经伴放线放线杆菌刺激后CXCR4和CCR5在巨噬细胞中的表达研究
【摘要】 目的 了解经伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans，Aa)刺激后，巨噬细胞表达趋化因子受体CXCR4和CCR5的情况。方法 将Aa和巨噬细胞共同培养，利用β-actin作为内参照，半定量逆转录PCR(RT-PCR)法，测定在不同时间点，巨噬细胞表达CXCR4和CCR5的mRNA的相对量。结果 共同培养18h后，巨噬细胞中CXCR4的mRNA表达量明显降低(P<0.01)，共同培养36h后，巨噬细胞中CCR5的mRNA表达量升高(P<0.01)。结论CXCR4和CCR5参与了青少年牙周炎的免疫反应;感染青少年牙周炎的患者是否易感艾滋病还有待研究。
关键词 趋化因子受体 青少年牙周炎 半定量逆转录PCR 伴放线放线杆菌
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2004)03-0196-02
Study on the expression of chemokines’receptors in macrophage
, 百拇医药
stimulated by actinobacillus actinomycetemcomitans
Qian Long，Wu Chunlan，Qu Yuehong，et al.
Department of Stomatology，Baogang Hospital，Shanghai Second Medical University，Shanghai200019.
【Abstract】 Objective To assay the expression of several chemokines’receptors-CXCR4and CCR5in macrophage stimulated by actinobacillus actinomycetemcomitans(NCTC，Y4).Methods Actinobacillus actinoˉmycetemcomitans and macrophage were co-cultured for several hours，then assayed the quantities of each chemokine receptors’mRNA expressed in macrophage by semi-quantify RT-PCR technique withβ-actin as the reference standard.Results Co-cultured18hours later，the mRNA quantities of CXCR4expressed in macrophage decreased(P<0.01);and36hours later，the mRNA quantities of CCR5expressed in macrophage increased(P<0.01).Conˉclusion It was possible that CXCR4and CCR5were involved in the immune reaction of juvenile periodontitis and whether the patients suffered from juvenile periodontitis have more chances to be infected by HIV(human immunodefiˉciency virus)needs further study.
, 百拇医药
Key words chemokin receptors juvenile periodontitis semi-quantify RT-PCR actinobacllus actinoˉmycetemcomitans
大量研究发现感染某些疾病如结核病 [1～5] 的患者易感艾滋病。牙周病与艾滋病之间有一定的关系，牙周病可能是艾滋病并发症;牙周病患者是否易感艾滋病还没有明确结论。趋化因子受体CXCR4和CCR5是HIV感染侵入宿主细胞的主要辅助受体，本实验通过检验CCR5和CXCR4在伴放线放线杆菌感染的巨噬细胞中的表达情况，探讨牙周病与艾滋病易感性之间的关系。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器 巨噬细胞株小鼠U937株，购自中科院细胞生化研究所。伴放线放线杆菌Y4菌株，由上海市第九人民医院口研所惠赠。RPMI1640培养基(Gibco，USA)，BHI培养基(Oxozid，England)，胎牛血清(Hyclone，USA)，引物(由赛百胜公司合成)，RNA抽提试剂盒(华舜公司)，cDNA第一链合成试剂盒(申能博彩公司)，Gis-1000凝胶成像系统(Tanon，USA)。
, 百拇医药
1.2 分别培养U937细胞和伴放线放线杆菌Y4菌株 将U937巨噬细胞加入含有10%胎牛血清和青链霉素的RPˉMI1640培养液中，放入CO 2 培养箱中，在5%CO 2 、37℃恒温条件下培养。将伴放线放线杆菌Y4菌株接种到含有氯化血红素、维生素K 1 和脱纤维羊血的BHI固体培养基中，置于厌氧盒中，在37℃下厌氧培养;待其长成多个菌落时，挑单一菌落到不加脱纤维羊血的BHI液体培养基中，厌氧条件下增菌培养。
