环氧化酶-2抑制剂尼美舒利对肝纤维化大鼠肝星状细胞活化的影响
【摘要】 目的 观察选择性环氧合酶抑制剂-2尼美舒利(Nimesulide)对肝纤维化大鼠肝星状细胞活化的影响。方法 用四氯化碳诱导形成大鼠肝纤维化模型，同时用尼美舒利(Nimesulide)对造模大鼠进行治疗，观察各组病理组织纤维化评分与分级、α-SMA免疫组化染色阳性表达面积的变化。结果 治疗组中纤维化程度均低于模型组，α-SMA免疫组化染色阳性表达面积低于模型组，但差异无显著性。结论 尼美舒利(Nimesulide)对大鼠肝纤维化有较好疗效，对肝星状细胞活化的抑制作用不明显。
关键词 肝纤维化 环氧合酶抑制剂 四氯化碳 尼美舒利
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)02-0100-02
The influence of selective cyclooxygenase-2inhibitor on hepatic
, http://www.100md.com
stellate cells’activity in rat fibrosis model
Zhou Xiaoyan，Yang Xuefeng
The Central Hospital of Hengyang，Hunan421001.
【Abstract】 Objective To evalue the influence of nimesulide on hepatic stellate cell’s activity in rat fibrosis model.Methods liver fibrosis was successfully induced in20rats by subcutaneous injection of carbon tetrachloride(CCl 4 ).Each of the two model groups was divided into1)Fibrotic model group;2)nimesulide treatment group.Another group of5rats without any treatment was used as normal control.At the end of the experiment，semi-quantitative histopathological scores of fibrosis(SSS)，level of liverα-smooth muscle actine(α-SMA)expression were compared.Results Compared with those in fibrotic models by CCl 4 ，the histopathological fibrosis score was significantly lower in rats treated with nimesulide，level of liverα-smooth muscle actine(α-SMA)expression was lower in rats treated with nimesulide，but no significant difference in the two model groups.Conclusion Nimesulide is effective in treating rat liver fibrosis induced by CCl 4 ，that is to say，the selective cyclooxygenase-2inhibitor has curative effects of antifibroˉsis，but has no obvious inhibitory effect on the activity of hepatic stellate cells.
, 百拇医药
Key words heptofibrosis cyelooxygenase inhibitor CCl 4 nimesulide
环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是一种诱导酶，在细胞外网状结构和细胞核边缘起作用，一般情况下在大部分正常组织无表达，而在受到炎性介质、细胞因子、内毒素、致癌因素等作用，有大量COX-2被诱导表达 [1，2] ，通过催化前列腺素(PGs)和其他花生四烯酸(AA)代谢产物的生物合成参与炎症反应。在Nanji等 [3～5] 对酒精性肝纤维化的治疗研究中发现，COX-2的表达与肝内炎症有关。但COX-2抑制剂能否减轻慢性肝病患者肝内炎症，延缓肝纤维化的发生、发展未见报道。本实验应用选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂尼美舒利(Nimesulide NS)，观察其在大鼠肝纤维化中的作用及对肝星状细胞活化的影响。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 材料及药物 尼美舒利(Nimesulide)胶囊，安徽四通生物医药有限公司产品(国药准字X19990081)，批号:020121，0.1g×10/盒。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)多克隆抗体及SABC试剂盒均为武汉博士德生物工程有限公司产品。
