缺血预适应阻抑高胆固醇血症家兔的中性粒细胞CD11bCD18蛋白的表达
【摘要】 目的 探讨缺血预适应(IPC)对实验性高胆固醇血症家兔缺血再灌注心肌梗死、PMN CD11b/CD8的影响。方法 雄性家兔24只，分为4组，用高胆固醇饲料喂养4周后随机分为A和B组(各6只)，用普通饲料喂养4周后随机分为C和D组(各6只)，其后，对上述4组家兔心脏实施缺血60min，再灌注120min手术，其中B、D两组心肌缺血再灌注前给予IPC(缺血5min，再灌注10min各2次)，用免疫组织化学染色法观察中性粒细胞(PMN)表面CD11b/CD18蛋白的表达，用Eˉvan’s蓝和TTC染色测定梗死心肌和危险区域心肌的范围，用酶法测定血清总胆固醇。结果 A、B组总胆固醇基础浓度为1.31±0.39mmol/L，高胆固醇饲料喂养4周后为21.52±9.27mmol/L，(P<0.01)，C、D组为1.45±0.48mmol/L。IPC组(B、D组)分别与对照组(A、C组)比较，心梗面积显著减少(P<0.01)，B、D组心肌缺血前PMN CD11b/CD18蛋白表达上调(P<0.05)，但在心肌缺血1h和再灌注2h CD11b/CD18蛋白表达明显下调(P<0.01)。A、C组缺血1h和再灌注2h CD11b/CD18蛋白表达与同组基础比较显著上调(P<0.01)，而缺血前与同组基础比较差异无显著性;B、D组缺血前PMNCD11b/CD8蛋白表达与同组基础比较上调(P<0.05)，而缺血1h和再灌注2h与同组基础比较差异无显著性。结论 IPC同样缩小实验性高胆固醇血症家兔缺血再灌注心肌梗死面积、抑制PMN CD11b/CD18蛋白表达。
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关键词 缺血预适应 高胆固醇血症 CD11b/CD18
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)04-0292-03
Protective effects of ischemic preconditioning on ischemia/reperfusion
myocardial injury in hypercholesterolemic rabbits
Luo Yaxiong，Huang Damei
Department of Cardiovascular Disease，Guiyang Medical College，Guiyang550004.
, 百拇医药 【Abstract】 Objective To investigate the effect of ischemic preconditioning on ischemia/reperfusion myocarˉdial infarct，PMNCD11b/CD18in hypercholesterolemic rabbits.Methods Male rabbits were fed with cholesterol enˉriched diet forfour weeks and then divided randomly into groups(A and B)without and with ischemic preconditionˉing，respectively.A second series of rabbits fed a normal diet were similarly divided into two groups(C and D)without and with preconditioning，respectively.All the animals were subjected to60min myocardium ischemia and120min myˉocardium reperfusion.Preconditioning animals(B and D)underwent twocycles of5min myocardium ischemia and10min myocardium reperfusion before60min myocardium ischemia.The expression of protein PMNCD11b/CD18was determined by immunohistochemistry.Myocardial infarct size(AN)and areas at risk(AAR)were delineated with Eˉvan’s blue and TTC staining.We also measured concentrations of total cholesterol in serum by CHOD-PAP.Results Cholesterol in groups A and B was1.31±0.39mmol/L at baseline and21.52±9.27mmol/L at four weeks(P<0.01)and in groups C and D1.45±0.84mmol/L before the surgical procedure.AN/AAR%was39.16±4.99%in group A，11.02±2.78%in group B(P<0.01)，38.00±4.88%in C and11.09±2.98%in D(P<0.01).The expression of protein PMNCD11b/CD18increased significantly in control groups(A and C)while no difference in isˉchemic preconditioning groups(B and D)except for that enhanced at the time of preischemia.Conclusion Ischemic preconditioning can attenuate ischemia/reperfusion myocardial infarct size and inhibit expression of protein PMˉNCD11b/CD18in hypercholesterolemic rabbits.
