榄香烯诱导人胰腺癌BxPC-3细胞凋亡及对细胞周期阻滞的研究
【摘要】 目的 观察榄香烯对人胰腺癌BxPC-3细胞凋亡的影响。方法 我们运用DNA含量分析、电子显微镜成相、DNA琼胶电泳、Annexin V/PI双标记法检测等技术，对榄香烯对人胰腺癌BxPC-3细胞周期、细胞超微结构、DNA片段化降解、细胞凋亡比值和对bcl-2基因表达的影响等方面进行了研究。结果 (1)榄香烯作用胰腺癌细胞后，G 0 /G 1 细胞周期相对增多，G 2 /M期相对下降;(2)DNA含量分析法测定榄香烯3个剂量的凋亡率分别为25.3%、40.9%、51.1%(P<0.01);(3)Annexin V/PI双标记法检测提示:榄香烯对细胞的凋亡作用有一定的剂量依赖关系;(4)荧光显微镜下见3个剂量的榄香烯作用BxPC-3细胞均可见到凋亡细胞，电镜下可见明显细胞凋亡特征;(5)凋亡相关基因bcl-2蛋白表达量随着作用时间延长而逐渐降低。结论 榄香烯通过抑制胰腺癌bcl-2基因表达是诱导胰腺癌细胞凋亡的机制。
关键词 榄香烯 BxPC-3细胞 细胞凋亡 bcl-2
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)22-2031-07
Experimental studies on the effect of elemene on inducement apoptosis
and arrest of cell cycle in the BxPC-3cell of human pancreatic cancer
Fan Zhongze，Sun Jue，Li Qi，et al.
Central Hospital of PuTuo District，Shanghai200062.
Pu Tuo Clinical Medical School Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine.
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【Abstract】 The studies evaluated the effects of Elemene on BxPC cell cycle，ultrastructural cell，DNA ladder，percentage of apoptosis and expression of bcl-2gene by DNA content analysis，electron microscopy，DNA elecˉtrophoresis，Annexin V/PI.The results showed:(1)After the BxPC-3cell treated by Elemene，the G0 /G 1 in cell cyˉcle was increased and the G 2 /M cell was decreased.(2)Theapoptosis rate in three dose were25.3%，40.9%，51.1%，(P<0.01).(3)Accordingto Annexin V/PI，the effect of Elemene on apoptosis depend on dosage.(4)Accordˉing to DNA content analysis，the apoptosis change could be found in BxPC-3cell in three dose Elemene groups，unˉder electron microscopy the character of apoptosis also could be found.(5)By the time delayed，protein expression of bcl-2gene became lower.
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Key words elemene BxPC-3cell apoptosis bcl-2
在临床和体外细胞试验的基础上，我们运用DNA含量分析、电子显微镜成相、DNA琼胶电泳、Annexin V/PI双标记法检测等技术，了解榄香烯对人胰腺癌BxPC-3细胞周期、细胞超微结构、DNA片段化降解、细胞凋亡比值和对bcl-2基因表达的影响等方面进行了研究，以期阐明中药榄香烯对人胰腺癌的作用机制。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 榄香烯乳剂(Elemene，大连金港制药有限公司，批号:0012072);琼脂糖(Duchefa公司产品);小牛血清(杭州四季清生物公司产品);HEPES、PI(碘化丙锭)(德国merck产品);DNA marker、PRMI-1640培养基、谷氨酰胺(美国Gibco公司产品);蛋白酶K(PK)、EDTA、Triton-100(美国Amresco公司产品);Rnase A(Faizyme公司产品);Bcl-2抗体试剂盒(Biosource公司产品);Annexin V-FIF Kit试剂盒(Oncogene公司产品);PI染色液的配制:PI100μg/ml，0.02%Triton X-100，Rnase100μg/ml。PRMI-1640培养液的配制、细胞消化液的配制、PBS缓冲液(pH7.0)的配制(见第一部分)。
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1.2 主要实验仪器 光学显微镜(日本Olympus公司)，SPM-10A型数字酸度计(浙江萧山仪器标准件厂)，CO 2 细胞培养箱(德国Hereaus公司)，超净工作台(苏州净化仪器设备厂)，倒置相差显微镜(上海光学仪器厂)，KA-1000离心机(上海安亭科技仪器厂)，S-648恒温水浴箱(上海医疗器械七厂)，微量可调加样器(法国GLISON公司)，6孔、24孔培养板(丹麦NUNCLON公司)，HITACHIN-300透射电镜、HITACHIN-1200扫描电镜(日立公司)，倒置相差显微镜(上海光学仪器厂)，荧光显微镜(日本Olympus公司)，低温高速离心机(德国Heraeus公司)，流式细胞仪(FACSCalˉibur，Becton Dickison公司)，电泳仪(上海西巴斯生物技术开发公司)，紫外反射透射仪(上海天能公司)。
