过敏性紫癜患儿外周血单个核细胞活化、凋亡、分泌功能测定
【摘要】 目的 系统地研究HSP患儿T淋巴细胞的免疫功能及地塞米松的作用机制。方法 HSP患儿和健康儿童的外周血单个核细胞(PBMC)(分地塞米松组和空白对照组)体外培养后以流式细胞仪检测T淋巴细胞活化抗原CD 3 CD 25 及T淋巴细胞的凋亡百分比，以ELISA法检测白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)的水平。结果 HSP患儿与健康儿童比较，PBMC的CD 3 CD 25 抗原表达量明显升高(P=0.011)，IL-2水平明显降低(P=0.0056)，IL-4水平明显升高(P=0.00023)，凋亡百分比明显降低(P=0.003);HSP患儿地塞米松组与空白对照组比较，CD 3 CD 25 抗原表达量明显降低(P=0.024)，IL-2水平稍有下降但差异无显著性(P=0.569)，IL-4水平明显降低(P=0.001)，T淋巴细胞凋亡百分比明显升高(P=0.017);HSP患儿IL-2水平与凋亡百分比呈正相关(r=0.716，P<0.01)，IL-4水平与CD 3CD 25 抗原表达量呈正相关(r=0.785，P<0.01)。结论 HSP患儿存在PBMC活化亢进，IL-2水平明显降低而IL-4水平明显升高，且凋亡延迟;IL-2水平越低T淋巴细胞凋亡越延迟;IL-4水平越高T淋巴细胞活化越多;地塞米松可能是通过调节Th 1 、Th 2 细胞网络的平衡，抑制T淋巴细胞的活化及促进T淋巴细胞的凋亡而发挥作用。
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关键词 过敏性紫癜 活化 分泌 凋亡地塞米松
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2004)02-0097-05
To systematically explore the activation，secretion，apoptosis on culturedperipheral
blood mononuclear cells(PBMC) in children with Henoch-Schonlein purpura(HSP)
Ji Ping，Lu Siguang，Chen Jun.
The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Jiangsu222500.
, http://www.100md.com
【Abstract】 Objective To systematically explore the immune function and thetreatment effects of dexamethaˉsone(Dex)in children with Henoch-Schonlein purpura(HSP).Methods The changes of activation，secretion，apoptosis on culturedperipheral blood mononuclear cells(PBMC)in children with HSP and healthy children，and contrast with the effects of dexamethasone(Dex)respectively were observed.The expression of cultured PBMC activaˉtion markers such as CD 3 ，CD 25 on cell surface were assayed with flow cytometry(FACS)and apoptosis cell count of PBMC were also measured by FACS.Cytokines such as IL-2，IL-4in the supernatantof cultured PBMC were deˉtected by ELISA.Results The percentage of CD 3+ CD 25+ cells was significantly higher(P=0.011)，the level of IL-4was significantlyhigher(P=0.00023)and IL-2significantly lower(P=0.0056)，while the rate of apoptosis was significantly lower(P=0.03)in the children with HSP than that of the healthy children.After affected by Dex in the HSP patient，the percentage of CD +3 CD 25 + (p=0.024)cells decreased significantly(P=0.028)，the level of IL-4decreased significantly(P=0.001)，the rate of lymphocytes apoptosis increased significantly(P=0.017);the level of IL-2decreased，but the difference was not significant(P=0.569).The elevated level of IL-4positively correlated with the increased expression of CD 3 CD 25 in the HSP patients(r=0.785，P<0.01).The decreased level of IL-2positively correlated with the rate of T lymphocytes apoptosis in the HSP patients(r=0.716，P<0.01).Conclusion There exist multiple immune regulatory disturbance in HSP patients，for example，the function of Th 1 was decreased while the function of Th 2 was increased，lymphocytes apoptosis wasdelay and activation of PBMC was significantly inˉcreased.The treatment of Dexhas obvious immune regulatory effect and is an effective therapy，such as inhibitingT-cell’s activation，raising the rate of T-cell’s apoptosis and inhibiting the function of Th 2 .