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Key words preconditioning hypercholesterolemia CD11b/CD18
中性粒细胞(PMN)粘附增强是PMN介导冠脉微循环障碍并导致心肌再灌注损伤的起始环节，抗粘附分子单抗治疗可减轻这种损伤 [1] 。缺血预适应(IPC)具有心肌保护效应已在许多正常动物模型中得到证实 [2～4] 。然而在高胆固醇血症家兔的心脏是否仍保留有IPC现象尚不清楚。本研究旨在探讨IPC对实验性高胆固醇血症家兔缺血再灌注(I/R)心肌梗死的影响，及是否与抑制中性粒细胞CD11b/CD18受体表达有关。
1 资料和方法
1.1 实验动物 实验用雄性家兔24只，体重2.94±0.44kg，随机分为2组，每组12只，一组给予0.5%高胆固醇饲料饲养4周，给予高胆固醇饲料饲养前后分别从耳缘静脉采血测胆固醇，然后随机分为对照组(A组，n=6)和实验组(B组，n=6);另一组给予普通饲料，耳缘静脉采血测胆固醇，随机分为对照组(C组，n=6)和实验组(D组，n=6)。
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1.2 动物模型制备
3%戊巴比妥钠(1mg/kg)麻醉，机械呼吸，静脉插管，针形电极刺入肢体，接心电图机，必要时记录;胸骨左缘开胸，剪开心包膜，暴露心脏，于LAD近第一分支处穿引3-0号丝线，丝线套一小段橡皮管，将橡皮管两端丝线拉紧固定，即造成冠脉血流中断，供血区心肌颜色由鲜红转为暗紫色，心电图示ST段弓背向上抬高大于0.5mV，证实闭塞有效，放松丝线后，血流再通即再灌注。实验组(B组，D组)依次经历缺血5min，再灌注10min，反复2次，然后缺血60min，再灌注120min;对照组(A组，C组)缺血60min前观察30min，其余程序同实验组。
1.3 胆固醇测定 酶法测定血清总胆固醇，其检测步骤见胆固醇测定试剂盒(温州东瓯生物工程有限公司生产)说明书。
1.4 心肺梗死范围测定 再灌注120min末，即取心脏，原处结扎LAD，经主动脉逆行灌注0.5%Evan’s蓝染色3min，分离左心室并称重;从心尖向心底将左室横切成3～4mm薄片，将蓝染的正常区域和未染色的危险区域心肌分离并称重，将危险区域心肌浸入1%TTC的磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中，37℃温浴20min后取出，将不着色的梗死区和染成砖红色的非梗死区心肌分离并称重，计算梗死区域心肌(AN)占危险区域心肌(AAR)重量的百分比和危险区域心肌占左室(LV)重量的百分比，缺血区心肌置-20℃冰箱保存 备用。
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1.5 免疫组织化学法测定PMN CD11b/CD18 取2ml肝素抗凝全血分离出中性粒细胞涂片，无水乙醇固定，加鼠抗兔CD11b单克隆抗体37℃孵育30min，PBS洗涤3次，加二抗置30min，PBS洗涤3次，加APAAP复合物静置30min，PBS洗涤3次，加碱性磷酸酶底物显色30min，自来水冲洗终止显色，苏木素复染1min，自来水冲洗，甘油明胶封片;光镜下观察PMN胞膜呈棕红色者为阳性细胞，随机计数100个PMN并计算出阳性细胞数。
1.6 统计学处理 所有数据经SAS6.12软件统计处理;计量资料以均数±标准差(X±s)表示;组间比较用成组t检验，组内比较用配对t检验;P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 血清总胆固醇浓度 高胆固醇饲料组(A、B组)在给予高胆固醇饲料喂养4周前后血清总胆固醇浓度分别为1.31±0.39mmol/L、21.59±9.27mmol/L，两者比较差异具有显著性(P<0.01);普通饲料组(C、D组)血清总胆固醇浓度为1.45±0.48mmol/L，与高胆固醇饲料组基础值比较差异无显著性。
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2.2 心肌梗死范围 IPC组(B、D组)分别与对照组(A、C组)比较，左室重量、危险心肌组织重量和危险心肌组织占左室重量的百分比之间差异无显著性;梗死组织重量和梗死组织占危险心肌组织重量的百分比之间差异有显著性(P<0.01)。A与C、B与D组间，各指标差异均无显著性(P>0.05)，见表1。
