术前局部动脉栓塞化疗对乳腺癌细胞凋亡和增殖的影响
【摘要】 目的 动脉栓塞化疗(TACE)具有肿瘤局部药物浓度高、全身副作用少的特点，术前TACE可改变乳腺癌患者肿瘤组织学形态。本文旨在研究术前TACE对乳腺癌细胞凋亡及增殖细胞核杭原(PCNA)阳性表达率的影响。方法 对18例乳腺癌患者TACE前行穿刺活检和TACE取手术切除病理标本，应用末端转移酶介导的切口末端标记法(TUNEL)、免疫组化S-P法分别检测肿瘤细胞凋亡及PCNA的表达的情况。结果 TACE后乳腺癌肿瘤细胞凋亡指数显著高于TACE前(P<0.01)，TACE后肿瘤细胞增殖细胞核抗原(PCNA)阳性表达率显著低于TACE前(P<0.01)。结论 术前TACE具有促进乳腺癌细胞凋亡和抑制其增殖的能力。
关键词 乳腺肿瘤 栓塞化疗 细胞凋亡 增殖细胞核抗原 免疫组织化学
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)22-2038-04
Effect of preoperative transarterial chemoembolization on apoptosis
, 百拇医药
and PCNA expression of breast cancer
Guo Liangfeng，Wang Xianming，Li Rong，et al.
The center of Diagnosis and Therapy of Breast Disease of the Second People’s Hospital of Shenzhen City518035.
【Abstract】 Objective Transarterial Chemoembolization(TACE)is charactized with a high drug concentration in tumor tissues and slight side-effects.Some significant histopathological changes were observed in the patients with breast cancer treated by selective TACE before operation.The aim of this study was to study the effect of preoperative TACE on apoptosisand proliferating cell nuclear antigen(PCNA)expression in human breast cancerand its clinical significance.Methods The apoptosis was examined by terminal uridine deoxynucleotide nick end labeling(TUNEL)and the expression of PCNAwas detected by immunohistochemisthy(S-P)in18patients with breast cancer pre-and post-chemotherapy respectively.Results Apoptosis index(AI)was significantly higher in the post-chemotherapeuˉtic patients than in the pre-chemotherapeutic ones(P<0.01).In contrast，the postive expression of PCNAwas signifˉicantly lower inthe post-chemotherapeutic patiensts than in the pre-chemotherapeutic ones(P<0.01).Conclusion Preoperative TACE could induce the apoptosis of breast cancer cell and inhibit the proliferation of breast cancer cell.
, 百拇医药
Key words breast neoplasm chemoembolization cell apoptosis proliferating cell nuclear antigen immunoˉhistochemisty
