CK20与大肠癌微转移
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2004)01-0049-02
转移和侵袭是恶性肿瘤的重要特征，也是肿瘤患者死亡的主要原因 [1] 。近年来随着免疫学及分子生物学的发展，使大肠癌的微转移检测成为可能。微转移一般指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血循环、骨髓、肝、肺等组织器官中间的微小肿瘤细胞灶(<2mm)，常无任何临床表现，能够逃避免疫监视、侵犯血管和发展成肉眼可见的病变 [2] 。常规检查方法如CT、MRI、单抗放射显影技术、普通病理检查等都很难发现。微转移是一项独立的预后指标，其价值优于Dukes分期和肿瘤分级。细胞角蛋白20(CK20)是新发现的一种多肽，局限在胃肠上皮细胞 [3] ，几乎所有大肠癌都明显表达。通过检测细胞角蛋白mRNA表达来诊断大肠癌微转移状况，指导临床诊断和治疗成为目前研究热点之一。
1 CK20的理化特征及组织学特点
, 百拇医药
细胞角蛋白(CK)是分布于外胚层起源细胞中的中间纤维丝，为细胞骨架的组分之一。已知CK至少包括20个成员，分为酸性CK和碱性CK两大家族 [4] 。CK在细胞转化过程中一般保持其亚微结构和免疫学特性，检测蛋白类型可判断肿瘤组织来源，如癌组织是以富含CK为特征，肌肉肉瘤富含结蛋白，非肌肉肉瘤富含波形蛋白。CK20由Moll等 [5] 于1990年发现，含424个碱基酸，分子量为48553，等电点为5.66，属酸性。其编码DNA总长18kb，含8个外显子，7个内含子。其mRNA长1.75kb。CK20的合成首先出现于第8周胚胎的粘膜上皮中，之后广泛分布于杯状细胞和绒毛细胞中。不同于其它CK，CK20具有更为严格的上皮组织特异性 [3] 。正常组织中，CK20见于肠粘膜细胞、胃粘膜及幽门腺体细胞、十二指肠粘膜、泌尿系伞状细胞、表皮Merkel细胞，而其它正常组织如乳腺、平滑肌、血细胞、淋巴细胞、造血细胞都均为阴性 [6] 。CK20的表达在细胞发生化生、恶变、肿瘤转移、体外培养等改变时持续表达阳性。下列肿瘤CK20表达阳性:结肠直肠癌、胃腺癌及未分化癌、泌尿道移行细胞癌、胆道腺癌、胰管细胞腺癌、皮肤Merkel细胞癌等。CK20表达阴性的有:乳腺粘液腺癌和小叶腺癌、子宫内膜癌、卵巢非粘液腺癌、肾细胞癌、肺腺癌及鳞状细胞癌、鳞状细胞癌(子宫颈、咽、食道、皮肤)、肉瘤、恶性淋巴瘤等。CK20的分布特点使其成为良好的肿瘤标志物，也用来被鉴别肿瘤组织来源。
, 百拇医药
2 大肠癌微转移的检测方法
2.1 早期的几项检查 传统的区域淋巴结常规组织病理学检查是应用福尔马林固定的标片经石蜡包埋、切片和HE染色等步骤，一般统计在不足3个细胞直径的微小转移灶仅有1%的机会能被检出，其缺点是敏感性差且工作量过大难以推广。
2.2 淋巴结廓清技术 淋巴
结廓清技术通过增加受检淋巴结数目来达到检出转移灶的目的，即“二甲苯-乙醇清除技术”。将标本用福尔马林固定后用乙醇反复冲洗，之后用二甲苯将肠系膜的脂肪溶解、清除，从而将几乎所有的淋巴结检出，这一方法能显著增多淋巴结数目及检出转移的淋巴结。
2.3 免疫学技术 免疫学技术大致有免疫组化法、放射免疫导向法、流式细胞分析法。将组织标本与一抗一起孵育，再用免疫过氧化酶或免疫荧光素等标记物以检出肿瘤灶，免疫组化技术可从1～10万个淋巴细胞中找出1个肿瘤细胞;在检查骨髓抽吸液，可获得106正常细胞中检出1个肿瘤细胞的敏感度，检出率明显提高。目前免疫组化技术已被广泛用于微转移的检测，但该技术存在两大问题尚待解决。首先是抗体的标化和选择。目前尚未找到一种大肠癌特异的又有足够敏感性的抗体，这主要是尚未发现大肠癌特异性抗原。目前学者们普遍推荐使用的抗体是针对CEA，CK，EMA等抗原的。免疫组化技术的另一主要问题就是结果的判断缺乏客观的、标化的标准。