1.3 U937细胞与伴放线放线杆菌Y4菌株的共同培养 当U937细胞生长到指数生长期，1500r/min10min离心收集细胞，用不含抗生素和小牛血清的RPMI1640液重悬，调整浓度为1×105 个/ml，按每孔0.5ml加入24孔细胞培养板中;伴放线放线杆菌Y4菌株培养到指数生长期，1500r/min10min离心收集细菌，用不加脱纤维羊血的BHI液体培养基重悬，麦氏管检测调整浓度为5×10 8 个/ml，用不含抗生素和小牛血清的RPMI1640液再稀释100倍，然后按100μl/孔加入到已加有U937的24孔细胞培养板中，攻击比率1细胞/10细菌，共同培养1、6、12、18、24、36h。以培养1h组为阴性对照组，其余组为实验组。
, 百拇医药
1.4 巨噬细胞U937总RNA的抽提 到预定的各个时间点随机收集一孔细菌和细胞的混合物，1500r/min10min离心，得沉淀物即为培养后的细胞和细菌量。用PBS缓冲液重悬沉淀，用RNA抽提试剂盒抽提U937细胞内的总RNA。
1.5 用半定量RT-PCR法得cDNA 用逆转录试剂盒对上述RNA进行逆转录得cDNA，各个时间点以对应的cDNA为模板，用CXCR4和CCR5特异的引物进行PCR扩增，同时扩增β-actin作为内参照。进行DNA电泳，比较β-actin与CXCR4和CCR5的相对含量，每一时间点的样品中对每个趋化因子受体重复定量3次。其中CXCR4引物序列为:上游引物5’-TCCTGCCCACCATCTACTCCATCAT-3’，下游引物5’-AGACGCCCACATAGACCACCTTTTCAG-3’，CCR5引物序列:上游引物5’-CTGGCCATCTCTˉGACCTGTTTTTCCTCC-3’，下游引物5’-CAGCCCTGTGCˉCTCTTCTTCTCATTTC-3’，β-actin引物序列:上游引物5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’，下游引物5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’。
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1.6 分析CXCR4和CCR5的相对量 凝胶成像系统扫描各趋化因子受体的cDNA电泳条带，通过软件分析得出条带的强度与净面积;并计算各条带的辉度，条带辉度计算公式为:条带强度×条带净面积;CXCR4和CCR5的mRNA相对表达量的计算公式为:各趋化因子受体电泳条带辉度/同一时间点的β-actin电泳条带辉度;应用NOSA软件中的单因素方差分析法统计数据。
2 结果
CXCR4和CCR5的相对表达量。在放线放线杆菌Y4菌株与U937细胞共同培养6h、12h时，U937细胞体内表达CXCR4的相对量与阴性对照组(1h组)无统计学差异，18h、24h和36h组CXCR4的相对量明显低于阴性对照组(P<0.01)。在放线放线杆菌Y4菌株与U937细胞共同培养6h、12h、18h和24h时，U937胞体内表达CCR5的相对量与阴性对照组(1h组)无统计学意义，36h组CCR5的相对量明显高于阴性对照组(P<0.01)。
, 百拇医药
表1 CXCR4和CCR5的mRNA在不同培养时间的表达相对量 (X±s)
3 讨论
目前公认伴放线放线杆菌是青少年牙周炎的优势致病菌，其感染牙周组织引起宿主产生的免疫反应目前还不十分清楚。趋化因子受体主要参与免疫监视、先天性和过继性的免疫应答以及各种形式的病理性炎症，另外，趋化因子受体CXCR4和CCR5还是HIV感染侵入宿主细胞的主要辅助受体。趋化因子和趋化因子受体在牙周病的发生发展过程中起重要作用。在牙周炎进展期患者的牙龈中MIP1-alpha(macrophage inflammatory proteins-1alpha)和干扰素诱生蛋白10(IP-10)以及各自的受体CCR5和CXCR4的表达量明显提高 [6] 。Taubman MA等发现CCR5在病变的牙龈组织中有显著的表达;其配体RANTES(Regulated on activation normalT Cell expressed and seceted)，MIPI-alpha在感染的牙固组织 中也有高表达 [7] 。Gamonal J等发现CCRS在成人牙周炎患者的牙龈中检测到表达;ELISA法在牙周炎患者的龈沟液中检测到IL-8和RANTES，在健康人的龈沟液中IL-8量比较低;经牙周病治疗后，龈沟液中浸润细胞、IL-8和RANTES量降低;提示趋化因子以及其受体的表达可能反应淋巴细胞亚群移行到炎症部位的能力 [8] 。
, 百拇医药
本实验用半定量RT-PCR法也发现在伴放线放线杆菌感染的巨噬细胞中CCR5有高表达，表明CCR5在青少年牙周炎病程中发挥作用。研究发现结核病患者易感艾滋病，在结核病患者中HIV-1感染的辅助受体CXCR4和CCR5有高表达。感染结核分支杆菌和内毒素血症后，CXCR4和CCR5在CD4(+)T细胞中表达增加 [2] 。CCR5是活动性结核病人中分离出的HIV-1C亚型的主要辅助受体 [4] 。Han Y等研究发现口腔上皮和生殖道上皮可能是介导HIV-1全身感染的靶组织。他们将唾液腺上皮株HSY和HSG及子宫内膜细胞株HEC-1与HIV-1共同培养，结果这些细胞株均产生了生产性感染。所有细胞株均表现CXCR4表达阳性，HSY和HEC-1还表达CCR5 [9] 。本实验结果显示CCR5在伴放线放线杆菌感染的巨噬细胞中有高表达，而CXCR4表达量降低，感染伴放线放线杆菌后是否易感HIV还需要进一步研究。