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，许多临床研究支持乳腺癌在早期就发生全身播散的理论，术前化疗其最大好处是能够预防转移灶的发生，可以防止手术残存灶动力学的改变。在实验室动物模型及体内研究中，术前全身化疗对肿瘤的作用环节不同，但都可以引起肿瘤细胞的凋亡，肿瘤细胞增殖性的降低 [1] 。栓塞化疗(transarterial chemoemˉbolization，TACE)在乳腺癌方面主要适应于有远处转移或手术治疗后复发、转移的病人以及不可切除肿瘤的姑息治疗手段，但体内就是否能够引起肿瘤细胞的凋亡，并且在此方面是否优于全身静脉化疗，研究不多 [2] 。本文旨在通过对乳腺癌患者进行术前TACE，探讨术前TACE能否引起乳腺癌肿瘤细胞的凋亡以及对乳腺癌肿瘤细胞增殖的影响，为TACE作为一种新辅助化疗手段运用于临床提供理论依据。
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1 材料与方法
1.1 临床资料 本组18例患者均为女性，年龄32～72岁，平均54岁。全部患者TACE前均经病理穿刺活检确诊。其中浸润性导管癌9例，单纯癌4例，腺癌3例，乳头状癌2例;T 2 N 0 M 0 5例，T 2 N 1 M 0 6例，T 3 N 1 M 0 3例，T 4 N 1 M 0 2例，T 4 N 2 M 1 1例(炎性乳腺癌)，复发性乳腺癌1例。
1.2 受试对象处理 确诊为乳腺癌病例，采用Seldinger技术，在局麻下行右侧股动脉穿刺插管，抽出管芯将C 2 4-F眼镜蛇导管由此置入直达患侧的锁骨下动脉，用高压注射器以5ml/s速度注入三代显进行DSA检查，观察乳腺血管的构成、病灶血管改变及周围淋巴结染色情况。再依次经内乳动脉、胸外侧动脉、锁骨下动脉注入化疗药物环磷酰胺(CTX)600mg，表阿霉素(EADM)50mg，5-氟脲嘧啶(5-FU)750～1000mg，术后2周行手术治疗。
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1.3 实验方法 采用透射电子显微镜观察乳腺癌细胞凋亡形态学的改变;采用末端转移酶介导的脱氧核苷酸末端标志法(TUNEL法)进行原位细胞凋亡检测，设立阳性和阴性对照以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，无棕黄色颗粒则为阴性细胞。TUNEL染色切片选择表达清楚并数肿瘤细胞总阳性细胞数，计算染色阳性细胞占肿瘤细胞的百分数。凋亡指数(Apoptotic Index)=(凋亡细胞数/计数细胞总数)×100%。增殖细胞核抗原(PCNA)表达阳性率免疫组织化学染色(S-P免疫组化染色、DAB显色)作为乳腺癌增殖能力的检测指标，以细胞核内出现明显棕黄色颗粒为阳性细胞，无棕黄色颗粒则为阴性细胞，计算染色阳性细胞占肿瘤的百分数，PCNA表达阳性率=(PCNA阳性细胞/计数细胞总数)×100%。
1.4 统计方法 所有数据采用SPSS10.0统计软件包处理。将AI、PCNA阳性表达率分别进行自身配对的差值均数与总体均数0比较的t检验;将TACE前AI、PCNA阳性表达率进行线性相关分析;将TACE后AI、PCNA阳性表达率进行线性相关分析。
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2 结果
2.1 术前TACE后的大体变化 经过TACE后病灶侧前胸部皮温稍增高，并且于灌注化疗后约2～3天可见到明显病灶侧皮肤明显潮红，血运的改变，其界限大致为内侧至锁骨中线，外侧至腋后线上至锁骨水平，下至上腹部。肿块的大小逐渐缩小，约经2周左右渐至稳定。
2.2 透射电子显微镜观察乳腺癌细胞的亚细胞结构 可以看到凋亡细胞早期细胞核染色体发生核固缩，凋亡的细胞中期细胞核发生核碎裂，细胞浆内可见空泡增多。
2.3 凋亡指数(AI)化疗前后的比较 样本均数d与总体均数为0的比较差异具有显著性(P<0.001)，TACE前后凋亡指数具有差别，结合资料可以认为TACE后肿瘤细胞凋亡指数增加。见表1。
表1 乳腺癌TACE前后凋亡指数
2.4 增殖细胞核抗原(PCNA)表达阳性率化疗前后的比较 样本均数d与总体均数为0的比较差异具有显著性(P<0.001)，TACE前后PCNA表达阳性率具有差别，结合资料可认为TACE后肿瘤的PCNA表达阳性率下降。见表2。
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表2 乳腺癌TACE前后PCNA表达阳性率
2.5 TACE前、后凋亡指数(AI)与增殖细胞核抗原(PCNA)表达阳性率之间的关系TACE前凋亡指数(Pre-AI)与增殖细胞核抗原表达阳性率(Pre-PCNA)相关系数r=-0.964(P<0.001)，呈负相关;TACE后凋亡指数(Post-AI)与增殖细胞核抗原表达阳性率(Post-PCNA)之间相关系数r=-0.889(P<0.01)，呈负相关。见表3。