1.2 肝纤维化模型制备与实验分组 SD雄性大鼠25只，6周龄，体重100～180g，由中南大学湘雅医学院动物部提供。动物正常喂养1周后，按体重随机分为正常组、模型组、治疗组共3组，正常组5只，其他3组各10只，每笼5～8只，饲以高效价颗粒饲料，自由饮水。按翁红雷等法 [6] 模型组给予40%CCl 4 油剂，0.3ml/100g体重皮下注射，每周两次;Nimesulide治疗组除给予同剂量40%CCl 4 外，同时灌胃口服选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂尼美舒利(Nimeˉsulide)，6mg/(kg·d) [7] ，每日1次;正常组给予同样剂量蓖麻油同样处理，共8周，所有动物均于造模后8周末处死，称量体重及肝重量，取血，取肝脏。
, 百拇医药
1.3 检测方法
1.3.1 肝脏组织病理学检测 肝脏石蜡切片做HE染色及VG胶原染色并光镜下观察(结果请病理学教授双盲观察)。胶原染色结果采用1994年法国Chelvallier的半定量记分方法(SSS)记分 [8，9] ，并按2000年西安会议纤维化分级分期标准进行肝内炎症活动度分级、纤维化分期。
1.3.2 α-SMA免疫组化染色 肝脏石蜡切片烤片后常规脱蜡至水，α-SMA免疫组化染色采用SABC方法，操作按使用说明进行。阴性对照片以双蒸水替代一抗。阳性反应结果采用PIPS-2020病理图文分析系统分析，每张切片选定四周及中央五个区域，均取该区阳性反应最多的视野，40倍物镜下测定阳性反应面积百分率(阳性面积/单位视野面积×100%)，取其平均值。
1.4 统计方法 用SPSS10.0统计软件对统计数据进行方差分析，Least-significant difference(LSD)法进行两两比较。
, http://www.100md.com
2 结果
与同期正常鼠比较，模型组、治疗组体重均明显降低(P<0.01);肝质量与鼠体重比值在整个实验过程均无明显差异。
2.1 病理组织形态学变化 模型组中央静脉管壁明显增厚，汇管区内纤维化明显，胆管重度增生，肝细胞广泛脂肪变性，灶性坏死，肝细胞被重新分隔成小结节状，大小不一，正常肝小叶结构破坏;胶原纤维VG染色汇管区纤维化扩大并伴有纤维间隔形成，小叶中央静脉显著环形增厚，有较多纤维向临近肝细胞伸展，窦周可见较广泛纤维化，有较厚纤维间隔形成，并结节状改变。治疗组中央静脉扩张，汇管区内胆管增生，纤维增生，肝细胞广泛中央性脂肪变性，灶性坏死，肝板完整，未见碎屑坏死，肝小叶结构存在;VG染色汇管区纤维化扩大，小叶内中央静脉增厚，管壁呈环形汇管区纤维化扩大，均可见细的不完整纤维间隔形成。窦周可见轻度局限纤维化，肝小叶内可见细而不完整的纤维间隔形成。正常组肝脏组织中央静脉无完整管壁，汇管区无扩大，胆管周围可见少许淋巴细胞，肝细胞放射状排列于中央静脉周围，肝小叶完整，VG染色汇管区的血管壁、胆管周围少量薄层纤维，中央静脉周围几乎不见。SSS评分以及纤维化程度分期标准结果见表1。(略)
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2.2 α-SMA免疫组化染色 模型组、治疗组可见α-SMA阳性反应呈棕黄色，主要见于肝细胞间的肝窦内被活化的星状细胞胞质，显示肝星状细胞活化突起延长并相连，正常组未见α-SMA免疫组织化学染色，治疗组阳性反应面积小于模型组，但无统计学差异(P>0.05)。见图1～3。(略)
3 讨论
本研究在肝纤维化造模同时应用选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂Nimesulide(NS)，旨在观察Nimesulide对大鼠肝纤维化作用。
经CCl 4 刺激，模型组、NS治疗组肝组织胶原纤维均增生，但NS治疗组增生程度明显低于模型组，说明NS能够在一定程度上减轻肝脏纤维化。治疗组肝星状细胞活化指标α-SMA阳性反应面积与模型组一样明显增加，之间无差异，提示NS对肝星状细胞的活化并不存在明显抑制作用。以上提示选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂Nimeˉ sulide在抗肝纤维化治疗，延缓纤维化发展方面有一定价值。
, http://www.100md.com
目前有关纤维化的形成可分为4个续贯发生而又部分重叠的阶段:炎性反应和星状细胞(HSC)的激活;局部ECM的改变;损伤部位星状细胞的增殖和迁移;纤维化组织的收缩。本实验观察了活化肝星状细胞的特异性标志α-SMA的表达，发现Nimesulide对肝星状细胞活化的抑制作用不明显，这与国外有关报道不太一致 [10] 。选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂Nimesulide为非甾体类抗炎药，具有明确的抗炎作用，本实验观察到NS治疗组肝内炎症程度明显轻于模型组，其抗纤维化作用①可能与其抑制或减轻肝内持续性慢性炎症，从而阻断或减轻主动性肝纤维化的发展与形成有关;②可能调节机体免疫，抑制某些促纤维生长因子，或促进某些抑纤维生长因子的释放，从而减少纤维组织的生成。目前对于选择性/特异性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂抗纤维化的机制尚不明确，有待进一步研究探讨;是否与其他抗纤维化药物合用，不同角度，多方位更全面抗纤维化治疗取得更好疗效等问题值得进一步探讨研究。
参考文献
, 百拇医药
1 Eberhart CE，Dubois RN.Eicosanoids and the gastrointestinal tract.Gasˉtroenterology，1995，109:285-301.
2 邱德凯，马雄，彭延申，等.原发性肝细胞癌及癌旁组织中环氧合酶-2的表达及其意义.中华消化杂志，2001，21(3):142-144.
