血小板活化膜表面糖蛋白检测在血栓性脑血管疾病的应用价值
【摘要】 目的 探讨血栓性脑血管疾病治疗前后血小板活化标记物CD62P、GPⅡb/Ⅲa的表达及其临床应用价值。方法 采用流式细胞仪(FCM)检测治疗前后血小板活化标记物CD62P、GPⅡb/Ⅲa的表达。结果 血栓性脑血管疾病患者治疗前血小板活化标志物CD62P、GPⅡb/Ⅲa分别为CD62P(52.19±12.37)%、GPⅡb/Ⅲa(77.98±14.22)%，较正常对照组CD62P(4.27±2.17)%、GPⅡb/Ⅲa(10.23±3.44)%有显著升高(P<0.01);治疗后CD62P(31.16±17.43)%GPⅡb/Ⅲa(40.71±11.64)%较治疗前有显著下降(P<0.01)但仍高于正常对照组(P<0.01)。结论 血小板活化在血栓性脑血管疾病的发病过程中起重要作用，其标志物CD62P，GPⅡb/Ⅲa对血栓性脑血管疾病患者的诊断具有重要价值，为临床症状缓解后长期药物预防提供了理论依据。
关键词 CD62P GPⅡb/Ⅲa 血栓性脑血管疾病 流式细胞术
, http://www.100md.com
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)04-0309-02
Clinical significane on detection of platelet activation CD62P，GPⅡb/Ⅲa
in patients with thrombotic cerebrovascular disease
Deng Xiaomei，Wang Chuanxin，Lu Zhenduo，et al.
Shandong University Qi Lu Hospital，Jinan250012.
【Abstract】 Objective To explore platelet activation glycoproteins on expression of active label CD62P，GPⅡb/Ⅲa and clinical significance in thromboticcerebrovascular diseases before and after treatment.Methods To detect platelet activation CD62P，GPⅡb/Ⅲa in thrombotic cerebrovascular diseases were used by technique of flow cytomeˉtry(FCM).Results Before treatment the platelet activation CD62P，GPⅡb/Ⅲa in thrombotic cerebrovascular disˉeases are(52.19±12.37)%，(77.98±14.22)%which are significantly higher than normal control CD62P(4.27±2.17)%GPⅡb/Ⅲa(10.23±3.44)%(P<0.01).After treatment CD62P(31.16±17.43)%GPⅡb/Ⅲa(40.71±11.64)%declined evidently than before treatment(P<0.01)，but also higher than normal control(P<0.01).Conclusion Platelet activation play a important role in the process of thrombotic cerebrovascular diseases，the glycoˉproteins CD62P，GPⅡb/Ⅲa have important diagnostic value in thrombotic cerebrovascular diseases and provide theoˉretical basis for prevention of thrombotic cerebrovascular diseases with long-term drug treatment.