表1 心肌梗死范围 (X±s)
注:与对照组比较 ˇˇ P<0.01
2.3 缺血预适应不同时间PMN CD11b/CD18蛋白表达的变化 IPC组(B、D组)分别与对照组(A、C组)比较，在心肌缺血前PMN CD11b/CD18蛋白表达上调(P<0.05)，在心肌缺血1h和再灌注2h后PNM CD11b/CD18蛋白表达明显下调(P<0.01)，在基础时比较差异无显著性;A、C组缺血1h 和再灌注2h PMN CD11b/CD18蛋白表达与同组基础比较显著上调(P<0.01)，而缺血前与基础比较差异无显著性;B、D组缺血前PMN CD11b/CD18蛋白表达与同组基础比较上调(P<0.05)，而缺血1h和再灌注2h与同组基础比较差异无显著性，见表2。
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表2 缺血预适应不同时点PMN CD11b/CD18蛋白表达的变化
注:在不同时点与对照组比较 ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01;与同组基础比较 △ P<0.01
3 讨论
大量动物实验资料证实 [2～4] ，IPC具有明显的心脏保护作用，表现为缩小心梗面积，促进心肌功能恢复，减少再灌注心律失常的发生等。在IPC早期保护中，由eNOS产生 的NO能直接开放线粒体膜K + 通道，K + 通道开放能引起心肌保护作用，可能是由于K + 的进入使膜去极化，减少Ca 2+ 的进入使钙超载减轻，同时亦可促进已有的钙超载减轻及线粒体钙的释放，抑制细胞凋亡 [5] 。在高胆固醇血症，动脉粥样硬化尚未形成时，内皮细胞功能已受到影响，合成NO减少;另外，胆固醇刺激内皮细胞产生氧自由基，氧自由基与NO结合使其灭活 [6] 。但是，本研究结果表明，在高胆固醇血症家兔模型中IPC引起了同样的心肌保护效应，表现为缩小缺血再灌注引起心梗的面积，可能与血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞在受到高胆固醇影响下诱导产生iNOS并合成NO [6] 及PKC增加 [7] 有关。
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本实验结果显示:缺血再灌注使PMN CD11b/CD18蛋白表达显著增加，而且缺血期更明显，IPC刺激本身虽可激发PMN CD11b/CD18蛋白表达，但又有效阻抑了缺血再灌注后PMN CD11b/CD18蛋白表达的增加。众所周知，缺血心肌的存活依赖于血管再通时间及再通引起的再灌注损伤，而PMN粘附血管内皮是介导再灌注损伤的始动环节，PMN粘附血管内皮取决于PMN CD11b/CD18蛋白的表达，抗CD11/CD18抗体治疗可缩小缺血后心肌的梗死范围 [1] 。本实验结果说明:IPC通过抑制PMN CD11b/CD18蛋白的表达可减轻缺血后再灌注损伤，从而起到保护心肌作用。我们研究表明:IPC同样缩小实验性高胆固醇血症家兔缺血再灌注心肌梗死面积，抑制PMN CD11b/CD18蛋白表达。同时提示IPC对临床心血管病患者(如高血脂、高血压、动脉粥样硬化等)可能具有同样的保护作用。
参考文献
1 丁钢，沈景霞.心肌缺血再灌注损伤中一氧化氮与中性粒细胞之间的关系.心血管病学进展，2000，21(5):290-292.
, http://www.100md.com
2 Murry CE，Jennings RB，Reimer KA.Preconditioning with ischaemia:a delay oflethal cell injury in ischaemic myocardium.Circulation，1986，74:1134-1136.
3 Garlid KD，Paucek P，Yarov-YarovoyV，et al.cardioprotective effect of diazoxide and its interaction with mitochondrial ATP-sensitive K chanˉnels Possiblemechonism of cardoprotection.Circ Res，1997，81:1072-7082.