3 Nanji AA，Miao LL，Thomas P，et al.Enhanced cyclooxygenase-2gene express in alcoholic liver disease in the rat.Gastroenterology，1997，112:943-951.
4 Nanji AA，Jokelainen K，Lau GK，et al.Arginine reverses ethanol-inˉduced inflammatory and fibrotic changes in liver despite continued ethanol administration.J Pharmacol Exp Ther，2001，299(3):832-839.
, http://www.100md.com
5 Nanji AA，Jokelainen K，Tipoe GL，et al.Dietary saturated fatty acids reverse inflammatory and fibrotic changes in rat liver despite continued enthanol administration.Jpharmacol Exp Ther，2001，299(2):638-644.
6 翁红雷，蔡卫民，汪国运，等.不同剂量γ-干扰素治疗大鼠肝纤维化疗效研究.中华传染病杂志，2001，10(5):285-288.
7 徐美虹，吴开春，吴汉平，等.非甾体类抗炎药对胃癌细胞增殖的抑制作用.中华消化杂志，2002，21(4):199.
8 何云，王建宾，王宇明.慢性肝炎纤维化程度诊断方法的进展.世界华人消化杂志，2001，9(11):1305-1309.
, 百拇医药
9 Chevallier M，Guerret S，Chossegros P，et al.A histological semi quantiˉtative scoring system for evaluation of hepatic in needle liver biopsy specimens:comprason with morphometric studies.Hepatology，1994，20:349-355.
10 Galloisc C，Habib A，Tao J，et al.Role of NF-KB in the antiproliferaˉtive effect of endothelin-1and tumor necrosis factor-αin human hepatic stellate cells.Involvment of cyclooxygenase-2.J Biol Chem，1998，273:23183-23190.
作者单位:421001湖南省衡阳中心医院
南华大学附属第二医院
(收稿日期:2003-08-16)
(编辑晓 亮), http://www.100md.com(周筱艳 阳学风)
关键词 肝纤维化 环氧合酶抑制剂 四氯化碳 尼美舒利
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)02-0100-02
The influence of selective cyclooxygenase-2inhibitor on hepatic
, http://www.100md.com
stellate cells’activity in rat fibrosis model
Zhou Xiaoyan，Yang Xuefeng
The Central Hospital of Hengyang，Hunan421001.
【Abstract】 Objective To evalue the influence of nimesulide on hepatic stellate cell’s activity in rat fibrosis model.Methods liver fibrosis was successfully induced in20rats by subcutaneous injection of carbon tetrachloride(CCl 4 ).Each of the two model groups was divided into1)Fibrotic model group;2)nimesulide treatment group.Another group of5rats without any treatment was used as normal control.At the end of the experiment，semi-quantitative histopathological scores of fibrosis(SSS)，level of liverα-smooth muscle actine(α-SMA)expression were compared.Results Compared with those in fibrotic models by CCl 4 ，the histopathological fibrosis score was significantly lower in rats treated with nimesulide，level of liverα-smooth muscle actine(α-SMA)expression was lower in rats treated with nimesulide，but no significant difference in the two model groups.Conclusion Nimesulide is effective in treating rat liver fibrosis induced by CCl 4 ，that is to say，the selective cyclooxygenase-2inhibitor has curative effects of antifibroˉsis，but has no obvious inhibitory effect on the activity of hepatic stellate cells.