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Key words henoch-Schonlein purpura activation secretion apoptosis dexamethasone
过敏性紫癜(HSP)可能与IgA介导的免疫反应有关，是由于抗原抗体免疫复合物沉积、激活补体，导致毛细血管和小血管及其周围产生炎症，血管壁通透性增高，从而产生紫癜和各种局部或全身症状，所以该病是一种免疫复合物介导的系统性小血管炎。HSP患儿存在免疫功能紊乱，主要表现为细胞免疫功能低下，炎症介质分泌增多，多克隆B细胞活化及免疫球蛋白的分泌增加。虽然国内已有许多学者对HSP患儿的免疫功能做了相关报道，但系统研究仍较少，本文就HSP患儿外周血单个核细胞的免疫功能及地塞米松作用做了系统的研究，为该病的治疗和判断预后寻求新的途径提供依据。具体如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象 HSP组患儿16例(均来自于徐州医学院附属医院儿科)，其中男9例，女7例，平均年龄为7.5岁，均符合《实用儿科学》(第6版)诊断标准，且近一个月未用过地塞米松等免疫抑制剂(临床一般资料见表1)。另外选择20例健康同龄儿童(采血前健康，无服用糖皮质激素等免疫抑制剂史)作为正常对照组。并且分别在每组内分设两组，一组为地塞米松组，另一组为空白对照组。
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1.2 实验方法及步骤
1.2.1 密度梯度离心法制备单个核细胞，用RPMI-1640完全培养液调备细胞悬液;0.4%台盼兰排除计数，活细胞数>95%。
1.2.2 淋巴细胞凋亡的检测 (1)细胞培养:用RPMI-1640完全培养液调细胞数达1×10 6/ml，分设2组:地塞米松组:地塞米松100μl+1ml细胞悬液;空白对照组:1ml细胞悬液+RPMI-1640完全培养液100μl。使每组地塞米松终浓度为1×10 -5 mol/L，加24孔培养板上置37℃、5%CO 2 加湿孵箱中培养72h。(2)将以上2组培养的细胞悬液1500r/min离心5min收取细胞，PBS液2ml洗涤2次后用75%乙醇固定，置-20℃冰箱冻存12h以上。(3)将乙醇固定的细胞悬液1500r/min离心5min收取细胞，再用PBS液洗涤2次，然后用1ml PI工作液将细胞重悬，4℃避光孵育30min。(4)流式细胞仪分析:凋亡细胞在流式细胞仪(美国Calibur公司)检测DNA直方图上呈现特征性的二倍体峰，按500～600cells/s计数1×10 4 个细胞。根据二倍体及亚二倍体峰，用Modfit LT-Unititle分析软件分析细胞凋亡率(APO)。
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1.2.3 淋巴细胞CD 3 CD 25 抗原的检测 (1)取RPMI-1640完全培养液调细胞数达1×10 6 /ml，分2组，分组方法同上。置24孔培养板中于37℃、5%CO 2 加湿孵箱中培养72h。 (2)每组中分别加入CD 3 单抗(鼠抗人CD 3 -IgG/FITC，购自IQ公司)15μl、CD 25 单抗(鼠抗人CD 25 -IgG/PE，购自IQ公司)15μl，37℃孵育30min;收取细胞后用PBS液1500r/min离心5min，洗涤2次;加PBS液1ml重悬细胞送流式细胞仪检测CD 3 CD 25 表达量。
1.2.4 淋巴细胞分泌的IL-2、IL-4水平的检测 (1)用RPMI-1640完全培养液调细胞数达1×10 6 /ml，分组同上，加入24孔培养板上，置37℃、5%CO 2 加湿孵箱中培养72h。(2)收取培养的细胞悬液于EP管中，以8000r/min离心5min，收集上清液置-70℃冰箱中冻存待检;用EILSA法检测IL-2、IL-4含量。(按华美公司ELISA试剂盒上的操作说明书进行操作)。
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1.2.5 统计学处理 所有数据均以X±s表示，用Excel统计软件对结果进行t检验及线性回归分析，P<0.05为统计学差异有显著性。
2 实验结果
见表1。
2.1 CD 3 CD 25 表达量 HSP患儿PBMC中CD 3 CD 25 表达量较健康儿童明显升高(P=0.011)，而HSP患儿地塞米松组与空白对照组比较CD 3 CD 25 表达量明显降低(P=0.024)。见图1、图2。
2.2 IL-2、IL-4水平 HSP患儿IL-2水平较健康儿童明显下降(P=0.0056)，HSP患儿地塞米松组IL-2水平较空白对照组稍有下降，但差异无显著性(P=0.56);HSP患儿IL-4水平较健康儿童明显升高(P=0.00023)，HSP患儿地塞米松组IL-4水平较空白对照组明显下降(P=0.001)。
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2.3 凋亡百分比 HSP患儿的凋亡百分比较健康儿童明显降低(P=0.03)，HSP患儿地塞米松组凋亡百分比较空白对照组明显升高(P=0.017)。见图3、图4。
2.4 IL-2水平与凋亡百分比、IL-4水平与CD 3 CD 25 表达量的关系 HSP患儿的IL-2水平与凋亡百分比之间存在线性相关关系(r=0.716，P<0.01);IL-4水平与CD 3+ CD 25 + 表达量存在线性相关关系(r=0.785，P<0.01)。健康儿童体外培养的PBMC地塞米松组与空白对照组的各种免疫功能的比较差异均无显著性。
表1 HSP患儿和健康儿童PBMC不同条件下免疫功能比较
注: ˇ 表示与健康儿童比较差异有显著性(P<0.05)， # 表示与空白对照组比较差异有显著性(P<0.05)
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3 讨论