1.3 细胞株 人胰腺癌BxPC-3细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所。
1.4 方法
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1.4.1 细胞培养 人胰腺癌BxPC-3细胞培养同实验研究一(已另文发表)。
1.4.2 榄香烯对胰腺癌细胞周期的影响 采用DNA含量测定法检测榄香烯对胰腺癌细胞周期的影响:取对数生长期的细胞接种于24孔板，预培养24h后换新培养液，加不同浓度的榄香烯(详见结果表中)继续培养72h后，收集细胞，1000rpm离心5min，弃上清，pH7.4PBS液洗3次，制成细胞悬液(每份约10 6 细胞)，1体积细胞悬液加9体积预冷的70%乙醇于固定4℃24h，1000rpm离心5min，弃乙醇，加1ml1%的Triton-100室温下处理10min，离心弃上清，3ml PBS重悬5min，400目的筛网过滤1次，1000rpm离心5min，弃上清，加入100μg/ml Rnase，50μg/ml PI共1ml4℃避光染色30min，上流式细胞仪分析。
1.4.3 Annexin V标记法检测胰腺癌细胞凋亡 细胞接种于24孔板培养24h加榄香烯48h后→分别收集细胞，PBS洗3次→将细胞重悬于HEPES缓冲液中，调整细胞浓度为5×10 5 /ml→取细胞悬液98μl，加入Annexin V-FITC2μl，室温下共育10min→PBS洗1次→将细胞重悬于495μlHEPES缓冲液中→加5μl浓度为50μg/ml的PI→4℃避光孵育30min→流式细胞仪双参数分析，激发光波长为488nm，CelˉlQuest软件分析。
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1.4.4 荧光显微镜观察胰腺癌细胞的形态学变化 BxPC-3细胞常规培养，加不同浓度榄香烯48h后→收集各组细胞1500rpm×5min→2%多聚甲醛混悬固定，4℃保存待测→1500rpm×5min，弃上清→1%Hochest332581ml室温避光1h→PBS洗，1500rpm×5min，弃上清→PBS重悬→取细胞悬液15μl于载玻片上→盖载玻片→OLYMPUS BH荧光镜下观察、照相。
1.4.5 电子显微镜观察榄香烯对胰腺癌细胞超微结构的影响 (1)透射电镜观察:BxPC-3细胞常规培养，加不同浓度榄香烯48h后→收集各组细胞1500rpm×5min→2.5%戊二醛前固定(不混悬)→1%饿酸PBS(pH7.4)后固定→乙醇丙酮梯度脱水→Epon-812环氧树脂包埋→超薄切片、染色→HITACHIN-300透射电镜观察。(2)扫描电镜观察:收集各组细胞1500rpm×5min→PBS重悬后取50μl滴加于特制的载玻片上，每组设2个复片→白炽灯烘→滤纸吸干余液→2.5%戊二醛前固定(不混悬)→1%饿酸PBS(pH7.4)后固定→乙醇丙酮梯度脱水→Epon-812环氧树脂包埋→超薄切片、染色→HITACHIN-1200透射电镜观察。
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1.4.6 DNA琼脂糖凝胶电泳 具体步骤如下:(1)细胞DNA提取:用一步法抽提DNA:细胞培养加药作用72h→分别将细胞消化、收集，约1×10 6 ，PBS洗涤3遍→加入细胞裂解液200μl(50mM Tris-Cl、10mM EDTA、0.5%SDS)及PK2μl(100μg/ml)，50℃2h→加等体积氯仿异戊醇抽提(异戊醇:氯仿为1:24)，振荡混匀，4℃12000rpm离心10min→取上清另置新管，加1/10体积5MNaCl和3倍体积无水乙醇，混匀，4℃12000rpm离心10min→弃上清，75%乙醇洗1遍，4℃12000rpm离心10min，超净台晾干→加TE50μl溶解，加Rnase2μl(10mg/ml)，65℃水浴60min。(2)琼脂糖凝胶电泳:取抽提的DNA液12μl，加上样缓冲液2μl于1.5%琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，上样后电泳(100V，60min)。待溴酚蓝移出加样孔约5cm时，取出凝胶，在紫外灯下观察并拍照。
1.4.7 bcl-2基因表达的检测 细胞培养加10μg/ml剂量的榄香烯作用12，24，36，48h→收集各组细胞1500rpm×5min→2%多聚甲醛混悬固定4℃保存待测→离心，1500rpm×5min→2ml0.5%Tween-20(PBS室温现用现配)破膜20min→离心，1500rpm×5min→10ml PBS洗，离心，1500rpm×5min，去上清→分别加bcl-2单抗和同型对照抗体各10μl/样品→20min，室温，避光→直接加2ml0.1%Tween-20(PBS室温现用现配)5min→离心，1500rpm×5min→PBS洗，离心，1500rpm×5min→加PBS至300μl上机检测。
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1.5 统计学方法 数据以X±s表示，多样本比较以单因素方差分析，各组两两比较采用Newman-Keuls检验;组间比较用t检验。
2 结果
2.1 榄香烯对胰腺癌细胞周期的影响 榄香烯作用胰腺癌细胞后，细胞周期均受到不同程度的影响，G 0 /G 1 期细胞比例相对增多，除低剂量的榄香烯(5μg/ml)与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)，其他两个剂量的榄香烯作用胰腺癌细胞后G 0 /G 1 期细胞比例显著增加，(P<0.01);而G 2 /M期相对下降。提示榄香烯通过G 0 /G 1 期阻滞抑制胰腺癌细胞的生长。DNA含量分析法测定3剂量的凋亡率分别为25.3%、40.9%、51.1%左右，3个剂量的凋亡率差异有显著性(P<0.01)，提示榄香烯对细胞的凋亡作用呈剂量依赖性。而正常细胞的凋亡率(对照组)为4%左右，见表1，图1～4。
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表1 榄香烯对BxPC-3细胞周期的影响
