学院血液学研究所，用含体积分数为10%的小牛血清的RPMI1640培养液在37℃、体积分数为5%的CO 2 条件下稳定培养。
1.3 MTT实验 用新配制的1640培养液漂洗细胞1次，并用此培养液将细胞稀释至5×10 4/ml。取96孔板，每孔加入100μl稀释好的细胞和药物，在37℃、体积分数为5%的CO 2 条件下培养，实验终止前4h加入10mg/ml的MTT10μl，同样条件下保温4h。取出后，离心，去上清，每孔加入200μl的二甲基亚砜，混匀，在酶标仪上测570nm吸收值。抑制率(IR)=(1-试验组吸光值/对照组吸光值)×100%。以细 ˇ 基金项目:本课题受贵州省教委基金项目资助(编号:2001044) 胞抑制率为纵坐标，化疗药物浓度的对数为横坐标，绘制剂量效应曲线，求IC 50 (半数细胞抑制剂量)值。
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1.4 荧光显微镜观察细胞凋亡 收集1.25μg/ml姜黄素作用24h的HL 60 细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用1640培养液将细胞配成1×10 7 /ml，取细胞悬液95μl加入10mg/ml丫啶橙5μl，混匀。吸1滴混合液点在洁净玻片上，直接用盖玻片封片。荧光显微镜490nm蓝光下观察。
1.5 流式细胞仪观察细胞凋亡 取对数生长期细胞用含10%的小牛血清的RPMI1640培养液将细胞配成5×10 5 /ml，取24孔板，每孔加入稀释好的细胞1ml，分别按终浓度为0，0.625μg/ml，1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml加入姜黄素。在37℃、体积分数为5%的CO 2 条件下培养24h。收集细胞，1000rpm离心5min，弃上清，冷PBS洗2次，用标记缓冲液将细胞配成1×10 6 /ml，取100μl细胞悬液加入5ml培养管，加入5μl PI、5μl Annexin V-FITC，混匀，室温避光染色15min，再加入标记缓冲液400μl，流式细胞仪分析。
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1.6 统计学处理 实验数据以均数±标准差表示，样本均数之间的比较用方差分析。
2 结果
2.1 姜黄素对HL 60 细胞的细胞毒效应 细胞经姜黄素不同剂量、不同时间作用后，以MTT比色法观察其细胞生长抑制作用，经统计学处理，同一时间不同药物浓度、同一浓度不同时间抑制率的比较经方差分析，任两组之间的比较P<0.05。结果(见表1)表明姜黄素对HL 60 的抑制作用呈时间剂量依赖关系。姜黄素对HL 60 作用24h、48h，72h的IC 50 分别为8.79μg/ml、5.21μg/ml、3.92μg/ml。
表1 姜黄素对HL 60 细胞的细胞毒效应
2.2 荧光显微镜观察细胞凋亡 HL 60 细胞经1.25μg/ml姜黄素作用后，丫啶橙染色，荧光显微镜观察可见出芽、染色质浓缩、核碎裂，凋亡小体形成;对照组细胞DNA呈均匀的黄绿色荧光(见图1)。
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2.3 流式细胞仪测细胞凋亡 0.625μg/ml以上浓度姜黄素处理24h后，相当部分AnnexinV-FITC阳性而PI阴性，说明姜黄素可诱导HL 60 细胞凋亡。随着药物浓度增高，Anˉnex V单阳性细胞先增加后减少，Annexin V-FITC单阳性细胞高达19.64%，而双阳性细胞呈逐渐增加趋势，提示高浓度姜黄素的直接毒性可使HL 60 细胞凋亡(图2)。
图1 姜黄素诱导HL 60 细胞凋亡的形态学改变(丫啶橙染色×400)
图2 Annexin V-FITC/PI双染观察细胞凋亡
3 讨论
肿瘤的发生、发展不仅与细胞增殖有关，亦与细胞调亡有关 [2] 。细胞的凋亡是肿瘤研究的新领域，诱导肿瘤细胞凋亡是目前肿瘤治疗研究的热点。本研究发现姜黄素对白血病细胞HL 60 有显著的生长抑制作用，24h、48h、72h的IC 50 分别为8.72μg/ml、5.35μg/ml、3.99μg/ml，呈时间剂量依赖性，且姜黄素毒性低，沃兴德等 [3] 报道姜黄素经长期毒性实验显示无明显毒副作用，提示其可作为安全、有效的抗癌药用于白血病病人的治疗，具有良好的应用前景。国内外研究显示，姜黄素对肿瘤的抑制作用与其抑制与肿瘤生长相关的多种蛋白激酶的活性有关，姜黄素可抑制蛋白激酶C(PKC) [4] 、酪氨酸蛋白激酶 [5] 的活性，抑制c-jun、c-fos、 c-myc等原癌基因的表达 [6] 。本实验中，荧光显微镜观察见出芽、核浓缩、核碎裂等凋亡特征性改变。流式细胞仪检测发现，0.625μg/ml以上浓度姜黄素处理24h后，相当部分Annexin V-FITC阳性而PI阴性，说明姜黄素可诱导HL 60 细胞凋亡。随着药物浓度增高，Annexin V单阳性细胞先增加后减少，而双阳性细胞呈逐渐增加趋势，提示高浓度姜黄素的直接毒性可使HL60 细胞死亡。
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参考文献
1 Mou TH，You RL，Wei M，et al.Inhibitory effect of dietary curcumin on forestomach，duodenal and colon carcinogenesis in mice.Cancer Res，1994，54:5841-5847.