3.1 分泌功能 T细胞在免疫反应及炎症反应过程中起着关键性的作用，CD 4+ 和CD 8+ T细胞的调节对机体免疫平衡的维持极为重要。而CD 4+ 细胞中Th 1 、Th 2 细胞应答的动 态平衡又是机体维持正常免疫功能的重要保证，其平衡异常是免疫介导疾病的一个重要因素。Th 1 细胞主要分泌IL-2、IFN-r、IL-12等细胞因子，发挥细胞免疫功能，Th 2 细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-13等细胞因子，辅助B细胞产生抗体而发挥体液免疫功能，在众多的细胞因子网络中，最能代表Th 1 、Th 2 功能的细胞因子分别是IL-2和IL-4。所以我们对HSP患儿的外周血单个核细胞体外培养后检测其培养液中IL-2、IL-4的水平了解其分泌功能，以进一步了解其免疫功能。
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我们的研究表明:HSP患儿IL-2水平与健康儿童比较明显降低，而IL-4水平明显升高。由于IL-2水平明显降低使CTL和NK细胞等细胞的免疫功能下降，从而对外来抗原清除功能下降，而出现异常免疫应答;且IL-2水平下降对抑制性T细胞辅助作用减弱，因而不能有效地活化NK细胞和抑制B细胞，且B细胞在IL-4的作用下活化、增殖、分泌功能亢进，导致B细胞分泌免疫球蛋白增加，且已有研究证实HSP患者血清中IgA、IgE、IgG4选择性的增高 [1，2] 。其次，从HSP患儿IL-2水平降低，而IL-4水平增高可以推知Th 1 、Th 2 细胞分泌的其他细胞因子如IFN-r、IL-12等水平降低，而IL-5、IL-6等细胞因子水平升高，且这些都先后被许多学者研究证实 [4] ;有的学者还进一步研究证实IL-4与IgE、IgG4及IL-5与IgA之间存在着正相关关系 [3] ，因此HSP患儿IgE、IgG4、IgA增高应与IL-4、IL-5等过度生成有关 [5，6] 。所以我们可以推知HSP患儿存在细胞因子的网络失衡从而导致免疫功能紊乱。Fursu等[7，8] 所做的动物实验结果表明系膜增生性肾炎中IL-4的表达与系膜细胞的增生和细胞外基质的增加程度呈正相关。这一实验结果为HSP的系膜增生性肾炎患者IL-4水平的增加提供了理论依据。
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当机体受到体外刺激或异己抗原攻击时，Th 1 和Th 2 细胞中某一亚群功能升高，另一亚群功能降低，使细胞因子的网络平衡受到破坏，导致致炎因子不断增加，出现“免疫偏斜”，故常常表现出细胞免疫增强、体液免疫功能降低，或相反，Liblau等称该现象为“克隆转移” [9] 。HSP患儿IL-2水平明显降低、IL-4水平明显升高，可以推知HSP患儿存在免疫功能紊乱，主要表现Th 1 细胞功能降低，Th 2 细胞功能亢进，即细胞免疫功能减弱，而体液免疫功能亢进，并出现“克隆转移”现象。Th 1 是Th 2 的抑制细胞，反之亦然，由此可见Th 1 和Th 2 细胞在分化和行使各自功能时通过自分泌因子表现出强力的排斥对方和诱导自身正反馈特性。HSP患儿IL-2水平明显降低、IL-4水平明显升高可以推知HSP患儿主要存在Th 2 及其介导的体液免疫效应遏制Th 1 及其介导的细胞免疫效应而出现免疫功能紊乱。IL-2、IL-4均需与细胞表面的IL-2受体、IL-4受体结合才能发挥作用，且IL-4R共用IL-2R的r链，因而更进一步从理论上推论两者之间的功能的相互遏制作用。
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因此，HSP患儿存在细胞因子网络及Th 1 、Th 2 功能的失衡，导致了Th 1 细胞功能下降，细胞免疫功能低下和Th 2 优势活化，体液免疫呈高反应状态，多克隆B细胞活化，选择性Ig的异常增高，血浆中的IgA、IgE水平增高明显，并产生免疫复合物性血管炎，这是本病发生的重要机制之一。HSP患儿加用地塞米松后IL-2水平稍有降低而IL-4水平明显降低，这样使Th 1 细胞和Th2 细胞免疫功能趋于平衡，这可能是激素治疗有效的机制之一。
3.2 活化 CD 3 是存在于外周所有成熟T细胞上的分化抗原，是T细胞表面标志抗原。CD 25 是IL-2受体(IL-2R) 的α链即mIL-2Rα(膜IL-2受体α链)，mIL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ组成的IL-2受体(IL-2R)具有最高的亲和力。正常情况下，CD 25 在静息T细胞上不表达，在抗原/丝裂原活化的T细胞上表达 [10] ，在某些病理状态下，CD 25 却高量表达 [11] ，可见淋巴细胞只有在活化后才能表达CD25 ，所以CD 25 被认为是T细胞早期活化的标志 [12] 。故我们检测了HSP患儿PBMC的CD 3 CD 25 表达量以了解其活化的功能。
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IL-2必须与高亲和力的IL-2R结合形成聚合体才能内化进入细胞内，T细胞才能进入S期，产生T细胞的活化与增殖 [13] ，从而发挥IL-2的功能，由此可见，细胞表面的CD 25 抗原的表达状况与细胞的生长、增殖、活化有密切的相关性，CD 25 数量越多，IL-2与高亲和力的CD 25 链结合愈高，T细胞活化和增殖率就越高 [14] ，IL-2的功能发挥得越充分。所以CD 3+ CD 25 + 细胞的数量的多少更能代表T淋巴细胞的活化功能。我们的研究显示:HSP患儿PBMC的CD 3 CD 25 表达量明显增高，表明T细胞的活化和增殖率增高，从而引起异常的免疫应答，而且从前面的研究可以推知活化和增殖的T细胞可能主要是Th 2 细胞等，所以HSP患儿PBMC异常活化和增殖是其发病机制之一。