注:G 0 /G 1 :P>0.05， a vs对照组;P<0.01， b vs对照组;P<0.05， c vs5μg/ml，10μg/ml组;S:P>0.05， d vs对照组;P<0.05， e vs其他3组;G 2 M:P>0.05， f vs对照组;P<0.05， g vs vs其他2组;凋亡率:P<0.01，4组任意两两比较。
图1 榄香烯5μg/ml组
图2 榄香烯10μg/ml组
图3 榄香烯20μg/ml组
图4 对照组
2.2 Annexin V标记法检测胰腺癌细胞凋亡 细胞凋亡的早期即开始出现磷脂酰丝氨酸(PS)残基的暴露(自胞膜内层转移至外层) [1] ，Annexin V能特异而高亲和力地与PS结合，因而凋亡细胞表现为Annexin V标记阳性，而PI染色阴性，坏死细胞已失去胞膜的完整性，Annexin V，PI标记均阳性，可与凋亡细胞鉴别。三个剂量的均能增加凋亡胰腺癌细胞的比例，随着剂量的增加，凋亡胰腺癌细胞的比例3个剂量的凋亡率差异有显著性(P<0.01)，提示榄香烯对细胞的凋亡作用有一定的剂量依赖关系。而正常细胞的凋亡率(对照组)为4%左右，组见表2、图5～8。
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表2 Annexin V检测榄香烯对BxPC-3细胞凋亡率
注:经方差分析，P<0.01(任意两组两两比较)
2.3 荧光显微镜观察榄香烯对胰腺癌细胞的形态学变化 荧光显微镜下未加药物的BxPC-3细胞(对照组)未见凋亡细胞，细胞核呈弥漫均匀的绿色荧光染色:10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml剂量的榄香烯作用于人胰腺癌BxPC-3细胞，均可见凋亡细胞，表现为胞核或胞质内可见致密的颗粒荧光及块状荧光(凝聚、破碎的染色质)。见图9～12。
2.4 榄香烯对胰腺癌细胞超微结构的影响 未经药物作用的胰腺癌细胞透射电镜见胞质密度高，细胞器正常，核常规则或不规则，核仁较大;扫描电镜表现为细胞表面有许多突起的颗粒，胞膜结构完整。经榄香烯药物作用胰腺癌细胞，可见明显的凋亡特征:透射电镜表现:为细胞皱缩，体积缩小、皱缩、形态不规则，胞膜绒毛结构消失，胞核固缩，细胞内出现空泡，染色质或浓集于核中央呈团块状，或呈新月体状，凋亡小体形成。扫描电镜表现为细胞呈不规则形状，胞膜结构失去完整性，细胞表面有许多泡状突起见图13～18。
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2.5 DNA凝胶电泳 不同剂量榄香烯作用于胰腺癌细胞24h，20μg/ml以上浓度的出现明显的DNA“梯子”(DNA ladˉder)。而未经药物作用的细胞DNA ladder不明显。(见图19)。
图6 5μg/ml榄香烯组
图5 对照组
图8 20μg/ml榄香烯组
图7 μg/ml榄香烯组
注:四格图中左下格Annexin V(-)/PI(-)，代表正常活细胞;右下格Annexin V(+)/PI(-)，代表胞膜完整的凋亡细胞;右上格Annexin V(+)/PI(+)，代表胞膜已破损的坏死细胞;左上格Annexin V(-)/PI(+)，为细胞消化、收集过程中胞膜完整性受损的细胞。
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细胞凋亡率:
图5.对照组2.25%;
图6.5μg/ml榄香烯组19.46%、
图7.10μg/ml榄香烯组31.65%;
图8.20μg/ml榄香烯组43.7%。
图9 正常胰腺癌细胞荧光照片×400
图10 经10μg/ml榄香烯作用的胰腺癌细胞×4
00图11 经20μg/ml榄香烯作用的胰腺癌细胞×400
图12 经40μg/ml榄香烯作用的胰腺癌细胞×400
, 百拇医药 图13 空白组透射电镜照片(×5000)
图14(×5000)
图15 (×4000)
图16(×6000)
图17 对照组扫描电镜(×2000)
图18 榄香烯组扫描电镜
注:图13:未经药物作用的胰腺癌细胞多表现为胞质密度高，细胞器正常，核常规则或不规则，核仁大，凋亡小体少见。
图14:细胞胞质细胞器完好，核内染色质凝聚外突，趋向凋亡小体形成;
图15:细胞染色质凝集，胞质基质溶解、出现空泡，为凋亡小体形成早期。
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图16:电镜观察经榄香烯作用72h，部分细胞膜完整、体积缩小、皱缩、形态不规则，细胞内出现空泡，凋亡小体形成;
图17:对照组扫描电镜细胞表面有许多突起的颗粒，胞膜结构完整。
图18:对照组扫描电镜细胞呈不规则形状，胞膜结构失去完整性，细胞表面有许多泡状突起。
图19 榄香烯作用胰腺癌细胞24h DNA Ladder
2.6 榄香烯对胰腺癌细胞bcl-2基因表达的影响 10μg/ml剂量的榄香烯作用BxPC-3细胞12、24、36、48h后，凋亡相关基因bcl-2蛋白的表达见表3。除作用12h的bcl-2的表达量与对照组比较无差异(P>0.05)，24、36、48h的bcl-2的表达量显著低于对照组，且bcl-2蛋白表达量随着作用时间的延长而逐渐减低(P<0.01)，见图20～24。
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表3 榄香烯10μg/ml对BxPC-3细胞bcl-2 蛋白表达的影响
注:P>0.05， a vs12h组;P<0.01， a vs12h，36h，48h组;P<0.05，12h组，24h，36h，48h组任意两组比较图20 图21图22 图23图24
图20～24 榄香烯对BxPC-3细胞bcl-2蛋白表达的流式细胞图
注:图20:空白组平均荧光强度81.36±0.031
图21:12h平均荧光强度79.23±0.010
图22:24h平均荧光强度70.16±0.026
图23:36h平均荧光强度65.24±0.036
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图24:48h平均荧光强度54.45±0.040
3 讨论