4 Takano H，Manchikalapudi S，Tang X-L，et al.Niritc oxide synthase is the mediator of late preconditioning against myocardial infarction in conˉscious rabbits.Circulation，1998，98(5):441-449.
, http://www.100md.com
5 O’Rourke B.Myocardial K ATP channels in precondition.Circ Res，2000，87:845-855.
6 Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the1990s.Nature，1993，262:801.
7 Sirikci O，Ozer NK，Azzi A.Dietary cholesterol-induced changes of protein kinase C and the effect of vitamine E in rabbit aortic smooth muscle cells.Atherosclerosis，1996，126:253-263.
作者单位:416000湖南省湘西自治州人民医院
贵阳医学院附院心血管内科
(收稿日期:2003-09-23)
(编辑依 依), 百拇医药(罗亚雄)
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关键词 缺血预适应 高胆固醇血症 CD11b/CD18
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2004)04-0292-03
Protective effects of ischemic preconditioning on ischemia/reperfusion
myocardial injury in hypercholesterolemic rabbits
Luo Yaxiong，Huang Damei
Department of Cardiovascular Disease，Guiyang Medical College，Guiyang550004.
, 百拇医药 【Abstract】 Objective To investigate the effect of ischemic preconditioning on ischemia/reperfusion myocarˉdial infarct，PMNCD11b/CD18in hypercholesterolemic rabbits.Methods Male rabbits were fed with cholesterol enˉriched diet forfour weeks and then divided randomly into groups(A and B)without and with ischemic preconditionˉing，respectively.A second series of rabbits fed a normal diet were similarly divided into two groups(C and D)without and with preconditioning，respectively.All the animals were subjected to60min myocardium ischemia and120min myˉocardium reperfusion.Preconditioning animals(B and D)underwent twocycles of5min myocardium ischemia and10min myocardium reperfusion before60min myocardium ischemia.The expression of protein PMNCD11b/CD18was determined by immunohistochemistry.Myocardial infarct size(AN)and areas at risk(AAR)were delineated with Eˉvan’s blue and TTC staining.We also measured concentrations of total cholesterol in serum by CHOD-PAP.Results Cholesterol in groups A and B was1.31±0.39mmol/L at baseline and21.52±9.27mmol/L at four weeks(P<0.01)and in groups C and D1.45±0.84mmol/L before the surgical procedure.AN/AAR%was39.16±4.99%in group A，11.02±2.78%in group B(P<0.01)，38.00±4.88%in C and11.09±2.98%in D(P<0.01).The expression of protein PMNCD11b/CD18increased significantly in control groups(A and C)while no difference in isˉchemic preconditioning groups(B and D)except for that enhanced at the time of preischemia.Conclusion Ischemic preconditioning can attenuate ischemia/reperfusion myocardial infarct size and inhibit expression of protein PMˉNCD11b/CD18in hypercholesterolemic rabbits.