, http://www.100md.com
2.4 分子生物学 常用的方法有:MASA、RT PCR及荧光标记PCR，可准确检测1g组织或1ml液体中的1个癌细胞，被认为是目前检测微转移的最有效的方法。RT-PCR(逆转录酶PCR技术)是目前检测结直肠癌淋巴结微转移最常用的PCR技术，先将靶基因(如CEA，CK)的mRNA分离纯化，然后通过逆转录酶合成cDNA，再合成PCR引物，通过基因扩增来检测细胞中是否表达靶基因从而检测微转移。另一种基于PCR的MASA技术(mutant allele-specific amplification，突变等位基因特异扩增法)通过检测突变的基因片段而被用于结直肠癌淋巴结微转移的检测。RT-PCR和MASA技术除了敏感性高以外，它还具常规病理检查和免疫组化技术无法比拟的优点:作PCR扩增时将整个淋巴结标本的细胞DNA或RNA提取出来，克服了常规病理检查和免疫组化只取数个切面的缺点。而且，只要靶基因的引物序列统一，PCR技术的程序相对更容易标化和控制，结果的判断也比免疫组化要客观。荧光标记PCR [7] 即对样品全基因组进行荧光标记，采用该方法标记的样品，仅在样品两端各标上一个荧光分子，可以保持荧光量与PCR产物之间的线性关系，从而更能真实地反应出待检测样品地原始信息，标记样品具有长度比较均一，杂交条件易于控制，杂交结果信噪比高等特点。
, http://www.100md.com
3 大肠癌微转移的其他检测标志物
Hayashi等 [8] 年采用PCR对120例大肠癌患者常规诊断无转移的淋巴结进行了K-ras、p53基因突变检测，发现71例(59%)有淋巴结微转移存在。但大肠癌细胞中K-ras、p53突变率仅为50%左右，该方法敏感性较低。Mori等 [9] 1995年应用CEA mRNA的RT-PCR方法检测大肠癌区域淋巴结，发现88个常规诊断阴性的淋巴结中有47个表达阳性。然而，1996年Jonas等 [10] 报道各类大肠癌细胞中只有65%CEA表达阳性，健康人群却有23%CEA mRNA表达阳性，肝转移患者中84%表达阳性。
Wong等 [11] 1996年应用RT-PCR检测CD44突变，其优点为正常人无表达，但Gotley等[12] 发现某些大肠癌无CD44突变。Rosengerg等 [6] 应用免疫组化技术证实溃疡性结肠炎组织的隐窝区上皮细胞CD44v6mRNA表达增高。CK19是常见的角蛋白之一，对于大肠癌，其RT-PCR的检测明显提高了区域淋巴结的微转移诊断率 [13] ，但CK19mRNA低、中表达见于头颈部肿瘤、肺癌、乳腺癌、泌尿系肿瘤等多种肿瘤，特异性差，且也有假阳性结果，故降低了其诊断血循环、骨髓中微转移的价值。
, http://www.100md.com
4 CK20在诊断大肠癌微转移中的临床意义
CK20不同于其他角蛋白，它非常局限于胃肠上皮细胞，几乎所有大肠癌都明显表达且在侵袭、转移、扩散到其他组织器官时始终保持稳定。目前，我们推断大肠癌患者预后和选择术后治疗方案主要是根据患者的分期，但这些分期指标仍然存在不足，已经不能作为唯一指导治疗和判断预后的标准。骆成玉等 [14] 应用靶向细胞角蛋白20(CK20)基因mRNA的逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测了大肠癌淋巴结微转移情况。结果12例大肠癌患者的110个淋巴结经常规病理学检测，4例有淋巴结转移，阳性淋巴结13个，CK20RTPCR检测6例有淋巴结转移，阳性淋巴结28个。2种方法的阳性检出率差异有显著性意义(χ 2 =6.72，P<0.01)。汤睿等 [15] 用RT PCR检查法，结果可见，大肠癌患者205个淋巴结中有35个检测到ck20mRNA的表达，而病理组织学检查仅发现18个淋巴结存在肿瘤转移。