参考文献
, 百拇医药
1 Fraziano M，Cappelli G，Santucci M，et al.Expression of CCR5is inˉcreased in human monocyte-derived macrophages and alveolar macrophages in the course of in vivo and in vitro Mycobacterium tuberˉculosis infection.AIDS Res Hum Retroviruses，1999，15(10):869-874.
2 Juffermans NP，Paxton WA，Dekkers PE，et al.Up-regulation of during human endotoxemia and after stimulation with(myco)bacterial antiˉgens:the role of cytokines.Blood，2000，96(8):2649-2654.
, http://www.100md.com
3 Juffermans NP，Speelman P，Verbon A，et al.Patients with active tuberˉculosis have increased expression of HIV coreceptors CXCR4and CCR5on CD4(+)T cells.Clin Infect Dis，2001，32(4):650-652.
4 Morris L，Cilliers T，Bredell H，et al.CCR5is the major coreceptor used byHIV-1subtype C isolates from patients with active tuberculosis.AIDS Res Hum Retrovirueses，2001，17(8):697-701.
5 Sanduzzi A，Fraziano M，Mariani F.Monocytes/macrophages in HIV inˉfectionand tuberculosis.J Biol Regul Homeost Agents，2001，15(3):294-298.
, http://www.100md.com
6 Garlet GP，Martins W Jr，Ferreira BR，et al.Patterns of chemokines and chemokine receptors expression in different forms of human periodontal disease.J Periodontal Res，2003，38(2):210-217.
7 Taubman MA，Kawai T.Involvement of T-lymphocytes in periodontal disease and in direct and indirect induction of bone resorption.Crit Rev Oral Biol Med，2001，12(2):125-135.
8 Gamonal J，Acevedo A，Bascones A，et al.Characterization of cellular infiltrate，detection of chemokine receptor CCR5and interleukin-8and RANTES chemokines in adult periodontitis.J Periodontal Res，2001，36(3):194-203.
9 Han Y，Ventura CL，Black KP，et al.Productive human immunodeficienˉcy virus-1infection of epithelial cell lines of salivary gland origin.Oral Microbiol Immunol，2000，15(2):82-88.
作者单位:200019上海第二医科大学附属宝钢医院
(收稿日期:2003-11-19)
(编辑晓 勇), 百拇医药(钱)
关键词 趋化因子受体 青少年牙周炎 半定量逆转录PCR 伴放线放线杆菌
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2004)03-0196-02
Study on the expression of chemokines’receptors in macrophage
, 百拇医药
stimulated by actinobacillus actinomycetemcomitans
Qian Long，Wu Chunlan，Qu Yuehong，et al.
Department of Stomatology，Baogang Hospital，Shanghai Second Medical University，Shanghai200019.