, 百拇医药
Key words heptofibrosis cyelooxygenase inhibitor CCl 4 nimesulide
环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)是一种诱导酶，在细胞外网状结构和细胞核边缘起作用，一般情况下在大部分正常组织无表达，而在受到炎性介质、细胞因子、内毒素、致癌因素等作用，有大量COX-2被诱导表达 [1，2] ，通过催化前列腺素(PGs)和其他花生四烯酸(AA)代谢产物的生物合成参与炎症反应。在Nanji等 [3～5] 对酒精性肝纤维化的治疗研究中发现，COX-2的表达与肝内炎症有关。但COX-2抑制剂能否减轻慢性肝病患者肝内炎症，延缓肝纤维化的发生、发展未见报道。本实验应用选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂尼美舒利(Nimesulide NS)，观察其在大鼠肝纤维化中的作用及对肝星状细胞活化的影响。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 材料及药物 尼美舒利(Nimesulide)胶囊，安徽四通生物医药有限公司产品(国药准字X19990081)，批号:020121，0.1g×10/盒。α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)多克隆抗体及SABC试剂盒均为武汉博士德生物工程有限公司产品。
1.2 肝纤维化模型制备与实验分组 SD雄性大鼠25只，6周龄，体重100～180g，由中南大学湘雅医学院动物部提供。动物正常喂养1周后，按体重随机分为正常组、模型组、治疗组共3组，正常组5只，其他3组各10只，每笼5～8只，饲以高效价颗粒饲料，自由饮水。按翁红雷等法 [6] 模型组给予40%CCl 4 油剂，0.3ml/100g体重皮下注射，每周两次;Nimesulide治疗组除给予同剂量40%CCl 4 外，同时灌胃口服选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂尼美舒利(Nimeˉsulide)，6mg/(kg·d) [7] ，每日1次;正常组给予同样剂量蓖麻油同样处理，共8周，所有动物均于造模后8周末处死，称量体重及肝重量，取血，取肝脏。
, 百拇医药
1.3 检测方法
1.3.1 肝脏组织病理学检测 肝脏石蜡切片做HE染色及VG胶原染色并光镜下观察(结果请病理学教授双盲观察)。胶原染色结果采用1994年法国Chelvallier的半定量记分方法(SSS)记分 [8，9] ，并按2000年西安会议纤维化分级分期标准进行肝内炎症活动度分级、纤维化分期。
1.3.2 α-SMA免疫组化染色 肝脏石蜡切片烤片后常规脱蜡至水，α-SMA免疫组化染色采用SABC方法，操作按使用说明进行。阴性对照片以双蒸水替代一抗。阳性反应结果采用PIPS-2020病理图文分析系统分析，每张切片选定四周及中央五个区域，均取该区阳性反应最多的视野，40倍物镜下测定阳性反应面积百分率(阳性面积/单位视野面积×100%)，取其平均值。
1.4 统计方法 用SPSS10.0统计软件对统计数据进行方差分析，Least-significant difference(LSD)法进行两两比较。
, http://www.100md.com
2 结果
与同期正常鼠比较，模型组、治疗组体重均明显降低(P<0.01);肝质量与鼠体重比值在整个实验过程均无明显差异。
2.1 病理组织形态学变化 模型组中央静脉管壁明显增厚，汇管区内纤维化明显，胆管重度增生，肝细胞广泛脂肪变性，灶性坏死，肝细胞被重新分隔成小结节状，大小不一，正常肝小叶结构破坏;胶原纤维VG染色汇管区纤维化扩大并伴有纤维间隔形成，小叶中央静脉显著环形增厚，有较多纤维向临近肝细胞伸展，窦周可见较广泛纤维化，有较厚纤维间隔形成，并结节状改变。治疗组中央静脉扩张，汇管区内胆管增生，纤维增生，肝细胞广泛中央性脂肪变性，灶性坏死，肝板完整，未见碎屑坏死，肝小叶结构存在;VG染色汇管区纤维化扩大，小叶内中央静脉增厚，管壁呈环形汇管区纤维化扩大，均可见细的不完整纤维间隔形成。窦周可见轻度局限纤维化，肝小叶内可见细而不完整的纤维间隔形成。正常组肝脏组织中央静脉无完整管壁，汇管区无扩大，胆管周围可见少许淋巴细胞，肝细胞放射状排列于中央静脉周围，肝小叶完整，VG染色汇管区的血管壁、胆管周围少量薄层纤维，中央静脉周围几乎不见。SSS评分以及纤维化程度分期标准结果见表1。(略)
, http://www.100md.com
2.2 α-SMA免疫组化染色 模型组、治疗组可见α-SMA阳性反应呈棕黄色，主要见于肝细胞间的肝窦内被活化的星状细胞胞质，显示肝星状细胞活化突起延长并相连，正常组未见α-SMA免疫组织化学染色，治疗组阳性反应面积小于模型组，但无统计学差异(P>0.05)。见图1～3。(略)
3 讨论
本研究在肝纤维化造模同时应用选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂Nimesulide(NS)，旨在观察Nimesulide对大鼠肝纤维化作用。