本研究还表明:糖皮质激素作用后HSP患儿的PBMC中CD 3 抗原表达量及CD 3 CD 25 抗原表达量较空白对照组显著下调，可能由于:①糖皮质激素(GC)使T淋巴细胞表面CD 3 、CD 25 抗原的密度下调，而缺乏CD 3 、CD 25 抗原的T细胞不能导致钙离子的动员，从而影响TCR识别抗原后T细胞的正常信号传递和激活，最终导致免疫应答的终止，甚至发生免疫耐受。②GC通过抑制T细胞增殖，诱导T细胞的凋亡，使CD 3+ 、CD 25 + T淋巴细胞数量减少，从而达到治疗的目的。另外，由于可溶性IL-2受体(SIL-2R)是T细胞活化后CD 25 裂解的片段，它能以低亲和力结合IL-2，主要在T淋巴细胞激活、增殖时产生，由细胞膜释放入循环中，故我们推测由于HSP患儿PBMC的CD 25 表达量增高，相应的血液中SIL-2R的含量增高，IL-2与SIL-2R结合增多，从而导致游离的IL-2水平下降，这可能是HSP患儿IL-2下降的一个原因。
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3.3 凋亡 细胞增殖和凋亡间的动态平衡是维持机体自身稳定的必要条件，免疫细胞的凋亡过多或不足，必然干扰免疫系统的自身稳定。在特异性免疫调节中，Fas/FasL介导的凋亡途径起重要的作用，并且Fas/FasL介导的凋亡对成熟T细胞比未成熟的T细胞更为重要。当FasL与Fas结合后，可通过一系列的细胞凋亡信号传递途径介导Fas + 细胞凋亡 [15] 。有研究证实，靶细胞表面的MHC分子和抗原形成的复合物可刺激淋巴细胞TCR受体，使其表达Fas和FasL，诱导淋巴细胞凋亡 [17] 。这些研究表明:当T细胞与特异性抗原接触启动免疫应答的同时，也激活了Fas系统，诱导激活的淋巴细胞凋亡，起到调控免疫应答，维持免疫平衡的作用 [16] 。
我们的研究表明:HSP患儿PBMC的凋亡百分比较健康儿童明显降低，说明HSP患儿存在T淋巴细胞凋亡延迟。这可能是由于HSP患儿IL-2水平的降低使CTL、NK细胞的功能受抑制，清除抗原的能力降低，使体内抗原处于高水平状态，故T细胞凋亡主要是通过Fas/FasL等介导的主动凋亡途径;另外，由于IL-2水平降低使CTL、NK细胞的活化、增殖、分泌功能受到抑制，CTL、NK细胞的FasL的表达量减少，通过CTL、NK细胞作用于靶细胞并使其发生凋亡的途径减弱(即活化诱导的细胞死亡途径发生障碍)，引起活化的淋巴细胞凋亡延迟，从而导致增殖和凋亡之间的动态平衡被打破，特别是Th 2 类细胞大量增殖且凋亡延迟而引起的免疫功能紊乱可能是HSP的发病机制之一;另外，HSP患儿PBMC加用地塞米松作用后凋亡百分比明显增高，进一步说明地塞米松可通过促进T细胞凋亡，使增殖和凋亡趋于平衡而发挥作用。
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3.4 IL-2与凋亡、IL-4与活化的关系等 Refeali [18] 研究发现IL-2增强Fas途径介导的AICD，IL-2增加了FasL的转录和表达，并抑制FLIP(Fas信号抑制剂)的转录和表达，所以IL-2是一种潜在性的凋亡促进因子。在一次有效的免疫应答中，T淋巴细胞要经历活化期和增殖期，在活化期内，T细胞诱导表达IL-2及其受体IL-2R，IL-2与IL-2R结合后，启动T细胞周期的进程，T细胞进入增殖期，增殖的淋巴细胞易凋亡。IL-2最能提供T淋巴细胞对主动凋亡的敏感性，但T淋巴细胞是否发生凋亡还要取决于局部抗原水平，抗原水平高时，通过死亡因子途径发生主动凋亡，低时则通过线粒体途径发生被动凋亡，因而机体能在持续暴露在某一抗原时限制T细胞的不断扩增，避免产生过强的应答，亦能在应答末期减少扩增的T细胞数量，维持外周淋巴细胞数量的平衡。这种IL-2依赖性诱导活化细胞凋亡的机制如果受损则易发生免疫性疾病。我们的研究表明:HSP患儿IL-2水平与凋亡百分比之间存在线性相关关系，且呈正相关，说明IL-2水平越低凋亡百分比也越低，这可能是由于IL-2水平的下降，使得抗原水平高时不能通过死亡因子途径发生主动凋亡，因而使凋亡发生延迟。HSP患儿IL-4水平与CD 3 CD 25 表达量存在正相关关系，说明IL-4水平越高活化的T淋巴细胞越多。
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4 结论
HSP患儿存在PBMC的活化亢进，IL-2水平明显降低而IL-4水平明显升高，且凋亡延迟;IL-2水平越低T淋巴细胞凋亡越延迟;IL-4水平越高活化的T淋巴细胞越多;地塞米松可能是通过促进Th 1 、Th 2 细胞网络的平衡，抑制T淋巴细胞的活化及促进T淋巴细胞的凋亡发挥作用。
A图 B图
A:空白对照组，B:地塞米松组
图1 不同条件下HSP患儿PBMC中CD3 + 、CD3 + CD25 + 细胞的流式细胞仪分析
图图2 健康儿童PBMC中CD3 + 、CD3 + CD25 + 细胞的流式细胞仪分析图D图E
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图D:空白对照组，E:地塞米松组
图3 不同条件下HSP患儿PBMC凋亡百分比的流式细胞仪分析图
图4 健康儿童的PBMC凋亡百分比的流式细胞仪分析图
参考文献
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作者单位:222500江苏省灌南县人民医院内科(系徐州医学院 研究生)
221000徐州医学院附属医院
(收稿日期:2004-02-16)
(编辑黄 杰), http://www.100md.com(季 平 卢思广 陈 军)
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关键词 过敏性紫癜 活化 分泌 凋亡地塞米松
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2004)02-0097-05
To systematically explore the activation，secretion，apoptosis on culturedperipheral
blood mononuclear cells(PBMC) in children with Henoch-Schonlein purpura(HSP)
Ji Ping，Lu Siguang，Chen Jun.
The Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Jiangsu222500.
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【Abstract】 Objective To systematically explore the immune function and thetreatment effects of dexamethaˉsone(Dex)in children with Henoch-Schonlein purpura(HSP).Methods The changes of activation，secretion，apoptosis on culturedperipheral blood mononuclear cells(PBMC)in children with HSP and healthy children，and contrast with the effects of dexamethasone(Dex)respectively were observed.The expression of cultured PBMC activaˉtion markers such as CD 3 ，CD 25 on cell surface were assayed with flow cytometry(FACS)and apoptosis cell count of PBMC were also measured by FACS.Cytokines such as IL-2，IL-4in the supernatantof cultured PBMC were deˉtected by ELISA.Results The percentage of CD 3+ CD 25+ cells was significantly higher(P=0.011)，the level of IL-4was significantlyhigher(P=0.00023)and IL-2significantly lower(P=0.0056)，while the rate of apoptosis was significantly lower(P=0.03)in the children with HSP than that of the healthy children.After affected by Dex in the HSP patient，the percentage of CD +3 CD 25 + (p=0.024)cells decreased significantly(P=0.028)，the level of IL-4decreased significantly(P=0.001)，the rate of lymphocytes apoptosis increased significantly(P=0.017);the level of IL-2decreased，but the difference was not significant(P=0.569).The elevated level of IL-4positively correlated with the increased expression of CD 3 CD 25 in the HSP patients(r=0.785，P<0.01).The decreased level of IL-2positively correlated with the rate of T lymphocytes apoptosis in the HSP patients(r=0.716，P<0.01).Conclusion There exist multiple immune regulatory disturbance in HSP patients，for example，the function of Th 1 was decreased while the function of Th 2 was increased，lymphocytes apoptosis wasdelay and activation of PBMC was significantly inˉcreased.The treatment of Dexhas obvious immune regulatory effect and is an effective therapy，such as inhibitingT-cell’s activation，raising the rate of T-cell’s apoptosis and inhibiting the function of Th 2 .
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Key words henoch-Schonlein purpura activation secretion apoptosis dexamethasone