该组17例中有4例按该检查方法由Dukes’A、B期改为Dukes’C期，或者我们可以说这些患者是DukesA、B期中的高危病例，应当进行更为积极的随访。微转移的检测较常规病理组织学检查具有更高的敏感性，是一个重要的指标它能帮助我们解释一些现象。对患者分期、判断预后、确定手术和术后的治疗方案具有重要的指导作用。具有良好的应用前景。对发现微转移的患者，应采取更积极的治疗方案。PCR法除检测淋巴结外，也能对患者的血液、骨髓和腹膜腔的微转移灶进行检测。它将对临床处理提供更多的指导和参考，具有良好的应用前景。通过检测CK20的表达可检测大肠癌淋巴结、血循环、骨髓的微转移。CK20被认为是检测肠癌微转移的良好标志物。Futamura等 [16] 和Bostick等 [17] 分别对大肠癌患者、乳 腺癌患者、正常人、良性疾病患者淋巴结进行CEA、CK19、CK20、肿瘤相关抗原733.2(GA733.2)、粘蛋白1(MUC-1)的mRNA RT-PCR联合检测，发现组织学检查为阴性的淋巴结中有40%左右已经有微转移。并且在正常人外周血和淋巴结中只有CK20无表达，其他标志物都有不同程度的假阳性。
, 百拇医药
5 CK20的有待解决的问题
5.1 微转移的转归取决于癌细胞的生物学特性、机体的免疫状态及宿主器官微环境，动物实验表明血循环中至少有10000个肿瘤细胞才可致显形转移 [2] ，多数发生凋亡，少数进入休眠甚至增殖，即微转移不会必然发生肿瘤的复发和转移，但它提示发生复发和转移的可能性大。
5.2 分子学技术本身存在一定的缺点:(1)因未直接见到癌细胞，存在突变型基因或基因产物不一定提示存在活的肿瘤细胞;(2)PCR技术极为敏感，需要有经验的技术操作;(3)沾染基因物质可产生假阳性结果;(4)扩增mRNA常需新鲜标本，库存的石蜡包埋块有时不适用于RT-PCR测定;(5)激素干扰可下调标记基因的表达，因之产生假阴性结果。
参考文献
1 高进.癌的侵袭与转移，北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1996，69.
, 百拇医药
2 Raj GV，et al.Cancer，1998，82:1419-1442.
3 Burchill SA，et al.Br J Cancer，1995，71:278-281.4 Moll R，et al.Cell，1982，31:11-24.
5 Moll R，et al.J Cell Biol，1990，111:567-580.
6 Wyld DK，et al.Int J Cancer，1998，79:193-288.
7 石嵘，马文丽，吴清华，等.用于SARS冠状病毒检测的60mer寡核苷酸基因芯片的设计与应用.科学通报，2003，48(12):1237-1241.
8 Wohlik N，et al.Endocrinol Metab Clin North Am，1996，25(1):1-25.
, http://www.100md.com
9 Mori M，et al.Cancer Res，1995，55:3417-3420.
10 #Jonas S，et al.Gut，1996，39:717-721.
11 Wong LS，et al.Br J Surg，1996，83s:20.
12 Gotley CD，et al.Br J Cancer，1996，74:342-351.
13 Denis MG，et al.Int J Cancer，1997，74:540-544.
14 骆成玉，李世拥，赵丹宁，等.大肠癌淋巴结微转移研究.中华外科杂志，2000，38(2):142.
15 汤睿.大肠癌淋巴结微转移基因检测的意义.癌症，2000，19(10):893-894.