既往研究认为，肿瘤生长迅速的原因是由于肿瘤细胞增殖较快及失去控制，而增殖较快是由于肿瘤细胞的细胞周期较短。近年研究发现情况并非如此，因为绝大多数肿瘤细胞的细胞周期，不仅不比它们相应正常细胞短，而是相同或更长。正常细胞在G 1 进入S期、G 2 进入M期处有控制点，若细胞DNA出现不正常，细胞周期可在该处被阻滞;若细胞DNA的损害较轻，可通过内切酶等修补后再继续前进;若DNA损害严重，不能被修补，则通过基因调控下的细胞凋亡而自毁。而肿瘤细胞则不具备这种控制作用，DNA异常的细胞仍能繁殖。因此，肿瘤增殖较快的原因是由于肿瘤细胞的无限制增殖，且细胞的死亡相对或绝对减少所致。所以根据这些因素，肿瘤的治疗可采用诱导细胞凋亡疗法、限制肿瘤细胞进入细胞周期以及在某一细胞周期特异地将其杀死或诱导其向正常分化的诱导分化疗法。
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生理情况下，胚胎时期细胞不断增殖并逐渐分化，最后成熟于某一阶段。细胞增殖核抗原(PCNA)是一种与细胞增殖关系密切的核蛋白 [2，3] ，在人类各种恶性肿瘤中能稳定地表达，但在正常组织中不表达或仅有十分微弱的表达。在静止期细胞，其量很少，G 1 晚期开始增加，S期达到高峰，G 2 、M期明显下降，是评价细胞增殖状态和分化程度的一个指标 [4，5] 。当细胞无限制增殖时即可形成肿瘤，所以可从PCNA表达来分析细胞增殖程度，从而了解肿瘤发生、发展及预后情况。第一部分的实验结果结果显示榄香烯作用后癌细胞内PCNA标记指数较对照组明显下降，G 0 /G 1 期细胞比例相对增多，提示癌细胞较多被阻滞于G 1 期，表达干扰了其细胞周期，抑制了癌细胞的增殖，而抑制PCNA的合成可能是影响细胞周期机制之一。
肿瘤的发生发展不仅是细胞增殖失控的结果，也是由于细胞凋亡受阻，即细胞增殖与凋亡的失衡决定了肿瘤的生长速率。除了大剂量化疗、放疗可能引起细胞坏死外，一般抗癌药物、激素制剂、放疗等的作用机制之一，都是通过诱导各自敏感的细胞发生凋亡来达到治疗目的。凋亡不仅直接影响着机体组织的正常发育、分化与死亡，它在肿瘤治疗中的作用也已受到极大的重视 [6，7] 。在本研究中也发现，榄香烯作用胰腺癌细胞后，荧光显微镜下观察到部分胰腺癌细胞出现凋亡形态学变化。因此，我们继续采用DNA电泳、原位缺口末端标记、流式细胞仪等手段对榄香烯诱导胰腺癌癌细胞凋亡进行了进一步定性、定量分析。结果表明榄香烯可有效诱导胰腺癌细胞凋亡。
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本研究采用了电子显微镜、DNA含量的FCM分析、Anˉnexin V标记的FCM分析三种方法相结合检测凋亡。细胞凋亡检测方法有很多种，单一任何一种方法都有一定局限性。最初是用光镜观察凋亡细胞形态，但与坏死细胞难以区别;电镜观察是目前确定凋亡形态学的最佳定性方法，但成本较高，不能定性;DNA电泳是判断细胞有无凋亡发生的简便方法，曾被认为是最具特征性的，但现在否定了这一看法，特征性的180～200bp的DNA梯带的出现非凋亡所特有，而且电泳法只能进行半定量;FCM分析则可在短时间内测定大量的细胞，作定量检测，PI染色DNA含量FCM分析为常用的检测方法，并可同时检测非凋亡细胞的周期分布。细胞凋亡时DNA断裂，断裂的小片段易从细胞内释出而使凋亡细胞的DNA含量低于正常细胞，以亲DNA染料PI处理细胞后再用FCM分析，G 0 /G 1 期前的亚G 1 峰则可反映凋亡细胞的多少。但此法有一定的漏检率:(1)部分细胞处于凋亡早期，虽已有DNA断裂点出现，但尚未出现DNA片段的丢失，未进入亚G 1 峰所在区域;(2)亚G 1 峰主要体现G 1 期细胞的DNA丢失，处于S期或G 2 /M期的细胞凋亡时凋亡峰隐含于正常的细胞周期中。Annexin X标记FCM分析法检测凋亡则更为客观、精确、能检测到早期凋亡细胞并能区分坏死细胞 [8] ，用于定量分析更具优越性。Annexin V标记法显示榄香烯20μg/ml48h诱导的胰腺癌细胞凋亡率为43.7±2.18%，电镜也证实了经榄香烯处理的细胞中存在凋亡细胞。DNA含量测定则显示中药血清作用使细胞周期阻滞于G 0 /G 1 期。而MTT法显示榄香烯作用48h对胰腺癌细胞的生长抑制率为35.81±3.70%，可能因此时凋亡细胞多处于早期，仍保留活细胞的功能，致使MTT法检测的抑制率偏低。
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bcl-2基因家族是细胞凋亡的抑制基因，随着肿瘤分子生物学的发展，对bcl-2基因在肿瘤的发生发展中地位和作用越来越受到关注。许多肿瘤患者及一些肿瘤细胞株高表达bcl-2，同时体外细胞实验证实bcl-2高表达抑制和阻断多种因素所促发的细胞凋亡，明显延长肿瘤细胞生存时间 [9] 。bcl-2基因家族中某些成分是目前研究较多、bcl-2与线虫C.elegans ced-9基因同源，也是作用较为肯定的抗凋亡蛋白 [10，11] 。bcl-2蛋白位于质膜内表面，核周膜及内质网和线粒体内膜上 [12～14] ，实验表明bcl-2并不是加速细胞分裂，而是促进细胞生存，即bcl-2基因产物并不改变细胞增殖速度，而是通过抵抗程序化S死亡细胞死亡，延长细胞寿命，导致细胞数目增加。
我们的实验表明结果发现榄香烯作用胰腺癌细胞，细胞生长收到抑制，细胞周期阻滞在G 0 /G 1 期，并明显的细胞凋亡，PCNA的表达下降，下调bcl-2的表达。通过胰腺癌诱导细胞凋亡、降低PCNA的表达，阻滞细胞周期于G 0 /G 1 期发挥抗癌，而通过抑制胰腺癌bcl-2基因表达是其诱导胰腺癌凋亡的机制之一。
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基金项目:上海市科委资助课题(编号:004019078)
作者单位:200062上海市普陀区中心医院，
上海中医药大学普陀临床医学院
(编辑使 臻), http://www.100md.com(范忠泽 孙 珏 李 琦 朱美华)
关键词 榄香烯 BxPC-3细胞 细胞凋亡 bcl-2
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Pu Tuo Clinical Medical School Affiliated to Shanghai University of Traditional Chinese Medicine.