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Key words preconditioning hypercholesterolemia CD11b/CD18
中性粒细胞(PMN)粘附增强是PMN介导冠脉微循环障碍并导致心肌再灌注损伤的起始环节，抗粘附分子单抗治疗可减轻这种损伤 [1] 。缺血预适应(IPC)具有心肌保护效应已在许多正常动物模型中得到证实 [2～4] 。然而在高胆固醇血症家兔的心脏是否仍保留有IPC现象尚不清楚。本研究旨在探讨IPC对实验性高胆固醇血症家兔缺血再灌注(I/R)心肌梗死的影响，及是否与抑制中性粒细胞CD11b/CD18受体表达有关。
1 资料和方法
1.1 实验动物 实验用雄性家兔24只，体重2.94±0.44kg，随机分为2组，每组12只，一组给予0.5%高胆固醇饲料饲养4周，给予高胆固醇饲料饲养前后分别从耳缘静脉采血测胆固醇，然后随机分为对照组(A组，n=6)和实验组(B组，n=6);另一组给予普通饲料，耳缘静脉采血测胆固醇，随机分为对照组(C组，n=6)和实验组(D组，n=6)。
, 百拇医药
1.2 动物模型制备
3%戊巴比妥钠(1mg/kg)麻醉，机械呼吸，静脉插管，针形电极刺入肢体，接心电图机，必要时记录;胸骨左缘开胸，剪开心包膜，暴露心脏，于LAD近第一分支处穿引3-0号丝线，丝线套一小段橡皮管，将橡皮管两端丝线拉紧固定，即造成冠脉血流中断，供血区心肌颜色由鲜红转为暗紫色，心电图示ST段弓背向上抬高大于0.5mV，证实闭塞有效，放松丝线后，血流再通即再灌注。实验组(B组，D组)依次经历缺血5min，再灌注10min，反复2次，然后缺血60min，再灌注120min;对照组(A组，C组)缺血60min前观察30min，其余程序同实验组。
1.3 胆固醇测定 酶法测定血清总胆固醇，其检测步骤见胆固醇测定试剂盒(温州东瓯生物工程有限公司生产)说明书。
1.4 心肺梗死范围测定 再灌注120min末，即取心脏，原处结扎LAD，经主动脉逆行灌注0.5%Evan’s蓝染色3min，分离左心室并称重;从心尖向心底将左室横切成3～4mm薄片，将蓝染的正常区域和未染色的危险区域心肌分离并称重，将危险区域心肌浸入1%TTC的磷酸盐缓冲液(pH=7.4)中，37℃温浴20min后取出，将不着色的梗死区和染成砖红色的非梗死区心肌分离并称重，计算梗死区域心肌(AN)占危险区域心肌(AAR)重量的百分比和危险区域心肌占左室(LV)重量的百分比，缺血区心肌置-20℃冰箱保存 备用。
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1.5 免疫组织化学法测定PMN CD11b/CD18 取2ml肝素抗凝全血分离出中性粒细胞涂片，无水乙醇固定，加鼠抗兔CD11b单克隆抗体37℃孵育30min，PBS洗涤3次，加二抗置30min，PBS洗涤3次，加APAAP复合物静置30min，PBS洗涤3次，加碱性磷酸酶底物显色30min，自来水冲洗终止显色，苏木素复染1min，自来水冲洗，甘油明胶封片;光镜下观察PMN胞膜呈棕红色者为阳性细胞，随机计数100个PMN并计算出阳性细胞数。
1.6 统计学处理 所有数据经SAS6.12软件统计处理;计量资料以均数±标准差(X±s)表示;组间比较用成组t检验，组内比较用配对t检验;P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 血清总胆固醇浓度 高胆固醇饲料组(A、B组)在给予高胆固醇饲料喂养4周前后血清总胆固醇浓度分别为1.31±0.39mmol/L、21.59±9.27mmol/L，两者比较差异具有显著性(P<0.01);普通饲料组(C、D组)血清总胆固醇浓度为1.45±0.48mmol/L，与高胆固醇饲料组基础值比较差异无显著性。
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2.2 心肌梗死范围 IPC组(B、D组)分别与对照组(A、C组)比较，左室重量、危险心肌组织重量和危险心肌组织占左室重量的百分比之间差异无显著性;梗死组织重量和梗死组织占危险心肌组织重量的百分比之间差异有显著性(P<0.01)。A与C、B与D组间，各指标差异均无显著性(P>0.05)，见表1。
表1 心肌梗死范围 (X±s)
注:与对照组比较 ˇˇ P<0.01
2.3 缺血预适应不同时间PMN CD11b/CD18蛋白表达的变化 IPC组(B、D组)分别与对照组(A、C组)比较，在心肌缺血前PMN CD11b/CD18蛋白表达上调(P<0.05)，在心肌缺血1h和再灌注2h后PNM CD11b/CD18蛋白表达明显下调(P<0.01)，在基础时比较差异无显著性;A、C组缺血1h 和再灌注2h PMN CD11b/CD18蛋白表达与同组基础比较显著上调(P<0.01)，而缺血前与基础比较差异无显著性;B、D组缺血前PMN CD11b/CD18蛋白表达与同组基础比较上调(P<0.05)，而缺血1h和再灌注2h与同组基础比较差异无显著性，见表2。