表3 TACE前、后AI与PCNA表达阳性率之间的相关关系
3 讨论
恶性肿瘤的化学药物治疗已有50多年历史，随着介入放射学的发展，TACE因其具有较高的局部血液浓度和降低化疗副作用，已成为肿瘤治疗的重要手段;但其确切机制尚不清楚。到目前为止，术前TACE是晚期治疗乳腺癌的一个重要方法，作为术前辅助化疗手段在临床上有所应用 [3] 。对于乳腺癌局部动脉灌注化疗的血供分布，DSA下的形态学报道较多 [4] ，但关于TACE对乳腺癌细胞凋亡、增殖的影响报道不多。本研究采用形态学、免疫组化法及TUNEL等方法，对经TACE处理的乳腺癌标本作以自身对照研究，探讨TACE对乳腺癌细胞凋亡、增殖动力学的影响。
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3.1 TACE对乳腺癌病灶及区域可能造成的影响 药物动力学研究表明药物静脉注射存在Ⅰ相、Ⅱ相分布，动脉灌注化疗时，由供血动脉给药，其Ⅰ相、Ⅱ相分布均较同等剂量静脉给药的条件下局部化疗药物浓度为高。根据药物代谢动力学模型动脉给药局部药物接受量RT=1+表面总体消除率/肿瘤血流量，在表面总体消除率一定的情况下，减少肿瘤的血流量，则RT增高，故动脉栓塞将增加局部的血药浓度 [5] 。局部栓塞后可能造成轻度缺血、缺氧、组织损伤乃至明显的缺血坏死。
本试验示局部灌注约2～3天后局部胸壁皮肤血运变化，术后示腋窝淋巴结水肿、微循环栓塞，瘤体水肿、缩小，提示可能由于局部明胶海绵栓塞，或者由于局部高浓度的化疗药物对微血管的直接刺激作用引起血管痉挛、血管内皮细胞的损伤等作用，从而造成肿瘤所属区域血流量减少、供血不足，使肿瘤组织变性坏死。术前间隔时间约为2周，因此，病理改变主要是Ⅰ期退化性变期，有效率为100%，而且较术前全身静脉途径的新辅助化疗明显的缩短了住院时间，一般全身静脉途径的新辅助化疗约需要3～6个疗程，当然本试验也带来了一定的不利因素，如肿瘤明显缩小或消失给术中的定位带来了误差，这一点在保留乳腺手术中相当重要，所以在TACE前应作以标记以利于术中定位。
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3.2 栓塞引起乳腺癌肿瘤细胞凋亡的可能作用机制 本试验透射电镜结果显示:在灌注化疗切除术后标本中可发现不同时相的细胞凋亡形态，表明肿瘤不同时相的瘤细胞经TACE作用后相继发生凋亡。并且显示TACE前后，肿瘤AI差异具有显著性，TACE后，AI增加。结合细胞凋亡的机制逐一讨论本试验TACE促进肿瘤细胞凋亡的可能原因。Kanfmann在化疗药物抗肿瘤的研究中发现，用足叶乙甙作用于肿瘤细胞，电镜下可见细胞核内有DNA的凝集，后来人们陆续发现各种化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的最后生化联级反应几乎是一致，并提出各种假说，Yusuf提出的假说认为:化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的过程大致可分为:(1)损伤产生相:该期各种化疗药物与其特异性的底物(如DNA、RNA、微管)作用引起底物的损伤。如5-FU被细胞摄取并代谢为几种活性代谢产物，通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶(TS)的活性，导致细胞内DNA合成前体脱氧三磷酸胸苷(dTTP)缺乏，同时可直接掺入DNA链的延长，改变DNA的稳定性，引起DNA的断裂;环磷酰胺属于烷化剂细胞毒性药物，进入体内后经肝脏或肿瘤组织内存在的过量磷酰胺酶或磷酸酶水解，变成活性型，释放出氮芥基，与细胞中的重要生物活性基团，如氨基、巯基、羟基等发生烷化作用，使之不能在代谢中起作用;表阿霉素属抗生素类，其机制是直接嵌入DNA碱基对之间，干扰DNA的转录过程，阻止RNA的合成。总之，不同的化疗药物作用的细胞靶点不同，最终造成肿瘤细胞的损伤。对于本试验中使用的明胶海绵栓塞剂，可引起被栓塞区域缺血缺氧，缺血是强有力的基因诱导因子，有文献报道脑缺血至少可导致80种以上的基因表达，在缺血数分钟，就有即刻早期基因表达 [6] 。缺氧也可诱导促凋亡基因表达增高，以及诱导肿瘤坏死因子等细胞凋亡启动因子的表达 [7] 。(2)信号传导相:细胞经多 种机制识别评估化疗药物引起的细胞损伤情况，并将损伤信息传递给决定点。信号传导途径目前较清楚的是线粒体依赖和细胞膜受体信号依赖两大途径。细胞在受到不可逆损伤后，引起细胞质Bax构型改变，并向线粒体外膜靠近，Bax、Bak可在线粒体外膜上形成渗透性转运孔，使膜通透性改变，跨膜电位消失，其内Ca 2+ 释放，核区Ca 2+ 增高，从而促进Ca 2+ 依赖性核酸酶释放，进入核区，导致染色质DNA断裂、核凋亡。细胞表面的Fas死亡受体，也是凋亡的重要途径。