, 百拇医药
Key words CD62P GPⅡb/Ⅲa thrombotic cerebrovascular diseases technique of flow cytometry
血小板在血栓性脑血管疾病发生发展过程中起重要作用，近年来发展的流式细胞术(FCM)为评价血小板在体内的活化程度提供了准确的特异性的指标 [1] 。本研究分别对血栓性脑血管疾病患者治疗前后的血小板活化标记物GPⅡb/Ⅲa、CD62P进行检测，为血栓性脑血管疾病患者诊断、治疗提供可靠的实验室数据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 单克隆抗体:PAC-1FITC为异硫氰酸荧光素标记的抗血小板活化GPⅡb/Ⅲa即纤维蛋白原受体(Fib-R)的McAb、CD62P PE为藻红蛋白标记的抗P-选择素的McAb、CD61PerCP为Peridinin chlorophyll protein标记的血小板糖蛋白Ⅲa的McAb(均购自美国BD公司)。同型对照:RGDS(PAC-1阻断剂)(购自美国sigma公司)、Mouseγ1PE为藻红蛋白标记的鼠IgG(购自美国BD公司)。其他:流式细胞仪三色校准微球CaliBRITE3Kit(美国BD公司);多聚甲醛(PFA)分析纯(天津科密欧化学试剂开发中心);PBS磷酸盐缓冲液，pH7.2(德国医学实验诊断有限公司);FACSFlow TM 鞘液(美国BD公司)。
, http://www.100md.com
1.2 仪器设备 FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司);Falcon上样管(美国BD公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 研究对象 血栓性脑血管疾病组:患者28例，年龄52±7岁，男17例，女11例，均符合全国第四届脑血管病会议制定的诊断标准 [2] 。治疗后组:28例患者经系统治疗2～3周后临床症状明显缓解。正常对照组:门诊健康查体30例，平均年龄45±7岁，男17例，女13例。体检正常，既往无心脑血管、高血压、糖尿病病史，测定前2周内未服用影响血小板功能的药物。
1.3.2 样本采集及制备 患者及正常对照均用枸橼酸钠抗凝采血管采集血样。不扎止血带，弃去前2ml混有组织液的血液，将剩余样本用枸橼酸钠抗凝，轻轻混匀，备用。脑血管病患者在入院系统治疗，临床症状明显缓解后再取血进行测定。将样本分别加入对照管和试验管各5μl，对照管内加入PAC-1FITC、RGDS、Mouseγ1PE、CD61PerCP各10μl;试验管加入PAC-1FITC、CD62P PE、CD61PerCP各10μl，轻轻混匀，避光室温孵育20min，立刻加入预冷2～8℃的1%多聚甲醛1ml并混匀，放置于2～8℃冰箱中30min，以上步骤均在1h内完成，以减少血小板体外活化。标本制备后必须在24h内检测完毕。
, 百拇医药
1.3.3 FCM检测 用荧光微球校准流式细胞仪后，在Cell Quest软件环境中，将流式细胞仪的前向角散射(FSC)、侧向角散射(SSC)三色荧光(FL1～FL3)的检测信号均设置为对数放大，以CD61PerCP/SSC双参数设门，检测对照管和试验管内血小板群中GPⅡb/Ⅲa与CD62P阳性血小板百分数。
1.4 统计学分析 数据以X±s表示，资料比较采用t检验，以P<0.05为差异有显著性的标准。
2 结果
脑血管疾病患者治疗前血小板活化标志物阳性表达率显著高于正常对照组(P<0.01)，治疗后较治疗前有明显下降(P<0.01)，但仍高于正常对照(P<0.01)，见表1。
表1脑血管疾病患者治疗前后及正常对照组血小板活化指标 (X±s)
, 百拇医药 注:与对照组比较 Δ P<0.01;与治疗前比较 ˇ P<0.01
3 讨论
血栓性脑血管疾病与动脉硬化的发生密切相关，由于动脉硬化的发生，使血管内皮细胞损伤，胶原暴露，促使血小板粘附，同时脑血管内的脂质斑块造成局部血流动力学改变，产生高切变力激活血小板，而且脂质斑块易发生溃破，脂质暴露于血液也可引起血小板活化 [3，4] 。血小板活化后，颗粒膜蛋白在质膜上高水平表达，引起GPⅡb/Ⅲa、CD62P的显著性改变。GPⅡb/Ⅲa分子主要是纤维蛋白原受体，血小板活化时GPⅡb/Ⅲa由受体-配体非结合状态变为受体-配体结合状态，从而形成血小板-纤维蛋白原-血小板结合状态，导致血小板聚集 [5] 。CD62P选择性的分布于静止血小板内的α-颗粒上，血小板活化后，α颗粒迅速与血小板膜融合并释放，使CD62P重新分布于血小板表面，所以CD62P在血小板表面的表达也是血小板活化的特异性标志物 [6] 。
, http://www.100md.com
本试验运用FCM测定血栓性脑血管疾病患者血小板 活化标志物GPⅡb/Ⅲa和CD62P，结果为CD62P和GPⅡb/Ⅲa的表达显著高于正常对照组，表明在脑血管疾病的发生发展过程中血小板活化起重要促进作用。治疗后临床症状缓解，血小板活化水平与治疗前相比明显降低，但仍高于正常对照组，其机制是由于动脉粥样斑块的形成，造成促使血小板活化的因素无法逆转，使得血小板长期处于活化状态，临床抗凝治疗能一定程度的降低血小板的活化，但不能完全消除致活化因素的作用，因此需要长期抗凝治疗预防血栓形成。血小板活化作为脑血管内血栓形成和梗塞的早期因素 [7，8] ，准确测定其活化标志物GPⅡb/Ⅲa和CD62P对血栓性脑血管疾病发生的诊断、预防、治疗效果、监测都有着重要意义，采用FCM和荧光标记的活化血小板单克隆抗体可直接敏感的反映病理状态下人体内血小板活化的程度，为临床症状缓解后进一步抗血小板治疗提供了理论依据。