16 Futamura M，et al.J Surg Oncol，1998，68:34-40.
17 Bostick PJ，et al.J Clin Oncol，1998，16:2632-2640.
作者单位:110003沈阳中国医科大学第二临床学院普外四科
(编辑黄 杰), 百拇医药(韩)
转移和侵袭是恶性肿瘤的重要特征，也是肿瘤患者死亡的主要原因 [1] 。近年来随着免疫学及分子生物学的发展，使大肠癌的微转移检测成为可能。微转移一般指非血液系统的恶性肿瘤在发展过程中，播散并存活于淋巴系统、血循环、骨髓、肝、肺等组织器官中间的微小肿瘤细胞灶(<2mm)，常无任何临床表现，能够逃避免疫监视、侵犯血管和发展成肉眼可见的病变 [2] 。常规检查方法如CT、MRI、单抗放射显影技术、普通病理检查等都很难发现。微转移是一项独立的预后指标，其价值优于Dukes分期和肿瘤分级。细胞角蛋白20(CK20)是新发现的一种多肽，局限在胃肠上皮细胞 [3] ，几乎所有大肠癌都明显表达。通过检测细胞角蛋白mRNA表达来诊断大肠癌微转移状况，指导临床诊断和治疗成为目前研究热点之一。
1 CK20的理化特征及组织学特点
, 百拇医药
细胞角蛋白(CK)是分布于外胚层起源细胞中的中间纤维丝，为细胞骨架的组分之一。已知CK至少包括20个成员，分为酸性CK和碱性CK两大家族 [4] 。CK在细胞转化过程中一般保持其亚微结构和免疫学特性，检测蛋白类型可判断肿瘤组织来源，如癌组织是以富含CK为特征，肌肉肉瘤富含结蛋白，非肌肉肉瘤富含波形蛋白。CK20由Moll等 [5] 于1990年发现，含424个碱基酸，分子量为48553，等电点为5.66，属酸性。其编码DNA总长18kb，含8个外显子，7个内含子。其mRNA长1.75kb。CK20的合成首先出现于第8周胚胎的粘膜上皮中，之后广泛分布于杯状细胞和绒毛细胞中。不同于其它CK，CK20具有更为严格的上皮组织特异性 [3] 。正常组织中，CK20见于肠粘膜细胞、胃粘膜及幽门腺体细胞、十二指肠粘膜、泌尿系伞状细胞、表皮Merkel细胞，而其它正常组织如乳腺、平滑肌、血细胞、淋巴细胞、造血细胞都均为阴性 [6] 。CK20的表达在细胞发生化生、恶变、肿瘤转移、体外培养等改变时持续表达阳性。下列肿瘤CK20表达阳性:结肠直肠癌、胃腺癌及未分化癌、泌尿道移行细胞癌、胆道腺癌、胰管细胞腺癌、皮肤Merkel细胞癌等。CK20表达阴性的有:乳腺粘液腺癌和小叶腺癌、子宫内膜癌、卵巢非粘液腺癌、肾细胞癌、肺腺癌及鳞状细胞癌、鳞状细胞癌(子宫颈、咽、食道、皮肤)、肉瘤、恶性淋巴瘤等。CK20的分布特点使其成为良好的肿瘤标志物，也用来被鉴别肿瘤组织来源。
, 百拇医药
2 大肠癌微转移的检测方法
2.1 早期的几项检查 传统的区域淋巴结常规组织病理学检查是应用福尔马林固定的标片经石蜡包埋、切片和HE染色等步骤，一般统计在不足3个细胞直径的微小转移灶仅有1%的机会能被检出，其缺点是敏感性差且工作量过大难以推广。
2.2 淋巴结廓清技术 淋巴
结廓清技术通过增加受检淋巴结数目来达到检出转移灶的目的，即“二甲苯-乙醇清除技术”。将标本用福尔马林固定后用乙醇反复冲洗，之后用二甲苯将肠系膜的脂肪溶解、清除，从而将几乎所有的淋巴结检出，这一方法能显著增多淋巴结数目及检出转移的淋巴结。
2.3 免疫学技术 免疫学技术大致有免疫组化法、放射免疫导向法、流式细胞分析法。将组织标本与一抗一起孵育，再用免疫过氧化酶或免疫荧光素等标记物以检出肿瘤灶，免疫组化技术可从1～10万个淋巴细胞中找出1个肿瘤细胞;在检查骨髓抽吸液，可获得106正常细胞中检出1个肿瘤细胞的敏感度，检出率明显提高。目前免疫组化技术已被广泛用于微转移的检测，但该技术存在两大问题尚待解决。首先是抗体的标化和选择。目前尚未找到一种大肠癌特异的又有足够敏感性的抗体，这主要是尚未发现大肠癌特异性抗原。目前学者们普遍推荐使用的抗体是针对CEA，CK，EMA等抗原的。免疫组化技术的另一主要问题就是结果的判断缺乏客观的、标化的标准。