2 Carson DA，Ribeiro JM.Apoptosis:its singnificance in cancer and cancer therapy.Cancer，1997，73:2013.
3 沃兴德，洪行球，高承贤，等.姜黄素长期毒性试验.浙江中医学院学报，2000，24(1):23-24.
4 Liu JY，Lin SJ，Lin JK.Inhibitory effects of curcumin on protein kinase C activity induced by12-O-tetradecanoyl-phorbol-13-acetate in NIH3T3cells.Carcinogenesis，1993，14(5):857-861.
, 百拇医药
5 Hong RL，Spohn-WH，HungMC.Curcumin inhibits tyrosine kinase acˉtivity of p185neu and also depletes p185neu.Clin Cancer Res，1999，5(7):1884-1891.
6 Kakar SS，Roy D.Curcumin inhibits TPA induced expression c-fos，c-jun and c-myc protooncogenes messenger RNAs in mouse skin.Canˉcer-Lett，1994，87(1):81-89.
作者单位:563003遵义医学院免疫学教研室( 组胚学教研室)
(编辑曲 全), http://www.100md.com(黄俊琼)
关键词 姜黄素 白血病细胞 细胞凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)19-2774-02
Study on apoptosis of leukemia cell line HL 60 induced by curcumin
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HuangJunqiong，Yu Yongli，Sun Wanbang
Zunyi Medical College，Zunyi563003.
【Abstract】 Objective To study on apoptosis of leukemia cell line HL 60 induced by curcumin.Methods The suppression of curcumin on leukemia cell line HL 60 was studied by MTT;the apoptosis was studied by flow cytometric Annexin V/PI dual labeling technique and fluorescence microscope.Results Curcumin suppressed the growth of HL 60 obviously.These IC 50 were8.79μg/ml，5.21μg/ml，3.92μg/ml，for24h，48h，72h respectively.The morphologic characteristics of apoptotic cells were observed in the treated group.Conclusion Curcumin induced HL 60 cell to apoptosis death.
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Key words curcumin HL 60 cell line apoptosis
姜黄素(curcumin，cur)是从姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种酚类色素，由于其色泽稳定且毒性低，目前已广泛用于食品添加剂中。它还具有广泛的药理作用，如抗氧化、抗炎、抗肿瘤等。国内外大量研究表明姜黄素对多种体外培养的肿瘤细胞有生长抑制作用 [1] 。本研究旨在探讨姜黄素对白血病细胞系HL 60 的促凋亡作用，为临床治疗提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 姜黄素，瑞士Alexis公司产品，纯度>99%;溴化二甲噻唑二苯四氮唑(MTT)，丫啶橙(OA)，RPˉMI1640培养液，美国Amresco公司产品;二甲基亚砜，国产分析纯;小牛血清，购自上海第二医科大学科技中心实验室二室;Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒，美国BD公司产品。
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1.2 细胞株 HL 60 细胞购自中国医学科学院血液学研究所，用含体积分数为10%的小牛血清的RPMI1640培养液在37℃、体积分数为5%的CO 2 条件下稳定培养。
1.3 MTT实验 用新配制的1640培养液漂洗细胞1次，并用此培养液将细胞稀释至5×10 4/ml。取96孔板，每孔加入100μl稀释好的细胞和药物，在37℃、体积分数为5%的CO 2 条件下培养，实验终止前4h加入10mg/ml的MTT10μl，同样条件下保温4h。取出后，离心，去上清，每孔加入200μl的二甲基亚砜，混匀，在酶标仪上测570nm吸收值。抑制率(IR)=(1-试验组吸光值/对照组吸光值)×100%。以细 ˇ 基金项目:本课题受贵州省教委基金项目资助(编号:2001044) 胞抑制率为纵坐标，化疗药物浓度的对数为横坐标，绘制剂量效应曲线，求IC 50 (半数细胞抑制剂量)值。