参考文献
1 Ault KA.The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets.Semin-Hematol，2001，38(2):160-168.
, 百拇医药
2 中华医学会神经病学分会.脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准(1995).中华神经科杂志，1996，29(6):381-383.
3 Wu GX，Li FG，Li PX，et al.Detection of plasma alpha-granule memˉbrane protein(CD62P)using radiolabeled monoclonal antibodies in thrombotic disease.Haemostasis，1993，23:121-128.
4 Nomura S，Nakamura T，Cone J，et al.Cytometric analysis of high shear-induced platelet microparicles and effect of cytokines on microparticle generation.Cytometry，2000，40(3):173-181.
, http://www.100md.com
5 Paolo P，Pier GM.The humans platelet membrane glycoprotienⅡb/Ⅲa complex:a multifunctional adhesion receptor.Haematologiea，1992，77:162-168.
6 Stenberg PE，Mcever RP，Shuman MA，et al.A platelet alphegranule membrane protein(CD62P)is expressed on the plasma membrane after activation.J Cell Biol，1985，101:88.
7 Swiderek W，Kozubski C.Abnormalities in platelet membrane structure and function in Alzheimer’s diseases and ischemic stroke.Platelet，1997，8:125-133.
8 Grau AJ，Ruf A，Vogt A，et al.Increased fraction of circulating activated platelets in acute and previous cerebrovascular ischemia.Thromb Heamost，1998，80:298-301.
作者单位:250012山东大学齐鲁医院
(收稿日期:2003-11-17)
(编辑罗 彬), 百拇医药(邓小梅)
关键词 CD62P GPⅡb/Ⅲa 血栓性脑血管疾病 流式细胞术
, http://www.100md.com
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)04-0309-02
Clinical significane on detection of platelet activation CD62P，GPⅡb/Ⅲa
in patients with thrombotic cerebrovascular disease
Deng Xiaomei，Wang Chuanxin，Lu Zhenduo，et al.
Shandong University Qi Lu Hospital，Jinan250012.
【Abstract】 Objective To explore platelet activation glycoproteins on expression of active label CD62P，GPⅡb/Ⅲa and clinical significance in thromboticcerebrovascular diseases before and after treatment.Methods To detect platelet activation CD62P，GPⅡb/Ⅲa in thrombotic cerebrovascular diseases were used by technique of flow cytomeˉtry(FCM).Results Before treatment the platelet activation CD62P，GPⅡb/Ⅲa in thrombotic cerebrovascular disˉeases are(52.19±12.37)%，(77.98±14.22)%which are significantly higher than normal control CD62P(4.27±2.17)%GPⅡb/Ⅲa(10.23±3.44)%(P<0.01).After treatment CD62P(31.16±17.43)%GPⅡb/Ⅲa(40.71±11.64)%declined evidently than before treatment(P<0.01)，but also higher than normal control(P<0.01).Conclusion Platelet activation play a important role in the process of thrombotic cerebrovascular diseases，the glycoˉproteins CD62P，GPⅡb/Ⅲa have important diagnostic value in thrombotic cerebrovascular diseases and provide theoˉretical basis for prevention of thrombotic cerebrovascular diseases with long-term drug treatment.