, http://www.100md.com
2.4 分子生物学 常用的方法有:MASA、RT PCR及荧光标记PCR，可准确检测1g组织或1ml液体中的1个癌细胞，被认为是目前检测微转移的最有效的方法。RT-PCR(逆转录酶PCR技术)是目前检测结直肠癌淋巴结微转移最常用的PCR技术，先将靶基因(如CEA，CK)的mRNA分离纯化，然后通过逆转录酶合成cDNA，再合成PCR引物，通过基因扩增来检测细胞中是否表达靶基因从而检测微转移。另一种基于PCR的MASA技术(mutant allele-specific amplification，突变等位基因特异扩增法)通过检测突变的基因片段而被用于结直肠癌淋巴结微转移的检测。RT-PCR和MASA技术除了敏感性高以外，它还具常规病理检查和免疫组化技术无法比拟的优点:作PCR扩增时将整个淋巴结标本的细胞DNA或RNA提取出来，克服了常规病理检查和免疫组化只取数个切面的缺点。而且，只要靶基因的引物序列统一，PCR技术的程序相对更容易标化和控制，结果的判断也比免疫组化要客观。荧光标记PCR [7] 即对样品全基因组进行荧光标记，采用该方法标记的样品，仅在样品两端各标上一个荧光分子，可以保持荧光量与PCR产物之间的线性关系，从而更能真实地反应出待检测样品地原始信息，标记样品具有长度比较均一，杂交条件易于控制，杂交结果信噪比高等特点。
, http://www.100md.com
3 大肠癌微转移的其他检测标志物
Hayashi等 [8] 年采用PCR对120例大肠癌患者常规诊断无转移的淋巴结进行了K-ras、p53基因突变检测，发现71例(59%)有淋巴结微转移存在。但大肠癌细胞中K-ras、p53突变率仅为50%左右，该方法敏感性较低。Mori等 [9] 1995年应用CEA mRNA的RT-PCR方法检测大肠癌区域淋巴结，发现88个常规诊断阴性的淋巴结中有47个表达阳性。然而，1996年Jonas等 [10] 报道各类大肠癌细胞中只有65%CEA表达阳性，健康人群却有23%CEA mRNA表达阳性，肝转移患者中84%表达阳性。
Wong等 [11] 1996年应用RT-PCR检测CD44突变，其优点为正常人无表达，但Gotley等[12] 发现某些大肠癌无CD44突变。Rosengerg等 [6] 应用免疫组化技术证实溃疡性结肠炎组织的隐窝区上皮细胞CD44v6mRNA表达增高。CK19是常见的角蛋白之一，对于大肠癌，其RT-PCR的检测明显提高了区域淋巴结的微转移诊断率 [13] ，但CK19mRNA低、中表达见于头颈部肿瘤、肺癌、乳腺癌、泌尿系肿瘤等多种肿瘤，特异性差，且也有假阳性结果，故降低了其诊断血循环、骨髓中微转移的价值。
, http://www.100md.com
4 CK20在诊断大肠癌微转移中的临床意义
CK20不同于其他角蛋白，它非常局限于胃肠上皮细胞，几乎所有大肠癌都明显表达且在侵袭、转移、扩散到其他组织器官时始终保持稳定。目前，我们推断大肠癌患者预后和选择术后治疗方案主要是根据患者的分期，但这些分期指标仍然存在不足，已经不能作为唯一指导治疗和判断预后的标准。骆成玉等 [14] 应用靶向细胞角蛋白20(CK20)基因mRNA的逆转录聚合酶链反应(RTPCR)方法检测了大肠癌淋巴结微转移情况。结果12例大肠癌患者的110个淋巴结经常规病理学检测，4例有淋巴结转移，阳性淋巴结13个，CK20RTPCR检测6例有淋巴结转移，阳性淋巴结28个。2种方法的阳性检出率差异有显著性意义(χ 2 =6.72，P<0.01)。汤睿等 [15] 用RT PCR检查法，结果可见，大肠癌患者205个淋巴结中有35个检测到ck20mRNA的表达，而病理组织学检查仅发现18个淋巴结存在肿瘤转移。该组17例中有4例按该检查方法由Dukes’A、B期改为Dukes’C期，或者我们可以说这些患者是DukesA、B期中的高危病例，应当进行更为积极的随访。