经CCl 4 刺激，模型组、NS治疗组肝组织胶原纤维均增生，但NS治疗组增生程度明显低于模型组，说明NS能够在一定程度上减轻肝脏纤维化。治疗组肝星状细胞活化指标α-SMA阳性反应面积与模型组一样明显增加，之间无差异，提示NS对肝星状细胞的活化并不存在明显抑制作用。以上提示选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂Nimeˉ sulide在抗肝纤维化治疗，延缓纤维化发展方面有一定价值。
, http://www.100md.com
目前有关纤维化的形成可分为4个续贯发生而又部分重叠的阶段:炎性反应和星状细胞(HSC)的激活;局部ECM的改变;损伤部位星状细胞的增殖和迁移;纤维化组织的收缩。本实验观察了活化肝星状细胞的特异性标志α-SMA的表达，发现Nimesulide对肝星状细胞活化的抑制作用不明显，这与国外有关报道不太一致 [10] 。选择性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂Nimesulide为非甾体类抗炎药，具有明确的抗炎作用，本实验观察到NS治疗组肝内炎症程度明显轻于模型组，其抗纤维化作用①可能与其抑制或减轻肝内持续性慢性炎症，从而阻断或减轻主动性肝纤维化的发展与形成有关;②可能调节机体免疫，抑制某些促纤维生长因子，或促进某些抑纤维生长因子的释放，从而减少纤维组织的生成。目前对于选择性/特异性环氧化酶-2(COX-2)抑制剂抗纤维化的机制尚不明确，有待进一步研究探讨;是否与其他抗纤维化药物合用，不同角度，多方位更全面抗纤维化治疗取得更好疗效等问题值得进一步探讨研究。
参考文献
, 百拇医药
1 Eberhart CE，Dubois RN.Eicosanoids and the gastrointestinal tract.Gasˉtroenterology，1995，109:285-301.
2 邱德凯，马雄，彭延申，等.原发性肝细胞癌及癌旁组织中环氧合酶-2的表达及其意义.中华消化杂志，2001，21(3):142-144.
3 Nanji AA，Miao LL，Thomas P，et al.Enhanced cyclooxygenase-2gene express in alcoholic liver disease in the rat.Gastroenterology，1997，112:943-951.
4 Nanji AA，Jokelainen K，Lau GK，et al.Arginine reverses ethanol-inˉduced inflammatory and fibrotic changes in liver despite continued ethanol administration.J Pharmacol Exp Ther，2001，299(3):832-839.
, http://www.100md.com
5 Nanji AA，Jokelainen K，Tipoe GL，et al.Dietary saturated fatty acids reverse inflammatory and fibrotic changes in rat liver despite continued enthanol administration.Jpharmacol Exp Ther，2001，299(2):638-644.
6 翁红雷，蔡卫民，汪国运，等.不同剂量γ-干扰素治疗大鼠肝纤维化疗效研究.中华传染病杂志，2001，10(5):285-288.
7 徐美虹，吴开春，吴汉平，等.非甾体类抗炎药对胃癌细胞增殖的抑制作用.中华消化杂志，2002，21(4):199.
8 何云，王建宾，王宇明.慢性肝炎纤维化程度诊断方法的进展.世界华人消化杂志，2001，9(11):1305-1309.
, 百拇医药
9 Chevallier M，Guerret S，Chossegros P，et al.A histological semi quantiˉtative scoring system for evaluation of hepatic in needle liver biopsy specimens:comprason with morphometric studies.Hepatology，1994，20:349-355.
10 Galloisc C，Habib A，Tao J，et al.Role of NF-KB in the antiproliferaˉtive effect of endothelin-1and tumor necrosis factor-αin human hepatic stellate cells.Involvment of cyclooxygenase-2.J Biol Chem，1998，273:23183-23190.
作者单位:421001湖南省衡阳中心医院
南华大学附属第二医院
(收稿日期:2003-08-16)
(编辑晓 亮), http://www.100md.com(周筱艳 阳学风)