过敏性紫癜(HSP)可能与IgA介导的免疫反应有关，是由于抗原抗体免疫复合物沉积、激活补体，导致毛细血管和小血管及其周围产生炎症，血管壁通透性增高，从而产生紫癜和各种局部或全身症状，所以该病是一种免疫复合物介导的系统性小血管炎。HSP患儿存在免疫功能紊乱，主要表现为细胞免疫功能低下，炎症介质分泌增多，多克隆B细胞活化及免疫球蛋白的分泌增加。虽然国内已有许多学者对HSP患儿的免疫功能做了相关报道，但系统研究仍较少，本文就HSP患儿外周血单个核细胞的免疫功能及地塞米松作用做了系统的研究，为该病的治疗和判断预后寻求新的途径提供依据。具体如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象 HSP组患儿16例(均来自于徐州医学院附属医院儿科)，其中男9例，女7例，平均年龄为7.5岁，均符合《实用儿科学》(第6版)诊断标准，且近一个月未用过地塞米松等免疫抑制剂(临床一般资料见表1)。另外选择20例健康同龄儿童(采血前健康，无服用糖皮质激素等免疫抑制剂史)作为正常对照组。并且分别在每组内分设两组，一组为地塞米松组，另一组为空白对照组。
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1.2 实验方法及步骤
1.2.1 密度梯度离心法制备单个核细胞，用RPMI-1640完全培养液调备细胞悬液;0.4%台盼兰排除计数，活细胞数>95%。
1.2.2 淋巴细胞凋亡的检测 (1)细胞培养:用RPMI-1640完全培养液调细胞数达1×10 6/ml，分设2组:地塞米松组:地塞米松100μl+1ml细胞悬液;空白对照组:1ml细胞悬液+RPMI-1640完全培养液100μl。使每组地塞米松终浓度为1×10 -5 mol/L，加24孔培养板上置37℃、5%CO 2 加湿孵箱中培养72h。(2)将以上2组培养的细胞悬液1500r/min离心5min收取细胞，PBS液2ml洗涤2次后用75%乙醇固定，置-20℃冰箱冻存12h以上。(3)将乙醇固定的细胞悬液1500r/min离心5min收取细胞，再用PBS液洗涤2次，然后用1ml PI工作液将细胞重悬，4℃避光孵育30min。(4)流式细胞仪分析:凋亡细胞在流式细胞仪(美国Calibur公司)检测DNA直方图上呈现特征性的二倍体峰，按500～600cells/s计数1×10 4 个细胞。根据二倍体及亚二倍体峰，用Modfit LT-Unititle分析软件分析细胞凋亡率(APO)。
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1.2.3 淋巴细胞CD 3 CD 25 抗原的检测 (1)取RPMI-1640完全培养液调细胞数达1×10 6 /ml，分2组，分组方法同上。置24孔培养板中于37℃、5%CO 2 加湿孵箱中培养72h。 (2)每组中分别加入CD 3 单抗(鼠抗人CD 3 -IgG/FITC，购自IQ公司)15μl、CD 25 单抗(鼠抗人CD 25 -IgG/PE，购自IQ公司)15μl，37℃孵育30min;收取细胞后用PBS液1500r/min离心5min，洗涤2次;加PBS液1ml重悬细胞送流式细胞仪检测CD 3 CD 25 表达量。
1.2.4 淋巴细胞分泌的IL-2、IL-4水平的检测 (1)用RPMI-1640完全培养液调细胞数达1×10 6 /ml，分组同上，加入24孔培养板上，置37℃、5%CO 2 加湿孵箱中培养72h。(2)收取培养的细胞悬液于EP管中，以8000r/min离心5min，收集上清液置-70℃冰箱中冻存待检;用EILSA法检测IL-2、IL-4含量。(按华美公司ELISA试剂盒上的操作说明书进行操作)。
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1.2.5 统计学处理 所有数据均以X±s表示，用Excel统计软件对结果进行t检验及线性回归分析，P<0.05为统计学差异有显著性。
2 实验结果
见表1。
2.1 CD 3 CD 25 表达量 HSP患儿PBMC中CD 3 CD 25 表达量较健康儿童明显升高(P=0.011)，而HSP患儿地塞米松组与空白对照组比较CD 3 CD 25 表达量明显降低(P=0.024)。见图1、图2。
2.2 IL-2、IL-4水平 HSP患儿IL-2水平较健康儿童明显下降(P=0.0056)，HSP患儿地塞米松组IL-2水平较空白对照组稍有下降，但差异无显著性(P=0.56);HSP患儿IL-4水平较健康儿童明显升高(P=0.00023)，HSP患儿地塞米松组IL-4水平较空白对照组明显下降(P=0.001)。
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2.3 凋亡百分比 HSP患儿的凋亡百分比较健康儿童明显降低(P=0.03)，HSP患儿地塞米松组凋亡百分比较空白对照组明显升高(P=0.017)。见图3、图4。
2.4 IL-2水平与凋亡百分比、IL-4水平与CD 3 CD 25 表达量的关系 HSP患儿的IL-2水平与凋亡百分比之间存在线性相关关系(r=0.716，P<0.01);IL-4水平与CD 3+ CD 25 + 表达量存在线性相关关系(r=0.785，P<0.01)。健康儿童体外培养的PBMC地塞米松组与空白对照组的各种免疫功能的比较差异均无显著性。
表1 HSP患儿和健康儿童PBMC不同条件下免疫功能比较
注: ˇ 表示与健康儿童比较差异有显著性(P<0.05)， # 表示与空白对照组比较差异有显著性(P<0.05)
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3 讨论