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有研究表明，栓塞化疗后，肿瘤组织细胞表面Fas表达增高 [8] 。当Fas受体与Fasl结合后引起胞内的接头蛋白FADD(Fas Adaptor Death Domain)发生构型改变。上述途径最终都使Caspase蛋白酶家族激活，而后通过①灭活ICAD(Inhibitor of Caspase-Activated Dinase)、DNA损伤修复酶(PARP)、BCL-2蛋白质等使细胞免于凋亡的蛋白，使一些促凋亡因子被激活;②使细胞去组装、破坏染色质组织的核内板，导致细胞凋亡。(3)凋亡诱导相:细胞内存在某一些决定点可根据传导来的细胞损伤信息决定损伤细胞是进入周期阻滞进行修复，还是进入凋亡过程。
当然对于凋亡的发生还存在一个量的条件，研究表明，化疗的凋亡发生存在一个化疗药物的剂量依赖性。化疗药物达到一定剂量后才能促进凋亡的发生 [9] 。总之，本试验的联合化疗栓塞是多因素的，应该是其化疗药物及栓塞的综合因素，这样也许更容易实现肿瘤细胞的凋亡。
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3.3 PCNA与栓塞化疗的关系 PCNA又称周期素，是一种酸性、无组蛋白的细胞核多肽，为DNA聚合酶S的辅助蛋白，从细胞周期的G 1 期开始表达逐渐增加，在S期达到高峰，G 2 期、M期减少，主要局限于增殖细胞的核中，是反映肿瘤增殖细胞活性的一项较好的指标，是DNA合成不可缺少的因子 [10] 。许多文献已把PCNA的阳性表达作为估计乳腺癌一个独立的预后指标。本试验中，术前TACE化疗栓塞前后PCNA阳性表达率差异具有显著性，提示TACE可以降低乳腺癌的DNA合成速度，从而抑制乳腺肿瘤细胞的增殖。当然也可能存在细胞受到损伤后进入DNA的切除修复而减慢细胞增殖过程表现为细胞PCNA阳性表达率降低的可能性。
3.4 肿瘤细胞凋亡与PCNA阳性表达率的关系 本试验显示:TACE前凋亡指数(Pre-AI)与增殖细胞核抗原表达阳性率(Pre-PCNA)以及TACE后凋亡指数(Post-AI)与增殖细胞核抗原表达阳性率(Post-PCNA)之间均呈负相关，提示TACE具有双向性作用———能够促进乳腺肿瘤细胞AI增加、PCNA表达阳性率的降低。它反映了乳腺肿瘤细胞的凋亡和增殖间相互影响，相互制约的矛盾统一关系。能够促进乳腺肿瘤细胞AI增加、PCNA表达阳性率降低的施加因素，将有利于乳腺肿瘤的治疗，反之，将不利于治疗。
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3.5 乳腺癌术前TACE的临床意义 上述结果表明动脉栓塞化疗(TACE)通过对局部微循环的影响、促进肿瘤细胞凋亡及降低肿瘤细胞增殖能力等机制，实现其治疗作用。乳腺癌具有多灶及多中心性的特点，临床上可通过术前TACE消除潜在的微转移灶和多中心性病灶来增加保乳手术的机会及提高乳腺癌绝对根治率;中晚期乳腺癌通过TACE使肿瘤病灶缩小、降期获得相对根治性切除的机会，为进一步治疗提供条件。乳腺癌治疗主要依靠以手术治疗为中心的综合性整体治疗的概念，随着新辅助化疗概念的提出和手术方式的改变，将遇到挑战。
因此我们认为乳腺癌动脉灌注化疗的临床意义或许有以下几个方面:术前灌注化疗后，对残留肿瘤可行局部、广泛切除术或1/4乳房切除加腋淋巴结清扫术，增加保留乳房的手术应用;局部灌注化疗后，减少了手术操作可能带来的远处转移;局部灌注化疗栓塞后，使肿瘤区域毛细血管、毛细淋巴管栓塞，淋巴结坏死、水肿，减少术后淋巴道转移的可能;局部灌注化疗后再进行手术，本身是一种体内的药物敏感试验，为进一步化疗方案的选择提供依据;对于无法手术切除的中晚期乳腺癌，灌注化疗后可以增加手术切除机会，延长寿命和提高生存质量;对于术后的辅助治疗及术后局部复发的病人可作为局部放疗的一种替代治疗。
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当然有许多问题需要去解决，如:①寻求化疗药物种类、浓度的最佳组合，术前时机的掌握等;②TACE是在DSA下进行，合理控制栓塞范围、提高操作技巧尽可能减少操作带来的并发症;③衡量肿瘤治疗手段的好坏是能否降低复发率、提高无病生存率，术前TACE能否达到此目的尚需大宗前瞻性的临床研究，是否优于静脉途径的新辅助化疗手段有待进一步探索。
参考文献
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8 李兴睿，易继林.原发性肝癌组织内Fas抗原的表达及其与肝动脉化疗栓塞的关系.临床外科杂志，1998，6(5):256-257.