【Abstract】 Objective To assay the expression of several chemokines’receptors-CXCR4and CCR5in macrophage stimulated by actinobacillus actinomycetemcomitans(NCTC，Y4).Methods Actinobacillus actinoˉmycetemcomitans and macrophage were co-cultured for several hours，then assayed the quantities of each chemokine receptors’mRNA expressed in macrophage by semi-quantify RT-PCR technique withβ-actin as the reference standard.Results Co-cultured18hours later，the mRNA quantities of CXCR4expressed in macrophage decreased(P<0.01);and36hours later，the mRNA quantities of CCR5expressed in macrophage increased(P<0.01).Conˉclusion It was possible that CXCR4and CCR5were involved in the immune reaction of juvenile periodontitis and whether the patients suffered from juvenile periodontitis have more chances to be infected by HIV(human immunodefiˉciency virus)needs further study.
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Key words chemokin receptors juvenile periodontitis semi-quantify RT-PCR actinobacllus actinoˉmycetemcomitans
大量研究发现感染某些疾病如结核病 [1～5] 的患者易感艾滋病。牙周病与艾滋病之间有一定的关系，牙周病可能是艾滋病并发症;牙周病患者是否易感艾滋病还没有明确结论。趋化因子受体CXCR4和CCR5是HIV感染侵入宿主细胞的主要辅助受体，本实验通过检验CCR5和CXCR4在伴放线放线杆菌感染的巨噬细胞中的表达情况，探讨牙周病与艾滋病易感性之间的关系。
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器 巨噬细胞株小鼠U937株，购自中科院细胞生化研究所。伴放线放线杆菌Y4菌株，由上海市第九人民医院口研所惠赠。RPMI1640培养基(Gibco，USA)，BHI培养基(Oxozid，England)，胎牛血清(Hyclone，USA)，引物(由赛百胜公司合成)，RNA抽提试剂盒(华舜公司)，cDNA第一链合成试剂盒(申能博彩公司)，Gis-1000凝胶成像系统(Tanon，USA)。
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1.2 分别培养U937细胞和伴放线放线杆菌Y4菌株 将U937巨噬细胞加入含有10%胎牛血清和青链霉素的RPˉMI1640培养液中，放入CO 2 培养箱中，在5%CO 2 、37℃恒温条件下培养。将伴放线放线杆菌Y4菌株接种到含有氯化血红素、维生素K 1 和脱纤维羊血的BHI固体培养基中，置于厌氧盒中，在37℃下厌氧培养;待其长成多个菌落时，挑单一菌落到不加脱纤维羊血的BHI液体培养基中，厌氧条件下增菌培养。
1.3 U937细胞与伴放线放线杆菌Y4菌株的共同培养 当U937细胞生长到指数生长期，1500r/min10min离心收集细胞，用不含抗生素和小牛血清的RPMI1640液重悬，调整浓度为1×105 个/ml，按每孔0.5ml加入24孔细胞培养板中;伴放线放线杆菌Y4菌株培养到指数生长期，1500r/min10min离心收集细菌，用不加脱纤维羊血的BHI液体培养基重悬，麦氏管检测调整浓度为5×10 8 个/ml，用不含抗生素和小牛血清的RPMI1640液再稀释100倍，然后按100μl/孔加入到已加有U937的24孔细胞培养板中，攻击比率1细胞/10细菌，共同培养1、6、12、18、24、36h。以培养1h组为阴性对照组，其余组为实验组。
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1.4 巨噬细胞U937总RNA的抽提 到预定的各个时间点随机收集一孔细菌和细胞的混合物，1500r/min10min离心，得沉淀物即为培养后的细胞和细菌量。用PBS缓冲液重悬沉淀，用RNA抽提试剂盒抽提U937细胞内的总RNA。