3.1 分泌功能 T细胞在免疫反应及炎症反应过程中起着关键性的作用，CD 4+ 和CD 8+ T细胞的调节对机体免疫平衡的维持极为重要。而CD 4+ 细胞中Th 1 、Th 2 细胞应答的动 态平衡又是机体维持正常免疫功能的重要保证，其平衡异常是免疫介导疾病的一个重要因素。Th 1 细胞主要分泌IL-2、IFN-r、IL-12等细胞因子，发挥细胞免疫功能，Th 2 细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-13等细胞因子，辅助B细胞产生抗体而发挥体液免疫功能，在众多的细胞因子网络中，最能代表Th 1 、Th 2 功能的细胞因子分别是IL-2和IL-4。所以我们对HSP患儿的外周血单个核细胞体外培养后检测其培养液中IL-2、IL-4的水平了解其分泌功能，以进一步了解其免疫功能。
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我们的研究表明:HSP患儿IL-2水平与健康儿童比较明显降低，而IL-4水平明显升高。由于IL-2水平明显降低使CTL和NK细胞等细胞的免疫功能下降，从而对外来抗原清除功能下降，而出现异常免疫应答;且IL-2水平下降对抑制性T细胞辅助作用减弱，因而不能有效地活化NK细胞和抑制B细胞，且B细胞在IL-4的作用下活化、增殖、分泌功能亢进，导致B细胞分泌免疫球蛋白增加，且已有研究证实HSP患者血清中IgA、IgE、IgG4选择性的增高 [1，2] 。其次，从HSP患儿IL-2水平降低，而IL-4水平增高可以推知Th 1 、Th 2 细胞分泌的其他细胞因子如IFN-r、IL-12等水平降低，而IL-5、IL-6等细胞因子水平升高，且这些都先后被许多学者研究证实 [4] ;有的学者还进一步研究证实IL-4与IgE、IgG4及IL-5与IgA之间存在着正相关关系 [3] ，因此HSP患儿IgE、IgG4、IgA增高应与IL-4、IL-5等过度生成有关 [5，6] 。所以我们可以推知HSP患儿存在细胞因子的网络失衡从而导致免疫功能紊乱。Fursu等[7，8] 所做的动物实验结果表明系膜增生性肾炎中IL-4的表达与系膜细胞的增生和细胞外基质的增加程度呈正相关。这一实验结果为HSP的系膜增生性肾炎患者IL-4水平的增加提供了理论依据。
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当机体受到体外刺激或异己抗原攻击时，Th 1 和Th 2 细胞中某一亚群功能升高，另一亚群功能降低，使细胞因子的网络平衡受到破坏，导致致炎因子不断增加，出现“免疫偏斜”，故常常表现出细胞免疫增强、体液免疫功能降低，或相反，Liblau等称该现象为“克隆转移” [9] 。HSP患儿IL-2水平明显降低、IL-4水平明显升高，可以推知HSP患儿存在免疫功能紊乱，主要表现Th 1 细胞功能降低，Th 2 细胞功能亢进，即细胞免疫功能减弱，而体液免疫功能亢进，并出现“克隆转移”现象。Th 1 是Th 2 的抑制细胞，反之亦然，由此可见Th 1 和Th 2 细胞在分化和行使各自功能时通过自分泌因子表现出强力的排斥对方和诱导自身正反馈特性。HSP患儿IL-2水平明显降低、IL-4水平明显升高可以推知HSP患儿主要存在Th 2 及其介导的体液免疫效应遏制Th 1 及其介导的细胞免疫效应而出现免疫功能紊乱。IL-2、IL-4均需与细胞表面的IL-2受体、IL-4受体结合才能发挥作用，且IL-4R共用IL-2R的r链，因而更进一步从理论上推论两者之间的功能的相互遏制作用。
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因此，HSP患儿存在细胞因子网络及Th 1 、Th 2 功能的失衡，导致了Th 1 细胞功能下降，细胞免疫功能低下和Th 2 优势活化，体液免疫呈高反应状态，多克隆B细胞活化，选择性Ig的异常增高，血浆中的IgA、IgE水平增高明显，并产生免疫复合物性血管炎，这是本病发生的重要机制之一。HSP患儿加用地塞米松后IL-2水平稍有降低而IL-4水平明显降低，这样使Th 1 细胞和Th2 细胞免疫功能趋于平衡，这可能是激素治疗有效的机制之一。
3.2 活化 CD 3 是存在于外周所有成熟T细胞上的分化抗原，是T细胞表面标志抗原。CD 25 是IL-2受体(IL-2R) 的α链即mIL-2Rα(膜IL-2受体α链)，mIL-2Rα、IL-2Rβ和IL-2Rγ组成的IL-2受体(IL-2R)具有最高的亲和力。正常情况下，CD 25 在静息T细胞上不表达，在抗原/丝裂原活化的T细胞上表达 [10] ，在某些病理状态下，CD 25 却高量表达 [11] ，可见淋巴细胞只有在活化后才能表达CD25 ，所以CD 25 被认为是T细胞早期活化的标志 [12] 。故我们检测了HSP患儿PBMC的CD 3 CD 25 表达量以了解其活化的功能。
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IL-2必须与高亲和力的IL-2R结合形成聚合体才能内化进入细胞内，T细胞才能进入S期，产生T细胞的活化与增殖 [13] ，从而发挥IL-2的功能，由此可见，细胞表面的CD 25 抗原的表达状况与细胞的生长、增殖、活化有密切的相关性，CD 25 数量越多，IL-2与高亲和力的CD 25 链结合愈高，T细胞活化和增殖率就越高 [14] ，IL-2的功能发挥得越充分。所以CD 3+ CD 25 + 细胞的数量的多少更能代表T淋巴细胞的活化功能。我们的研究显示:HSP患儿PBMC的CD 3 CD 25 表达量明显增高，表明T细胞的活化和增殖率增高，从而引起异常的免疫应答，而且从前面的研究可以推知活化和增殖的T细胞可能主要是Th 2 细胞等，所以HSP患儿PBMC异常活化和增殖是其发病机制之一。