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表2 缺血预适应不同时点PMN CD11b/CD18蛋白表达的变化
注:在不同时点与对照组比较 ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01;与同组基础比较 △ P<0.01
3 讨论
大量动物实验资料证实 [2～4] ，IPC具有明显的心脏保护作用，表现为缩小心梗面积，促进心肌功能恢复，减少再灌注心律失常的发生等。在IPC早期保护中，由eNOS产生 的NO能直接开放线粒体膜K + 通道，K + 通道开放能引起心肌保护作用，可能是由于K + 的进入使膜去极化，减少Ca 2+ 的进入使钙超载减轻，同时亦可促进已有的钙超载减轻及线粒体钙的释放，抑制细胞凋亡 [5] 。在高胆固醇血症，动脉粥样硬化尚未形成时，内皮细胞功能已受到影响，合成NO减少;另外，胆固醇刺激内皮细胞产生氧自由基，氧自由基与NO结合使其灭活 [6] 。但是，本研究结果表明，在高胆固醇血症家兔模型中IPC引起了同样的心肌保护效应，表现为缩小缺血再灌注引起心梗的面积，可能与血管内皮细胞、平滑肌细胞和巨噬细胞在受到高胆固醇影响下诱导产生iNOS并合成NO [6] 及PKC增加 [7] 有关。
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本实验结果显示:缺血再灌注使PMN CD11b/CD18蛋白表达显著增加，而且缺血期更明显，IPC刺激本身虽可激发PMN CD11b/CD18蛋白表达，但又有效阻抑了缺血再灌注后PMN CD11b/CD18蛋白表达的增加。众所周知，缺血心肌的存活依赖于血管再通时间及再通引起的再灌注损伤，而PMN粘附血管内皮是介导再灌注损伤的始动环节，PMN粘附血管内皮取决于PMN CD11b/CD18蛋白的表达，抗CD11/CD18抗体治疗可缩小缺血后心肌的梗死范围 [1] 。本实验结果说明:IPC通过抑制PMN CD11b/CD18蛋白的表达可减轻缺血后再灌注损伤，从而起到保护心肌作用。我们研究表明:IPC同样缩小实验性高胆固醇血症家兔缺血再灌注心肌梗死面积，抑制PMN CD11b/CD18蛋白表达。同时提示IPC对临床心血管病患者(如高血脂、高血压、动脉粥样硬化等)可能具有同样的保护作用。
参考文献
1 丁钢，沈景霞.心肌缺血再灌注损伤中一氧化氮与中性粒细胞之间的关系.心血管病学进展，2000，21(5):290-292.
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2 Murry CE，Jennings RB，Reimer KA.Preconditioning with ischaemia:a delay oflethal cell injury in ischaemic myocardium.Circulation，1986，74:1134-1136.
3 Garlid KD，Paucek P，Yarov-YarovoyV，et al.cardioprotective effect of diazoxide and its interaction with mitochondrial ATP-sensitive K chanˉnels Possiblemechonism of cardoprotection.Circ Res，1997，81:1072-7082.
4 Takano H，Manchikalapudi S，Tang X-L，et al.Niritc oxide synthase is the mediator of late preconditioning against myocardial infarction in conˉscious rabbits.Circulation，1998，98(5):441-449.
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5 O’Rourke B.Myocardial K ATP channels in precondition.Circ Res，2000，87:845-855.
6 Ross R.The pathogenesis of atherosclerosis:a perspective for the1990s.Nature，1993，262:801.
7 Sirikci O，Ozer NK，Azzi A.Dietary cholesterol-induced changes of protein kinase C and the effect of vitamine E in rabbit aortic smooth muscle cells.Atherosclerosis，1996，126:253-263.
作者单位:416000湖南省湘西自治州人民医院
贵阳医学院附院心血管内科
(收稿日期:2003-09-23)
(编辑依 依), 百拇医药(罗亚雄)