微转移的检测较常规病理组织学检查具有更高的敏感性，是一个重要的指标它能帮助我们解释一些现象。对患者分期、判断预后、确定手术和术后的治疗方案具有重要的指导作用。具有良好的应用前景。对发现微转移的患者，应采取更积极的治疗方案。PCR法除检测淋巴结外，也能对患者的血液、骨髓和腹膜腔的微转移灶进行检测。它将对临床处理提供更多的指导和参考，具有良好的应用前景。通过检测CK20的表达可检测大肠癌淋巴结、血循环、骨髓的微转移。CK20被认为是检测肠癌微转移的良好标志物。Futamura等 [16] 和Bostick等 [17] 分别对大肠癌患者、乳 腺癌患者、正常人、良性疾病患者淋巴结进行CEA、CK19、CK20、肿瘤相关抗原733.2(GA733.2)、粘蛋白1(MUC-1)的mRNA RT-PCR联合检测，发现组织学检查为阴性的淋巴结中有40%左右已经有微转移。并且在正常人外周血和淋巴结中只有CK20无表达，其他标志物都有不同程度的假阳性。
, 百拇医药
5 CK20的有待解决的问题
5.1 微转移的转归取决于癌细胞的生物学特性、机体的免疫状态及宿主器官微环境，动物实验表明血循环中至少有10000个肿瘤细胞才可致显形转移 [2] ，多数发生凋亡，少数进入休眠甚至增殖，即微转移不会必然发生肿瘤的复发和转移，但它提示发生复发和转移的可能性大。
5.2 分子学技术本身存在一定的缺点:(1)因未直接见到癌细胞，存在突变型基因或基因产物不一定提示存在活的肿瘤细胞;(2)PCR技术极为敏感，需要有经验的技术操作;(3)沾染基因物质可产生假阳性结果;(4)扩增mRNA常需新鲜标本，库存的石蜡包埋块有时不适用于RT-PCR测定;(5)激素干扰可下调标记基因的表达，因之产生假阴性结果。
参考文献
1 高进.癌的侵袭与转移，北京:北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1996，69.
, 百拇医药
2 Raj GV，et al.Cancer，1998，82:1419-1442.
3 Burchill SA，et al.Br J Cancer，1995，71:278-281.4 Moll R，et al.Cell，1982，31:11-24.
5 Moll R，et al.J Cell Biol，1990，111:567-580.
6 Wyld DK，et al.Int J Cancer，1998，79:193-288.
7 石嵘，马文丽，吴清华，等.用于SARS冠状病毒检测的60mer寡核苷酸基因芯片的设计与应用.科学通报，2003，48(12):1237-1241.
8 Wohlik N，et al.Endocrinol Metab Clin North Am，1996，25(1):1-25.
, http://www.100md.com
9 Mori M，et al.Cancer Res，1995，55:3417-3420.
10 #Jonas S，et al.Gut，1996，39:717-721.
11 Wong LS，et al.Br J Surg，1996，83s:20.
12 Gotley CD，et al.Br J Cancer，1996，74:342-351.
13 Denis MG，et al.Int J Cancer，1997，74:540-544.
14 骆成玉，李世拥，赵丹宁，等.大肠癌淋巴结微转移研究.中华外科杂志，2000，38(2):142.
15 汤睿.大肠癌淋巴结微转移基因检测的意义.癌症，2000，19(10):893-894.
16 Futamura M，et al.J Surg Oncol，1998，68:34-40.
17 Bostick PJ，et al.J Clin Oncol，1998，16:2632-2640.
作者单位:110003沈阳中国医科大学第二临床学院普外四科
(编辑黄 杰), 百拇医药(韩)