本研究还表明:糖皮质激素作用后HSP患儿的PBMC中CD 3 抗原表达量及CD 3 CD 25 抗原表达量较空白对照组显著下调，可能由于:①糖皮质激素(GC)使T淋巴细胞表面CD 3 、CD 25 抗原的密度下调，而缺乏CD 3 、CD 25 抗原的T细胞不能导致钙离子的动员，从而影响TCR识别抗原后T细胞的正常信号传递和激活，最终导致免疫应答的终止，甚至发生免疫耐受。②GC通过抑制T细胞增殖，诱导T细胞的凋亡，使CD 3+ 、CD 25 + T淋巴细胞数量减少，从而达到治疗的目的。另外，由于可溶性IL-2受体(SIL-2R)是T细胞活化后CD 25 裂解的片段，它能以低亲和力结合IL-2，主要在T淋巴细胞激活、增殖时产生，由细胞膜释放入循环中，故我们推测由于HSP患儿PBMC的CD 25 表达量增高，相应的血液中SIL-2R的含量增高，IL-2与SIL-2R结合增多，从而导致游离的IL-2水平下降，这可能是HSP患儿IL-2下降的一个原因。
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3.3 凋亡 细胞增殖和凋亡间的动态平衡是维持机体自身稳定的必要条件，免疫细胞的凋亡过多或不足，必然干扰免疫系统的自身稳定。在特异性免疫调节中，Fas/FasL介导的凋亡途径起重要的作用，并且Fas/FasL介导的凋亡对成熟T细胞比未成熟的T细胞更为重要。当FasL与Fas结合后，可通过一系列的细胞凋亡信号传递途径介导Fas + 细胞凋亡 [15] 。有研究证实，靶细胞表面的MHC分子和抗原形成的复合物可刺激淋巴细胞TCR受体，使其表达Fas和FasL，诱导淋巴细胞凋亡 [17] 。这些研究表明:当T细胞与特异性抗原接触启动免疫应答的同时，也激活了Fas系统，诱导激活的淋巴细胞凋亡，起到调控免疫应答，维持免疫平衡的作用 [16] 。
我们的研究表明:HSP患儿PBMC的凋亡百分比较健康儿童明显降低，说明HSP患儿存在T淋巴细胞凋亡延迟。这可能是由于HSP患儿IL-2水平的降低使CTL、NK细胞的功能受抑制，清除抗原的能力降低，使体内抗原处于高水平状态，故T细胞凋亡主要是通过Fas/FasL等介导的主动凋亡途径;另外，由于IL-2水平降低使CTL、NK细胞的活化、增殖、分泌功能受到抑制，CTL、NK细胞的FasL的表达量减少，通过CTL、NK细胞作用于靶细胞并使其发生凋亡的途径减弱(即活化诱导的细胞死亡途径发生障碍)，引起活化的淋巴细胞凋亡延迟，从而导致增殖和凋亡之间的动态平衡被打破，特别是Th 2 类细胞大量增殖且凋亡延迟而引起的免疫功能紊乱可能是HSP的发病机制之一;另外，HSP患儿PBMC加用地塞米松作用后凋亡百分比明显增高，进一步说明地塞米松可通过促进T细胞凋亡，使增殖和凋亡趋于平衡而发挥作用。
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3.4 IL-2与凋亡、IL-4与活化的关系等 Refeali [18] 研究发现IL-2增强Fas途径介导的AICD，IL-2增加了FasL的转录和表达，并抑制FLIP(Fas信号抑制剂)的转录和表达，所以IL-2是一种潜在性的凋亡促进因子。在一次有效的免疫应答中，T淋巴细胞要经历活化期和增殖期，在活化期内，T细胞诱导表达IL-2及其受体IL-2R，IL-2与IL-2R结合后，启动T细胞周期的进程，T细胞进入增殖期，增殖的淋巴细胞易凋亡。IL-2最能提供T淋巴细胞对主动凋亡的敏感性，但T淋巴细胞是否发生凋亡还要取决于局部抗原水平，抗原水平高时，通过死亡因子途径发生主动凋亡，低时则通过线粒体途径发生被动凋亡，因而机体能在持续暴露在某一抗原时限制T细胞的不断扩增，避免产生过强的应答，亦能在应答末期减少扩增的T细胞数量，维持外周淋巴细胞数量的平衡。这种IL-2依赖性诱导活化细胞凋亡的机制如果受损则易发生免疫性疾病。我们的研究表明:HSP患儿IL-2水平与凋亡百分比之间存在线性相关关系，且呈正相关，说明IL-2水平越低凋亡百分比也越低，这可能是由于IL-2水平的下降，使得抗原水平高时不能通过死亡因子途径发生主动凋亡，因而使凋亡发生延迟。HSP患儿IL-4水平与CD 3 CD 25 表达量存在正相关关系，说明IL-4水平越高活化的T淋巴细胞越多。
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4 结论
HSP患儿存在PBMC的活化亢进，IL-2水平明显降低而IL-4水平明显升高，且凋亡延迟;IL-2水平越低T淋巴细胞凋亡越延迟;IL-4水平越高活化的T淋巴细胞越多;地塞米松可能是通过促进Th 1 、Th 2 细胞网络的平衡，抑制T淋巴细胞的活化及促进T淋巴细胞的凋亡发挥作用。
A图 B图
A:空白对照组，B:地塞米松组
图1 不同条件下HSP患儿PBMC中CD3 + 、CD3 + CD25 + 细胞的流式细胞仪分析
图图2 健康儿童PBMC中CD3 + 、CD3 + CD25 + 细胞的流式细胞仪分析图D图E
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图D:空白对照组，E:地塞米松组
图3 不同条件下HSP患儿PBMC凋亡百分比的流式细胞仪分析图
图4 健康儿童的PBMC凋亡百分比的流式细胞仪分析图
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作者单位:222500江苏省灌南县人民医院内科(系徐州医学院 研究生)
221000徐州医学院附属医院
(收稿日期:2004-02-16)
(编辑黄 杰), http://www.100md.com(季 平 卢思广 陈 军)