9 成金蓉，赵新民，郑胡镛，等.化疗药物体外诱导白血病细胞凋亡的研究.中华儿科杂志，2000，38(4):223-227.
10 Dervan PA，Magrr HM，Carney DN，et al.Proliferating cell nuclear antigen counts in foramlin-fixed paraffin-embeded tissue correlate with Ki-67in fress tissue.Am J pathol，1992，140(3):521.
作者单位:518035广东省深圳市第二人民医院乳房疾病诊疗中心
(编辑晓 勇), 百拇医药(郭良峰 王先明 李戎 伍建春 关)
关键词 乳腺肿瘤 栓塞化疗 细胞凋亡 增殖细胞核抗原 免疫组织化学
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)22-2038-04
Effect of preoperative transarterial chemoembolization on apoptosis
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and PCNA expression of breast cancer
Guo Liangfeng，Wang Xianming，Li Rong，et al.
The center of Diagnosis and Therapy of Breast Disease of the Second People’s Hospital of Shenzhen City518035.
【Abstract】 Objective Transarterial Chemoembolization(TACE)is charactized with a high drug concentration in tumor tissues and slight side-effects.Some significant histopathological changes were observed in the patients with breast cancer treated by selective TACE before operation.The aim of this study was to study the effect of preoperative TACE on apoptosisand proliferating cell nuclear antigen(PCNA)expression in human breast cancerand its clinical significance.Methods The apoptosis was examined by terminal uridine deoxynucleotide nick end labeling(TUNEL)and the expression of PCNAwas detected by immunohistochemisthy(S-P)in18patients with breast cancer pre-and post-chemotherapy respectively.Results Apoptosis index(AI)was significantly higher in the post-chemotherapeuˉtic patients than in the pre-chemotherapeutic ones(P<0.01).In contrast，the postive expression of PCNAwas signifˉicantly lower inthe post-chemotherapeutic patiensts than in the pre-chemotherapeutic ones(P<0.01).Conclusion Preoperative TACE could induce the apoptosis of breast cancer cell and inhibit the proliferation of breast cancer cell.
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Key words breast neoplasm chemoembolization cell apoptosis proliferating cell nuclear antigen immunoˉhistochemisty
乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一，许多临床研究支持乳腺癌在早期就发生全身播散的理论，术前化疗其最大好处是能够预防转移灶的发生，可以防止手术残存灶动力学的改变。在实验室动物模型及体内研究中，术前全身化疗对肿瘤的作用环节不同，但都可以引起肿瘤细胞的凋亡，肿瘤细胞增殖性的降低 [1] 。栓塞化疗(transarterial chemoemˉbolization，TACE)在乳腺癌方面主要适应于有远处转移或手术治疗后复发、转移的病人以及不可切除肿瘤的姑息治疗手段，但体内就是否能够引起肿瘤细胞的凋亡，并且在此方面是否优于全身静脉化疗，研究不多 [2] 。本文旨在通过对乳腺癌患者进行术前TACE，探讨术前TACE能否引起乳腺癌肿瘤细胞的凋亡以及对乳腺癌肿瘤细胞增殖的影响，为TACE作为一种新辅助化疗手段运用于临床提供理论依据。
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1 材料与方法
1.1 临床资料 本组18例患者均为女性，年龄32～72岁，平均54岁。全部患者TACE前均经病理穿刺活检确诊。其中浸润性导管癌9例，单纯癌4例，腺癌3例，乳头状癌2例;T 2 N 0 M 0 5例，T 2 N 1 M 0 6例，T 3 N 1 M 0 3例，T 4 N 1 M 0 2例，T 4 N 2 M 1 1例(炎性乳腺癌)，复发性乳腺癌1例。
1.2 受试对象处理 确诊为乳腺癌病例，采用Seldinger技术，在局麻下行右侧股动脉穿刺插管，抽出管芯将C 2 4-F眼镜蛇导管由此置入直达患侧的锁骨下动脉，用高压注射器以5ml/s速度注入三代显进行DSA检查，观察乳腺血管的构成、病灶血管改变及周围淋巴结染色情况。再依次经内乳动脉、胸外侧动脉、锁骨下动脉注入化疗药物环磷酰胺(CTX)600mg，表阿霉素(EADM)50mg，5-氟脲嘧啶(5-FU)750～1000mg，术后2周行手术治疗。
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1.3 实验方法 采用透射电子显微镜观察乳腺癌细胞凋亡形态学的改变;采用末端转移酶介导的脱氧核苷酸末端标志法(TUNEL法)进行原位细胞凋亡检测，设立阳性和阴性对照以细胞核出现棕黄色颗粒为阳性细胞，无棕黄色颗粒则为阴性细胞。TUNEL染色切片选择表达清楚并数肿瘤细胞总阳性细胞数，计算染色阳性细胞占肿瘤细胞的百分数。凋亡指数(Apoptotic Index)=(凋亡细胞数/计数细胞总数)×100%。增殖细胞核抗原(PCNA)表达阳性率免疫组织化学染色(S-P免疫组化染色、DAB显色)作为乳腺癌增殖能力的检测指标，以细胞核内出现明显棕黄色颗粒为阳性细胞，无棕黄色颗粒则为阴性细胞，计算染色阳性细胞占肿瘤的百分数，PCNA表达阳性率=(PCNA阳性细胞/计数细胞总数)×100%。
1.4 统计方法 所有数据采用SPSS10.0统计软件包处理。将AI、PCNA阳性表达率分别进行自身配对的差值均数与总体均数0比较的t检验;将TACE前AI、PCNA阳性表达率进行线性相关分析;将TACE后AI、PCNA阳性表达率进行线性相关分析。
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2 结果
2.1 术前TACE后的大体变化 经过TACE后病灶侧前胸部皮温稍增高，并且于灌注化疗后约2～3天可见到明显病灶侧皮肤明显潮红，血运的改变，其界限大致为内侧至锁骨中线，外侧至腋后线上至锁骨水平，下至上腹部。肿块的大小逐渐缩小，约经2周左右渐至稳定。
2.2 透射电子显微镜观察乳腺癌细胞的亚细胞结构 可以看到凋亡细胞早期细胞核染色体发生核固缩，凋亡的细胞中期细胞核发生核碎裂，细胞浆内可见空泡增多。
2.3 凋亡指数(AI)化疗前后的比较 样本均数d与总体均数为0的比较差异具有显著性(P<0.001)，TACE前后凋亡指数具有差别，结合资料可以认为TACE后肿瘤细胞凋亡指数增加。见表1。
表1 乳腺癌TACE前后凋亡指数
2.4 增殖细胞核抗原(PCNA)表达阳性率化疗前后的比较 样本均数d与总体均数为0的比较差异具有显著性(P<0.001)，TACE前后PCNA表达阳性率具有差别，结合资料可认为TACE后肿瘤的PCNA表达阳性率下降。见表2。
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表2 乳腺癌TACE前后PCNA表达阳性率
2.5 TACE前、后凋亡指数(AI)与增殖细胞核抗原(PCNA)表达阳性率之间的关系TACE前凋亡指数(Pre-AI)与增殖细胞核抗原表达阳性率(Pre-PCNA)相关系数r=-0.964(P<0.001)，呈负相关;TACE后凋亡指数(Post-AI)与增殖细胞核抗原表达阳性率(Post-PCNA)之间相关系数r=-0.889(P<0.01)，呈负相关。见表3。