1.5 用半定量RT-PCR法得cDNA 用逆转录试剂盒对上述RNA进行逆转录得cDNA，各个时间点以对应的cDNA为模板，用CXCR4和CCR5特异的引物进行PCR扩增，同时扩增β-actin作为内参照。进行DNA电泳，比较β-actin与CXCR4和CCR5的相对含量，每一时间点的样品中对每个趋化因子受体重复定量3次。其中CXCR4引物序列为:上游引物5’-TCCTGCCCACCATCTACTCCATCAT-3’，下游引物5’-AGACGCCCACATAGACCACCTTTTCAG-3’，CCR5引物序列:上游引物5’-CTGGCCATCTCTˉGACCTGTTTTTCCTCC-3’，下游引物5’-CAGCCCTGTGCˉCTCTTCTTCTCATTTC-3’，β-actin引物序列:上游引物5’-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’，下游引物5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’。
, http://www.100md.com
1.6 分析CXCR4和CCR5的相对量 凝胶成像系统扫描各趋化因子受体的cDNA电泳条带，通过软件分析得出条带的强度与净面积;并计算各条带的辉度，条带辉度计算公式为:条带强度×条带净面积;CXCR4和CCR5的mRNA相对表达量的计算公式为:各趋化因子受体电泳条带辉度/同一时间点的β-actin电泳条带辉度;应用NOSA软件中的单因素方差分析法统计数据。
2 结果
CXCR4和CCR5的相对表达量。在放线放线杆菌Y4菌株与U937细胞共同培养6h、12h时，U937细胞体内表达CXCR4的相对量与阴性对照组(1h组)无统计学差异，18h、24h和36h组CXCR4的相对量明显低于阴性对照组(P<0.01)。在放线放线杆菌Y4菌株与U937细胞共同培养6h、12h、18h和24h时，U937胞体内表达CCR5的相对量与阴性对照组(1h组)无统计学意义，36h组CCR5的相对量明显高于阴性对照组(P<0.01)。
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表1 CXCR4和CCR5的mRNA在不同培养时间的表达相对量 (X±s)
3 讨论
目前公认伴放线放线杆菌是青少年牙周炎的优势致病菌，其感染牙周组织引起宿主产生的免疫反应目前还不十分清楚。趋化因子受体主要参与免疫监视、先天性和过继性的免疫应答以及各种形式的病理性炎症，另外，趋化因子受体CXCR4和CCR5还是HIV感染侵入宿主细胞的主要辅助受体。趋化因子和趋化因子受体在牙周病的发生发展过程中起重要作用。在牙周炎进展期患者的牙龈中MIP1-alpha(macrophage inflammatory proteins-1alpha)和干扰素诱生蛋白10(IP-10)以及各自的受体CCR5和CXCR4的表达量明显提高 [6] 。Taubman MA等发现CCR5在病变的牙龈组织中有显著的表达;其配体RANTES(Regulated on activation normalT Cell expressed and seceted)，MIPI-alpha在感染的牙固组织 中也有高表达 [7] 。Gamonal J等发现CCRS在成人牙周炎患者的牙龈中检测到表达;ELISA法在牙周炎患者的龈沟液中检测到IL-8和RANTES，在健康人的龈沟液中IL-8量比较低;经牙周病治疗后，龈沟液中浸润细胞、IL-8和RANTES量降低;提示趋化因子以及其受体的表达可能反应淋巴细胞亚群移行到炎症部位的能力 [8] 。
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本实验用半定量RT-PCR法也发现在伴放线放线杆菌感染的巨噬细胞中CCR5有高表达，表明CCR5在青少年牙周炎病程中发挥作用。研究发现结核病患者易感艾滋病，在结核病患者中HIV-1感染的辅助受体CXCR4和CCR5有高表达。感染结核分支杆菌和内毒素血症后，CXCR4和CCR5在CD4(+)T细胞中表达增加 [2] 。CCR5是活动性结核病人中分离出的HIV-1C亚型的主要辅助受体 [4] 。Han Y等研究发现口腔上皮和生殖道上皮可能是介导HIV-1全身感染的靶组织。他们将唾液腺上皮株HSY和HSG及子宫内膜细胞株HEC-1与HIV-1共同培养，结果这些细胞株均产生了生产性感染。所有细胞株均表现CXCR4表达阳性，HSY和HEC-1还表达CCR5 [9] 。本实验结果显示CCR5在伴放线放线杆菌感染的巨噬细胞中有高表达，而CXCR4表达量降低，感染伴放线放线杆菌后是否易感HIV还需要进一步研究。
参考文献
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, http://www.100md.com
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7 Taubman MA，Kawai T.Involvement of T-lymphocytes in periodontal disease and in direct and indirect induction of bone resorption.Crit Rev Oral Biol Med，2001，12(2):125-135.
8 Gamonal J，Acevedo A，Bascones A，et al.Characterization of cellular infiltrate，detection of chemokine receptor CCR5and interleukin-8and RANTES chemokines in adult periodontitis.J Periodontal Res，2001，36(3):194-203.
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作者单位:200019上海第二医科大学附属宝钢医院
(收稿日期:2003-11-19)
(编辑晓 勇), 百拇医药(钱)