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1.4 荧光显微镜观察细胞凋亡 收集1.25μg/ml姜黄素作用24h的HL 60 细胞，1000rpm离心5min，弃上清，用1640培养液将细胞配成1×10 7 /ml，取细胞悬液95μl加入10mg/ml丫啶橙5μl，混匀。吸1滴混合液点在洁净玻片上，直接用盖玻片封片。荧光显微镜490nm蓝光下观察。
1.5 流式细胞仪观察细胞凋亡 取对数生长期细胞用含10%的小牛血清的RPMI1640培养液将细胞配成5×10 5 /ml，取24孔板，每孔加入稀释好的细胞1ml，分别按终浓度为0，0.625μg/ml，1.25μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml加入姜黄素。在37℃、体积分数为5%的CO 2 条件下培养24h。收集细胞，1000rpm离心5min，弃上清，冷PBS洗2次，用标记缓冲液将细胞配成1×10 6 /ml，取100μl细胞悬液加入5ml培养管，加入5μl PI、5μl Annexin V-FITC，混匀，室温避光染色15min，再加入标记缓冲液400μl，流式细胞仪分析。
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1.6 统计学处理 实验数据以均数±标准差表示，样本均数之间的比较用方差分析。
2 结果
2.1 姜黄素对HL 60 细胞的细胞毒效应 细胞经姜黄素不同剂量、不同时间作用后，以MTT比色法观察其细胞生长抑制作用，经统计学处理，同一时间不同药物浓度、同一浓度不同时间抑制率的比较经方差分析，任两组之间的比较P<0.05。结果(见表1)表明姜黄素对HL 60 的抑制作用呈时间剂量依赖关系。姜黄素对HL 60 作用24h、48h，72h的IC 50 分别为8.79μg/ml、5.21μg/ml、3.92μg/ml。
表1 姜黄素对HL 60 细胞的细胞毒效应
2.2 荧光显微镜观察细胞凋亡 HL 60 细胞经1.25μg/ml姜黄素作用后，丫啶橙染色，荧光显微镜观察可见出芽、染色质浓缩、核碎裂，凋亡小体形成;对照组细胞DNA呈均匀的黄绿色荧光(见图1)。
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2.3 流式细胞仪测细胞凋亡 0.625μg/ml以上浓度姜黄素处理24h后，相当部分AnnexinV-FITC阳性而PI阴性，说明姜黄素可诱导HL 60 细胞凋亡。随着药物浓度增高，Anˉnex V单阳性细胞先增加后减少，Annexin V-FITC单阳性细胞高达19.64%，而双阳性细胞呈逐渐增加趋势，提示高浓度姜黄素的直接毒性可使HL 60 细胞凋亡(图2)。
图1 姜黄素诱导HL 60 细胞凋亡的形态学改变(丫啶橙染色×400)
图2 Annexin V-FITC/PI双染观察细胞凋亡
3 讨论
肿瘤的发生、发展不仅与细胞增殖有关，亦与细胞调亡有关 [2] 。细胞的凋亡是肿瘤研究的新领域，诱导肿瘤细胞凋亡是目前肿瘤治疗研究的热点。本研究发现姜黄素对白血病细胞HL 60 有显著的生长抑制作用，24h、48h、72h的IC 50 分别为8.72μg/ml、5.35μg/ml、3.99μg/ml，呈时间剂量依赖性，且姜黄素毒性低，沃兴德等 [3] 报道姜黄素经长期毒性实验显示无明显毒副作用，提示其可作为安全、有效的抗癌药用于白血病病人的治疗，具有良好的应用前景。国内外研究显示，姜黄素对肿瘤的抑制作用与其抑制与肿瘤生长相关的多种蛋白激酶的活性有关，姜黄素可抑制蛋白激酶C(PKC) [4] 、酪氨酸蛋白激酶 [5] 的活性，抑制c-jun、c-fos、 c-myc等原癌基因的表达 [6] 。本实验中，荧光显微镜观察见出芽、核浓缩、核碎裂等凋亡特征性改变。流式细胞仪检测发现，0.625μg/ml以上浓度姜黄素处理24h后，相当部分Annexin V-FITC阳性而PI阴性，说明姜黄素可诱导HL 60 细胞凋亡。随着药物浓度增高，Annexin V单阳性细胞先增加后减少，而双阳性细胞呈逐渐增加趋势，提示高浓度姜黄素的直接毒性可使HL60 细胞死亡。
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参考文献
1 Mou TH，You RL，Wei M，et al.Inhibitory effect of dietary curcumin on forestomach，duodenal and colon carcinogenesis in mice.Cancer Res，1994，54:5841-5847.
2 Carson DA，Ribeiro JM.Apoptosis:its singnificance in cancer and cancer therapy.Cancer，1997，73:2013.
3 沃兴德，洪行球，高承贤，等.姜黄素长期毒性试验.浙江中医学院学报，2000，24(1):23-24.
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5 Hong RL，Spohn-WH，HungMC.Curcumin inhibits tyrosine kinase acˉtivity of p185neu and also depletes p185neu.Clin Cancer Res，1999，5(7):1884-1891.
6 Kakar SS，Roy D.Curcumin inhibits TPA induced expression c-fos，c-jun and c-myc protooncogenes messenger RNAs in mouse skin.Canˉcer-Lett，1994，87(1):81-89.
作者单位:563003遵义医学院免疫学教研室( 组胚学教研室)
(编辑曲 全), http://www.100md.com(黄俊琼)