, 百拇医药
Key words CD62P GPⅡb/Ⅲa thrombotic cerebrovascular diseases technique of flow cytometry
血小板在血栓性脑血管疾病发生发展过程中起重要作用，近年来发展的流式细胞术(FCM)为评价血小板在体内的活化程度提供了准确的特异性的指标 [1] 。本研究分别对血栓性脑血管疾病患者治疗前后的血小板活化标记物GPⅡb/Ⅲa、CD62P进行检测，为血栓性脑血管疾病患者诊断、治疗提供可靠的实验室数据。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 单克隆抗体:PAC-1FITC为异硫氰酸荧光素标记的抗血小板活化GPⅡb/Ⅲa即纤维蛋白原受体(Fib-R)的McAb、CD62P PE为藻红蛋白标记的抗P-选择素的McAb、CD61PerCP为Peridinin chlorophyll protein标记的血小板糖蛋白Ⅲa的McAb(均购自美国BD公司)。同型对照:RGDS(PAC-1阻断剂)(购自美国sigma公司)、Mouseγ1PE为藻红蛋白标记的鼠IgG(购自美国BD公司)。其他:流式细胞仪三色校准微球CaliBRITE3Kit(美国BD公司);多聚甲醛(PFA)分析纯(天津科密欧化学试剂开发中心);PBS磷酸盐缓冲液，pH7.2(德国医学实验诊断有限公司);FACSFlow TM 鞘液(美国BD公司)。
, http://www.100md.com
1.2 仪器设备 FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司);Falcon上样管(美国BD公司)。
1.3 实验方法
1.3.1 研究对象 血栓性脑血管疾病组:患者28例，年龄52±7岁，男17例，女11例，均符合全国第四届脑血管病会议制定的诊断标准 [2] 。治疗后组:28例患者经系统治疗2～3周后临床症状明显缓解。正常对照组:门诊健康查体30例，平均年龄45±7岁，男17例，女13例。体检正常，既往无心脑血管、高血压、糖尿病病史，测定前2周内未服用影响血小板功能的药物。
1.3.2 样本采集及制备 患者及正常对照均用枸橼酸钠抗凝采血管采集血样。不扎止血带，弃去前2ml混有组织液的血液，将剩余样本用枸橼酸钠抗凝，轻轻混匀，备用。脑血管病患者在入院系统治疗，临床症状明显缓解后再取血进行测定。将样本分别加入对照管和试验管各5μl，对照管内加入PAC-1FITC、RGDS、Mouseγ1PE、CD61PerCP各10μl;试验管加入PAC-1FITC、CD62P PE、CD61PerCP各10μl，轻轻混匀，避光室温孵育20min，立刻加入预冷2～8℃的1%多聚甲醛1ml并混匀，放置于2～8℃冰箱中30min，以上步骤均在1h内完成，以减少血小板体外活化。标本制备后必须在24h内检测完毕。
, 百拇医药
1.3.3 FCM检测 用荧光微球校准流式细胞仪后，在Cell Quest软件环境中，将流式细胞仪的前向角散射(FSC)、侧向角散射(SSC)三色荧光(FL1～FL3)的检测信号均设置为对数放大，以CD61PerCP/SSC双参数设门，检测对照管和试验管内血小板群中GPⅡb/Ⅲa与CD62P阳性血小板百分数。
1.4 统计学分析 数据以X±s表示，资料比较采用t检验，以P<0.05为差异有显著性的标准。
2 结果
脑血管疾病患者治疗前血小板活化标志物阳性表达率显著高于正常对照组(P<0.01)，治疗后较治疗前有明显下降(P<0.01)，但仍高于正常对照(P<0.01)，见表1。
表1脑血管疾病患者治疗前后及正常对照组血小板活化指标 (X±s)
, 百拇医药 注:与对照组比较 Δ P<0.01;与治疗前比较 ˇ P<0.01
3 讨论
血栓性脑血管疾病与动脉硬化的发生密切相关，由于动脉硬化的发生，使血管内皮细胞损伤，胶原暴露，促使血小板粘附，同时脑血管内的脂质斑块造成局部血流动力学改变，产生高切变力激活血小板，而且脂质斑块易发生溃破，脂质暴露于血液也可引起血小板活化 [3，4] 。血小板活化后，颗粒膜蛋白在质膜上高水平表达，引起GPⅡb/Ⅲa、CD62P的显著性改变。GPⅡb/Ⅲa分子主要是纤维蛋白原受体，血小板活化时GPⅡb/Ⅲa由受体-配体非结合状态变为受体-配体结合状态，从而形成血小板-纤维蛋白原-血小板结合状态，导致血小板聚集 [5] 。CD62P选择性的分布于静止血小板内的α-颗粒上，血小板活化后，α颗粒迅速与血小板膜融合并释放，使CD62P重新分布于血小板表面，所以CD62P在血小板表面的表达也是血小板活化的特异性标志物 [6] 。