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【Abstract】 The studies evaluated the effects of Elemene on BxPC cell cycle，ultrastructural cell，DNA ladder，percentage of apoptosis and expression of bcl-2gene by DNA content analysis，electron microscopy，DNA elecˉtrophoresis，Annexin V/PI.The results showed:(1)After the BxPC-3cell treated by Elemene，the G0 /G 1 in cell cyˉcle was increased and the G 2 /M cell was decreased.(2)Theapoptosis rate in three dose were25.3%，40.9%，51.1%，(P<0.01).(3)Accordingto Annexin V/PI，the effect of Elemene on apoptosis depend on dosage.(4)Accordˉing to DNA content analysis，the apoptosis change could be found in BxPC-3cell in three dose Elemene groups，unˉder electron microscopy the character of apoptosis also could be found.(5)By the time delayed，protein expression of bcl-2gene became lower.
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Key words elemene BxPC-3cell apoptosis bcl-2
在临床和体外细胞试验的基础上，我们运用DNA含量分析、电子显微镜成相、DNA琼胶电泳、Annexin V/PI双标记法检测等技术，了解榄香烯对人胰腺癌BxPC-3细胞周期、细胞超微结构、DNA片段化降解、细胞凋亡比值和对bcl-2基因表达的影响等方面进行了研究，以期阐明中药榄香烯对人胰腺癌的作用机制。
1 材料与方法
1.1 药物与试剂 榄香烯乳剂(Elemene，大连金港制药有限公司，批号:0012072);琼脂糖(Duchefa公司产品);小牛血清(杭州四季清生物公司产品);HEPES、PI(碘化丙锭)(德国merck产品);DNA marker、PRMI-1640培养基、谷氨酰胺(美国Gibco公司产品);蛋白酶K(PK)、EDTA、Triton-100(美国Amresco公司产品);Rnase A(Faizyme公司产品);Bcl-2抗体试剂盒(Biosource公司产品);Annexin V-FIF Kit试剂盒(Oncogene公司产品);PI染色液的配制:PI100μg/ml，0.02%Triton X-100，Rnase100μg/ml。PRMI-1640培养液的配制、细胞消化液的配制、PBS缓冲液(pH7.0)的配制(见第一部分)。
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1.2 主要实验仪器 光学显微镜(日本Olympus公司)，SPM-10A型数字酸度计(浙江萧山仪器标准件厂)，CO 2 细胞培养箱(德国Hereaus公司)，超净工作台(苏州净化仪器设备厂)，倒置相差显微镜(上海光学仪器厂)，KA-1000离心机(上海安亭科技仪器厂)，S-648恒温水浴箱(上海医疗器械七厂)，微量可调加样器(法国GLISON公司)，6孔、24孔培养板(丹麦NUNCLON公司)，HITACHIN-300透射电镜、HITACHIN-1200扫描电镜(日立公司)，倒置相差显微镜(上海光学仪器厂)，荧光显微镜(日本Olympus公司)，低温高速离心机(德国Heraeus公司)，流式细胞仪(FACSCalˉibur，Becton Dickison公司)，电泳仪(上海西巴斯生物技术开发公司)，紫外反射透射仪(上海天能公司)。
1.3 细胞株 人胰腺癌BxPC-3细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所。
1.4 方法
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1.4.1 细胞培养 人胰腺癌BxPC-3细胞培养同实验研究一(已另文发表)。
1.4.2 榄香烯对胰腺癌细胞周期的影响 采用DNA含量测定法检测榄香烯对胰腺癌细胞周期的影响:取对数生长期的细胞接种于24孔板，预培养24h后换新培养液，加不同浓度的榄香烯(详见结果表中)继续培养72h后，收集细胞，1000rpm离心5min，弃上清，pH7.4PBS液洗3次，制成细胞悬液(每份约10 6 细胞)，1体积细胞悬液加9体积预冷的70%乙醇于固定4℃24h，1000rpm离心5min，弃乙醇，加1ml1%的Triton-100室温下处理10min，离心弃上清，3ml PBS重悬5min，400目的筛网过滤1次，1000rpm离心5min，弃上清，加入100μg/ml Rnase，50μg/ml PI共1ml4℃避光染色30min，上流式细胞仪分析。