表3 TACE前、后AI与PCNA表达阳性率之间的相关关系
3 讨论
恶性肿瘤的化学药物治疗已有50多年历史，随着介入放射学的发展，TACE因其具有较高的局部血液浓度和降低化疗副作用，已成为肿瘤治疗的重要手段;但其确切机制尚不清楚。到目前为止，术前TACE是晚期治疗乳腺癌的一个重要方法，作为术前辅助化疗手段在临床上有所应用 [3] 。对于乳腺癌局部动脉灌注化疗的血供分布，DSA下的形态学报道较多 [4] ，但关于TACE对乳腺癌细胞凋亡、增殖的影响报道不多。本研究采用形态学、免疫组化法及TUNEL等方法，对经TACE处理的乳腺癌标本作以自身对照研究，探讨TACE对乳腺癌细胞凋亡、增殖动力学的影响。
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3.1 TACE对乳腺癌病灶及区域可能造成的影响 药物动力学研究表明药物静脉注射存在Ⅰ相、Ⅱ相分布，动脉灌注化疗时，由供血动脉给药，其Ⅰ相、Ⅱ相分布均较同等剂量静脉给药的条件下局部化疗药物浓度为高。根据药物代谢动力学模型动脉给药局部药物接受量RT=1+表面总体消除率/肿瘤血流量，在表面总体消除率一定的情况下，减少肿瘤的血流量，则RT增高，故动脉栓塞将增加局部的血药浓度 [5] 。局部栓塞后可能造成轻度缺血、缺氧、组织损伤乃至明显的缺血坏死。
本试验示局部灌注约2～3天后局部胸壁皮肤血运变化，术后示腋窝淋巴结水肿、微循环栓塞，瘤体水肿、缩小，提示可能由于局部明胶海绵栓塞，或者由于局部高浓度的化疗药物对微血管的直接刺激作用引起血管痉挛、血管内皮细胞的损伤等作用，从而造成肿瘤所属区域血流量减少、供血不足，使肿瘤组织变性坏死。术前间隔时间约为2周，因此，病理改变主要是Ⅰ期退化性变期，有效率为100%，而且较术前全身静脉途径的新辅助化疗明显的缩短了住院时间，一般全身静脉途径的新辅助化疗约需要3～6个疗程，当然本试验也带来了一定的不利因素，如肿瘤明显缩小或消失给术中的定位带来了误差，这一点在保留乳腺手术中相当重要，所以在TACE前应作以标记以利于术中定位。
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3.2 栓塞引起乳腺癌肿瘤细胞凋亡的可能作用机制 本试验透射电镜结果显示:在灌注化疗切除术后标本中可发现不同时相的细胞凋亡形态，表明肿瘤不同时相的瘤细胞经TACE作用后相继发生凋亡。并且显示TACE前后，肿瘤AI差异具有显著性，TACE后，AI增加。结合细胞凋亡的机制逐一讨论本试验TACE促进肿瘤细胞凋亡的可能原因。Kanfmann在化疗药物抗肿瘤的研究中发现，用足叶乙甙作用于肿瘤细胞，电镜下可见细胞核内有DNA的凝集，后来人们陆续发现各种化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的最后生化联级反应几乎是一致，并提出各种假说，Yusuf提出的假说认为:化疗药物诱导肿瘤细胞凋亡的过程大致可分为:(1)损伤产生相:该期各种化疗药物与其特异性的底物(如DNA、RNA、微管)作用引起底物的损伤。如5-FU被细胞摄取并代谢为几种活性代谢产物，通过抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶(TS)的活性，导致细胞内DNA合成前体脱氧三磷酸胸苷(dTTP)缺乏，同时可直接掺入DNA链的延长，改变DNA的稳定性，引起DNA的断裂;环磷酰胺属于烷化剂细胞毒性药物，进入体内后经肝脏或肿瘤组织内存在的过量磷酰胺酶或磷酸酶水解，变成活性型，释放出氮芥基，与细胞中的重要生物活性基团，如氨基、巯基、羟基等发生烷化作用，使之不能在代谢中起作用;表阿霉素属抗生素类，其机制是直接嵌入DNA碱基对之间，干扰DNA的转录过程，阻止RNA的合成。总之，不同的化疗药物作用的细胞靶点不同，最终造成肿瘤细胞的损伤。对于本试验中使用的明胶海绵栓塞剂，可引起被栓塞区域缺血缺氧，缺血是强有力的基因诱导因子，有文献报道脑缺血至少可导致80种以上的基因表达，在缺血数分钟，就有即刻早期基因表达 [6] 。缺氧也可诱导促凋亡基因表达增高，以及诱导肿瘤坏死因子等细胞凋亡启动因子的表达 [7] 。(2)信号传导相:细胞经多 种机制识别评估化疗药物引起的细胞损伤情况，并将损伤信息传递给决定点。信号传导途径目前较清楚的是线粒体依赖和细胞膜受体信号依赖两大途径。细胞在受到不可逆损伤后，引起细胞质Bax构型改变，并向线粒体外膜靠近，Bax、Bak可在线粒体外膜上形成渗透性转运孔，使膜通透性改变，跨膜电位消失，其内Ca 2+ 释放，核区Ca 2+ 增高，从而促进Ca 2+ 依赖性核酸酶释放，进入核区，导致染色质DNA断裂、核凋亡。细胞表面的Fas死亡受体，也是凋亡的重要途径。