, http://www.100md.com
本试验运用FCM测定血栓性脑血管疾病患者血小板 活化标志物GPⅡb/Ⅲa和CD62P，结果为CD62P和GPⅡb/Ⅲa的表达显著高于正常对照组，表明在脑血管疾病的发生发展过程中血小板活化起重要促进作用。治疗后临床症状缓解，血小板活化水平与治疗前相比明显降低，但仍高于正常对照组，其机制是由于动脉粥样斑块的形成，造成促使血小板活化的因素无法逆转，使得血小板长期处于活化状态，临床抗凝治疗能一定程度的降低血小板的活化，但不能完全消除致活化因素的作用，因此需要长期抗凝治疗预防血栓形成。血小板活化作为脑血管内血栓形成和梗塞的早期因素 [7，8] ，准确测定其活化标志物GPⅡb/Ⅲa和CD62P对血栓性脑血管疾病发生的诊断、预防、治疗效果、监测都有着重要意义，采用FCM和荧光标记的活化血小板单克隆抗体可直接敏感的反映病理状态下人体内血小板活化的程度，为临床症状缓解后进一步抗血小板治疗提供了理论依据。
参考文献
1 Ault KA.The clinical utility of flow cytometry in the study of platelets.Semin-Hematol，2001，38(2):160-168.
, 百拇医药
2 中华医学会神经病学分会.脑卒中患者临床神经功能缺损程度评分标准(1995).中华神经科杂志，1996，29(6):381-383.
3 Wu GX，Li FG，Li PX，et al.Detection of plasma alpha-granule memˉbrane protein(CD62P)using radiolabeled monoclonal antibodies in thrombotic disease.Haemostasis，1993，23:121-128.
4 Nomura S，Nakamura T，Cone J，et al.Cytometric analysis of high shear-induced platelet microparicles and effect of cytokines on microparticle generation.Cytometry，2000，40(3):173-181.
, http://www.100md.com
5 Paolo P，Pier GM.The humans platelet membrane glycoprotienⅡb/Ⅲa complex:a multifunctional adhesion receptor.Haematologiea，1992，77:162-168.
6 Stenberg PE，Mcever RP，Shuman MA，et al.A platelet alphegranule membrane protein(CD62P)is expressed on the plasma membrane after activation.J Cell Biol，1985，101:88.
7 Swiderek W，Kozubski C.Abnormalities in platelet membrane structure and function in Alzheimer’s diseases and ischemic stroke.Platelet，1997，8:125-133.
8 Grau AJ，Ruf A，Vogt A，et al.Increased fraction of circulating activated platelets in acute and previous cerebrovascular ischemia.Thromb Heamost，1998，80:298-301.
作者单位:250012山东大学齐鲁医院
(收稿日期:2003-11-17)
(编辑罗 彬), 百拇医药(邓小梅)