1.4.3 Annexin V标记法检测胰腺癌细胞凋亡 细胞接种于24孔板培养24h加榄香烯48h后→分别收集细胞，PBS洗3次→将细胞重悬于HEPES缓冲液中，调整细胞浓度为5×10 5 /ml→取细胞悬液98μl，加入Annexin V-FITC2μl，室温下共育10min→PBS洗1次→将细胞重悬于495μlHEPES缓冲液中→加5μl浓度为50μg/ml的PI→4℃避光孵育30min→流式细胞仪双参数分析，激发光波长为488nm，CelˉlQuest软件分析。
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1.4.4 荧光显微镜观察胰腺癌细胞的形态学变化 BxPC-3细胞常规培养，加不同浓度榄香烯48h后→收集各组细胞1500rpm×5min→2%多聚甲醛混悬固定，4℃保存待测→1500rpm×5min，弃上清→1%Hochest332581ml室温避光1h→PBS洗，1500rpm×5min，弃上清→PBS重悬→取细胞悬液15μl于载玻片上→盖载玻片→OLYMPUS BH荧光镜下观察、照相。
1.4.5 电子显微镜观察榄香烯对胰腺癌细胞超微结构的影响 (1)透射电镜观察:BxPC-3细胞常规培养，加不同浓度榄香烯48h后→收集各组细胞1500rpm×5min→2.5%戊二醛前固定(不混悬)→1%饿酸PBS(pH7.4)后固定→乙醇丙酮梯度脱水→Epon-812环氧树脂包埋→超薄切片、染色→HITACHIN-300透射电镜观察。(2)扫描电镜观察:收集各组细胞1500rpm×5min→PBS重悬后取50μl滴加于特制的载玻片上，每组设2个复片→白炽灯烘→滤纸吸干余液→2.5%戊二醛前固定(不混悬)→1%饿酸PBS(pH7.4)后固定→乙醇丙酮梯度脱水→Epon-812环氧树脂包埋→超薄切片、染色→HITACHIN-1200透射电镜观察。
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1.4.6 DNA琼脂糖凝胶电泳 具体步骤如下:(1)细胞DNA提取:用一步法抽提DNA:细胞培养加药作用72h→分别将细胞消化、收集，约1×10 6 ，PBS洗涤3遍→加入细胞裂解液200μl(50mM Tris-Cl、10mM EDTA、0.5%SDS)及PK2μl(100μg/ml)，50℃2h→加等体积氯仿异戊醇抽提(异戊醇:氯仿为1:24)，振荡混匀，4℃12000rpm离心10min→取上清另置新管，加1/10体积5MNaCl和3倍体积无水乙醇，混匀，4℃12000rpm离心10min→弃上清，75%乙醇洗1遍，4℃12000rpm离心10min，超净台晾干→加TE50μl溶解，加Rnase2μl(10mg/ml)，65℃水浴60min。(2)琼脂糖凝胶电泳:取抽提的DNA液12μl，加上样缓冲液2μl于1.5%琼脂糖凝胶(含EB0.5μg/ml)，上样后电泳(100V，60min)。待溴酚蓝移出加样孔约5cm时，取出凝胶，在紫外灯下观察并拍照。
1.4.7 bcl-2基因表达的检测 细胞培养加10μg/ml剂量的榄香烯作用12，24，36，48h→收集各组细胞1500rpm×5min→2%多聚甲醛混悬固定4℃保存待测→离心，1500rpm×5min→2ml0.5%Tween-20(PBS室温现用现配)破膜20min→离心，1500rpm×5min→10ml PBS洗，离心，1500rpm×5min，去上清→分别加bcl-2单抗和同型对照抗体各10μl/样品→20min，室温，避光→直接加2ml0.1%Tween-20(PBS室温现用现配)5min→离心，1500rpm×5min→PBS洗，离心，1500rpm×5min→加PBS至300μl上机检测。
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1.5 统计学方法 数据以X±s表示，多样本比较以单因素方差分析，各组两两比较采用Newman-Keuls检验;组间比较用t检验。
2 结果
2.1 榄香烯对胰腺癌细胞周期的影响 榄香烯作用胰腺癌细胞后，细胞周期均受到不同程度的影响，G 0 /G 1 期细胞比例相对增多，除低剂量的榄香烯(5μg/ml)与对照组比较，差异无显著性(P>0.05)，其他两个剂量的榄香烯作用胰腺癌细胞后G 0 /G 1 期细胞比例显著增加，(P<0.01);而G 2 /M期相对下降。提示榄香烯通过G 0 /G 1 期阻滞抑制胰腺癌细胞的生长。DNA含量分析法测定3剂量的凋亡率分别为25.3%、40.9%、51.1%左右，3个剂量的凋亡率差异有显著性(P<0.01)，提示榄香烯对细胞的凋亡作用呈剂量依赖性。而正常细胞的凋亡率(对照组)为4%左右，见表1，图1～4。
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表1 榄香烯对BxPC-3细胞周期的影响
注:G 0 /G 1 :P>0.05， a vs对照组;P<0.01， b vs对照组;P<0.05， c vs5μg/ml，10μg/ml组;S:P>0.05， d vs对照组;P<0.05， e vs其他3组;G 2 M:P>0.05， f vs对照组;P<0.05， g vs vs其他2组;凋亡率:P<0.01，4组任意两两比较。
图1 榄香烯5μg/ml组
图2 榄香烯10μg/ml组
图3 榄香烯20μg/ml组
图4 对照组
2.2 Annexin V标记法检测胰腺癌细胞凋亡 细胞凋亡的早期即开始出现磷脂酰丝氨酸(PS)残基的暴露(自胞膜内层转移至外层) [1] ，Annexin V能特异而高亲和力地与PS结合，因而凋亡细胞表现为Annexin V标记阳性，而PI染色阴性，坏死细胞已失去胞膜的完整性，Annexin V，PI标记均阳性，可与凋亡细胞鉴别。三个剂量的均能增加凋亡胰腺癌细胞的比例，随着剂量的增加，凋亡胰腺癌细胞的比例3个剂量的凋亡率差异有显著性(P<0.01)，提示榄香烯对细胞的凋亡作用有一定的剂量依赖关系。而正常细胞的凋亡率(对照组)为4%左右，组见表2、图5～8。