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有研究表明，栓塞化疗后，肿瘤组织细胞表面Fas表达增高 [8] 。当Fas受体与Fasl结合后引起胞内的接头蛋白FADD(Fas Adaptor Death Domain)发生构型改变。上述途径最终都使Caspase蛋白酶家族激活，而后通过①灭活ICAD(Inhibitor of Caspase-Activated Dinase)、DNA损伤修复酶(PARP)、BCL-2蛋白质等使细胞免于凋亡的蛋白，使一些促凋亡因子被激活;②使细胞去组装、破坏染色质组织的核内板，导致细胞凋亡。(3)凋亡诱导相:细胞内存在某一些决定点可根据传导来的细胞损伤信息决定损伤细胞是进入周期阻滞进行修复，还是进入凋亡过程。
当然对于凋亡的发生还存在一个量的条件，研究表明，化疗的凋亡发生存在一个化疗药物的剂量依赖性。化疗药物达到一定剂量后才能促进凋亡的发生 [9] 。总之，本试验的联合化疗栓塞是多因素的，应该是其化疗药物及栓塞的综合因素，这样也许更容易实现肿瘤细胞的凋亡。
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3.3 PCNA与栓塞化疗的关系 PCNA又称周期素，是一种酸性、无组蛋白的细胞核多肽，为DNA聚合酶S的辅助蛋白，从细胞周期的G 1 期开始表达逐渐增加，在S期达到高峰，G 2 期、M期减少，主要局限于增殖细胞的核中，是反映肿瘤增殖细胞活性的一项较好的指标，是DNA合成不可缺少的因子 [10] 。许多文献已把PCNA的阳性表达作为估计乳腺癌一个独立的预后指标。本试验中，术前TACE化疗栓塞前后PCNA阳性表达率差异具有显著性，提示TACE可以降低乳腺癌的DNA合成速度，从而抑制乳腺肿瘤细胞的增殖。当然也可能存在细胞受到损伤后进入DNA的切除修复而减慢细胞增殖过程表现为细胞PCNA阳性表达率降低的可能性。
3.4 肿瘤细胞凋亡与PCNA阳性表达率的关系 本试验显示:TACE前凋亡指数(Pre-AI)与增殖细胞核抗原表达阳性率(Pre-PCNA)以及TACE后凋亡指数(Post-AI)与增殖细胞核抗原表达阳性率(Post-PCNA)之间均呈负相关，提示TACE具有双向性作用———能够促进乳腺肿瘤细胞AI增加、PCNA表达阳性率的降低。它反映了乳腺肿瘤细胞的凋亡和增殖间相互影响，相互制约的矛盾统一关系。能够促进乳腺肿瘤细胞AI增加、PCNA表达阳性率降低的施加因素，将有利于乳腺肿瘤的治疗，反之，将不利于治疗。
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3.5 乳腺癌术前TACE的临床意义 上述结果表明动脉栓塞化疗(TACE)通过对局部微循环的影响、促进肿瘤细胞凋亡及降低肿瘤细胞增殖能力等机制，实现其治疗作用。乳腺癌具有多灶及多中心性的特点，临床上可通过术前TACE消除潜在的微转移灶和多中心性病灶来增加保乳手术的机会及提高乳腺癌绝对根治率;中晚期乳腺癌通过TACE使肿瘤病灶缩小、降期获得相对根治性切除的机会，为进一步治疗提供条件。乳腺癌治疗主要依靠以手术治疗为中心的综合性整体治疗的概念，随着新辅助化疗概念的提出和手术方式的改变，将遇到挑战。
因此我们认为乳腺癌动脉灌注化疗的临床意义或许有以下几个方面:术前灌注化疗后，对残留肿瘤可行局部、广泛切除术或1/4乳房切除加腋淋巴结清扫术，增加保留乳房的手术应用;局部灌注化疗后，减少了手术操作可能带来的远处转移;局部灌注化疗栓塞后，使肿瘤区域毛细血管、毛细淋巴管栓塞，淋巴结坏死、水肿，减少术后淋巴道转移的可能;局部灌注化疗后再进行手术，本身是一种体内的药物敏感试验，为进一步化疗方案的选择提供依据;对于无法手术切除的中晚期乳腺癌，灌注化疗后可以增加手术切除机会，延长寿命和提高生存质量;对于术后的辅助治疗及术后局部复发的病人可作为局部放疗的一种替代治疗。
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当然有许多问题需要去解决，如:①寻求化疗药物种类、浓度的最佳组合，术前时机的掌握等;②TACE是在DSA下进行，合理控制栓塞范围、提高操作技巧尽可能减少操作带来的并发症;③衡量肿瘤治疗手段的好坏是能否降低复发率、提高无病生存率，术前TACE能否达到此目的尚需大宗前瞻性的临床研究，是否优于静脉途径的新辅助化疗手段有待进一步探索。
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作者单位:518035广东省深圳市第二人民医院乳房疾病诊疗中心
(编辑晓 勇), 百拇医药(郭良峰 王先明 李戎 伍建春 关)