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表2 Annexin V检测榄香烯对BxPC-3细胞凋亡率
注:经方差分析，P<0.01(任意两组两两比较)
2.3 荧光显微镜观察榄香烯对胰腺癌细胞的形态学变化 荧光显微镜下未加药物的BxPC-3细胞(对照组)未见凋亡细胞，细胞核呈弥漫均匀的绿色荧光染色:10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml剂量的榄香烯作用于人胰腺癌BxPC-3细胞，均可见凋亡细胞，表现为胞核或胞质内可见致密的颗粒荧光及块状荧光(凝聚、破碎的染色质)。见图9～12。
2.4 榄香烯对胰腺癌细胞超微结构的影响 未经药物作用的胰腺癌细胞透射电镜见胞质密度高，细胞器正常，核常规则或不规则，核仁较大;扫描电镜表现为细胞表面有许多突起的颗粒，胞膜结构完整。经榄香烯药物作用胰腺癌细胞，可见明显的凋亡特征:透射电镜表现:为细胞皱缩，体积缩小、皱缩、形态不规则，胞膜绒毛结构消失，胞核固缩，细胞内出现空泡，染色质或浓集于核中央呈团块状，或呈新月体状，凋亡小体形成。扫描电镜表现为细胞呈不规则形状，胞膜结构失去完整性，细胞表面有许多泡状突起见图13～18。
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2.5 DNA凝胶电泳 不同剂量榄香烯作用于胰腺癌细胞24h，20μg/ml以上浓度的出现明显的DNA“梯子”(DNA ladˉder)。而未经药物作用的细胞DNA ladder不明显。(见图19)。
图6 5μg/ml榄香烯组
图5 对照组
图8 20μg/ml榄香烯组
图7 μg/ml榄香烯组
注:四格图中左下格Annexin V(-)/PI(-)，代表正常活细胞;右下格Annexin V(+)/PI(-)，代表胞膜完整的凋亡细胞;右上格Annexin V(+)/PI(+)，代表胞膜已破损的坏死细胞;左上格Annexin V(-)/PI(+)，为细胞消化、收集过程中胞膜完整性受损的细胞。
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细胞凋亡率:
图5.对照组2.25%;
图6.5μg/ml榄香烯组19.46%、
图7.10μg/ml榄香烯组31.65%;
图8.20μg/ml榄香烯组43.7%。
图9 正常胰腺癌细胞荧光照片×400
图10 经10μg/ml榄香烯作用的胰腺癌细胞×4
00图11 经20μg/ml榄香烯作用的胰腺癌细胞×400
图12 经40μg/ml榄香烯作用的胰腺癌细胞×400
, 百拇医药 图13 空白组透射电镜照片(×5000)
图14(×5000)
图15 (×4000)
图16(×6000)
图17 对照组扫描电镜(×2000)
图18 榄香烯组扫描电镜
注:图13:未经药物作用的胰腺癌细胞多表现为胞质密度高，细胞器正常，核常规则或不规则，核仁大，凋亡小体少见。
图14:细胞胞质细胞器完好，核内染色质凝聚外突，趋向凋亡小体形成;
图15:细胞染色质凝集，胞质基质溶解、出现空泡，为凋亡小体形成早期。
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图16:电镜观察经榄香烯作用72h，部分细胞膜完整、体积缩小、皱缩、形态不规则，细胞内出现空泡，凋亡小体形成;
图17:对照组扫描电镜细胞表面有许多突起的颗粒，胞膜结构完整。
图18:对照组扫描电镜细胞呈不规则形状，胞膜结构失去完整性，细胞表面有许多泡状突起。
图19 榄香烯作用胰腺癌细胞24h DNA Ladder
2.6 榄香烯对胰腺癌细胞bcl-2基因表达的影响 10μg/ml剂量的榄香烯作用BxPC-3细胞12、24、36、48h后，凋亡相关基因bcl-2蛋白的表达见表3。除作用12h的bcl-2的表达量与对照组比较无差异(P>0.05)，24、36、48h的bcl-2的表达量显著低于对照组，且bcl-2蛋白表达量随着作用时间的延长而逐渐减低(P<0.01)，见图20～24。
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表3 榄香烯10μg/ml对BxPC-3细胞bcl-2 蛋白表达的影响
注:P>0.05， a vs12h组;P<0.01， a vs12h，36h，48h组;P<0.05，12h组，24h，36h，48h组任意两组比较图20 图21图22 图23图24
图20～24 榄香烯对BxPC-3细胞bcl-2蛋白表达的流式细胞图
注:图20:空白组平均荧光强度81.36±0.031
图21:12h平均荧光强度79.23±0.010
图22:24h平均荧光强度70.16±0.026
图23:36h平均荧光强度65.24±0.036
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图24:48h平均荧光强度54.45±0.040
3 讨论
既往研究认为，肿瘤生长迅速的原因是由于肿瘤细胞增殖较快及失去控制，而增殖较快是由于肿瘤细胞的细胞周期较短。近年研究发现情况并非如此，因为绝大多数肿瘤细胞的细胞周期，不仅不比它们相应正常细胞短，而是相同或更长。正常细胞在G 1 进入S期、G 2 进入M期处有控制点，若细胞DNA出现不正常，细胞周期可在该处被阻滞;若细胞DNA的损害较轻，可通过内切酶等修补后再继续前进;若DNA损害严重，不能被修补，则通过基因调控下的细胞凋亡而自毁。而肿瘤细胞则不具备这种控制作用，DNA异常的细胞仍能繁殖。因此，肿瘤增殖较快的原因是由于肿瘤细胞的无限制增殖，且细胞的死亡相对或绝对减少所致。所以根据这些因素，肿瘤的治疗可采用诱导细胞凋亡疗法、限制肿瘤细胞进入细胞周期以及在某一细胞周期特异地将其杀死或诱导其向正常分化的诱导分化疗法。
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生理情况下，胚胎时期细胞不断增殖并逐渐分化，最后成熟于某一阶段。细胞增殖核抗原(PCNA)是一种与细胞增殖关系密切的核蛋白 [2，3] ，在人类各种恶性肿瘤中能稳定地表达，但在正常组织中不表达或仅有十分微弱的表达。在静止期细胞，其量很少，G 1 晚期开始增加，S期达到高峰，G 2 、M期明显下降，是评价细胞增殖状态和分化程度的一个指标 [4，5] 。当细胞无限制增殖时即可形成肿瘤，所以可从PCNA表达来分析细胞增殖程度，从而了解肿瘤发生、发展及预后情况。第一部分的实验结果结果显示榄香烯作用后癌细胞内PCNA标记指数较对照组明显下降，G 0 /G 1 期细胞比例相对增多，提示癌细胞较多被阻滞于G 1 期，表达干扰了其细胞周期，抑制了癌细胞的增殖，而抑制PCNA的合成可能是影响细胞周期机制之一。
肿瘤的发生发展不仅是细胞增殖失控的结果，也是由于细胞凋亡受阻，即细胞增殖与凋亡的失衡决定了肿瘤的生长速率。除了大剂量化疗、放疗可能引起细胞坏死外，一般抗癌药物、激素制剂、放疗等的作用机制之一，都是通过诱导各自敏感的细胞发生凋亡来达到治疗目的。凋亡不仅直接影响着机体组织的正常发育、分化与死亡，它在肿瘤治疗中的作用也已受到极大的重视 [6，7] 。在本研究中也发现，榄香烯作用胰腺癌细胞后，荧光显微镜下观察到部分胰腺癌细胞出现凋亡形态学变化。因此，我们继续采用DNA电泳、原位缺口末端标记、流式细胞仪等手段对榄香烯诱导胰腺癌癌细胞凋亡进行了进一步定性、定量分析。结果表明榄香烯可有效诱导胰腺癌细胞凋亡。
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本研究采用了电子显微镜、DNA含量的FCM分析、Anˉnexin V标记的FCM分析三种方法相结合检测凋亡。细胞凋亡检测方法有很多种，单一任何一种方法都有一定局限性。最初是用光镜观察凋亡细胞形态，但与坏死细胞难以区别;电镜观察是目前确定凋亡形态学的最佳定性方法，但成本较高，不能定性;DNA电泳是判断细胞有无凋亡发生的简便方法，曾被认为是最具特征性的，但现在否定了这一看法，特征性的180～200bp的DNA梯带的出现非凋亡所特有，而且电泳法只能进行半定量;FCM分析则可在短时间内测定大量的细胞，作定量检测，PI染色DNA含量FCM分析为常用的检测方法，并可同时检测非凋亡细胞的周期分布。细胞凋亡时DNA断裂，断裂的小片段易从细胞内释出而使凋亡细胞的DNA含量低于正常细胞，以亲DNA染料PI处理细胞后再用FCM分析，G 0 /G 1 期前的亚G 1 峰则可反映凋亡细胞的多少。但此法有一定的漏检率:(1)部分细胞处于凋亡早期，虽已有DNA断裂点出现，但尚未出现DNA片段的丢失，未进入亚G 1 峰所在区域;(2)亚G 1 峰主要体现G 1 期细胞的DNA丢失，处于S期或G 2 /M期的细胞凋亡时凋亡峰隐含于正常的细胞周期中。Annexin X标记FCM分析法检测凋亡则更为客观、精确、能检测到早期凋亡细胞并能区分坏死细胞 [8] ，用于定量分析更具优越性。Annexin V标记法显示榄香烯20μg/ml48h诱导的胰腺癌细胞凋亡率为43.7±2.18%，电镜也证实了经榄香烯处理的细胞中存在凋亡细胞。DNA含量测定则显示中药血清作用使细胞周期阻滞于G 0 /G 1 期。而MTT法显示榄香烯作用48h对胰腺癌细胞的生长抑制率为35.81±3.70%，可能因此时凋亡细胞多处于早期，仍保留活细胞的功能，致使MTT法检测的抑制率偏低。
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bcl-2基因家族是细胞凋亡的抑制基因，随着肿瘤分子生物学的发展，对bcl-2基因在肿瘤的发生发展中地位和作用越来越受到关注。许多肿瘤患者及一些肿瘤细胞株高表达bcl-2，同时体外细胞实验证实bcl-2高表达抑制和阻断多种因素所促发的细胞凋亡，明显延长肿瘤细胞生存时间 [9] 。bcl-2基因家族中某些成分是目前研究较多、bcl-2与线虫C.elegans ced-9基因同源，也是作用较为肯定的抗凋亡蛋白 [10，11] 。bcl-2蛋白位于质膜内表面，核周膜及内质网和线粒体内膜上 [12～14] ，实验表明bcl-2并不是加速细胞分裂，而是促进细胞生存，即bcl-2基因产物并不改变细胞增殖速度，而是通过抵抗程序化S死亡细胞死亡，延长细胞寿命，导致细胞数目增加。
我们的实验表明结果发现榄香烯作用胰腺癌细胞，细胞生长收到抑制，细胞周期阻滞在G 0 /G 1 期，并明显的细胞凋亡，PCNA的表达下降，下调bcl-2的表达。通过胰腺癌诱导细胞凋亡、降低PCNA的表达，阻滞细胞周期于G 0 /G 1 期发挥抗癌，而通过抑制胰腺癌bcl-2基因表达是其诱导胰腺癌凋亡的机制之一。
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基金项目:上海市科委资助课题(编号:004019078)
作者单位:200062上海市普陀区中心医院，
上海中医药大学普陀临床医学院
(编辑使 臻), http://www.100md.com(范忠泽 孙 珏 李 琦 朱美华)