小细胞肺癌中p53基因突变与临床研究
【摘要】 目的 探讨小细胞肺癌的发生、发展机理，提高临床早期对小细胞肺癌患者的诊断水平。 方法 应用免疫组化和聚合酶链式反应———单链构象多态性分析的方法技术，对14例小细胞肺癌的石蜡包埋切片进行研究。 结果 p53基因的5、6、7、8外显子突变率为57.1%(8/14)。在小细胞肺癌组织中存在着较高的p53基因突变率。 结论 p53基因突变可能为人类肺癌发生的关键基因。
关键词 小细胞肺癌 p53基因 聚合酶链式反应———单链构象多态性 点突变
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)02-0105-02
The study of clinical significance of p53mutation in small cell lung cancer
Zhi Jinzhou，Wang Laifu，Liu Zhao，et al.
, http://www.100md.com
Infectious Hospital of Xinxiang，Xinxiang453000.
【Abstract】 Objective To discuss the production and development mechanismof the small cell lung cancer(SCLC)and raise the level of diagnosis to the SCLC patients in the early clinic period.Mehtods p53gene mutation in SCLC of14Paraffin embedded tissue section is observed by immunohistochemical staining(LSAB method)and Polymerize chain reacton and single strand conformation Polymorphism(PCR-SSCP)analysis.Results The positive rate of immunoˉhistochemical reaction is64.3%(9/14).p53gene point mutation in5，6，7and8are respectively21.4%(3/14);14.3%(2/14);7.1%(1/14).Conclusion High mutation rate of p53gene exiting in SCLC might be the crucial gene case of the human lung carcinoma.
, 百拇医药
Key words SCLC p53gene PCR-SSCP point mutation
肺癌在当今世界各国范围内其发生率正在逐年上升，它也是最常见的死亡原因之一。尽管近10年来在癌症的诊治方面已有许多新方法、新技术的问世，但肺癌的疗效仍很差，尤其是小细胞肺癌(SCLC) [1] 。为进一步探讨SCLC发生的分子机理，为临床早期诊断、提高疗效带来新的希望，本文对SCLC的p53基因进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料 源于我院和新乡医学院1991～2001年125例肺癌的石蜡包埋组织，选出其中SCLC14例作为研究对象，占11.2%。
1.2 免疫组化 主要试剂:鼠抗人p53单克隆抗体(Do-7、Dako公司)，生物素标记的兔抗体IgG(Link，Reagent公司)。染色方法:按试剂盒说明书采用LSAB法。DAB-H 2 O 2 显色，苏木素复染。每次实验均设阳性及阴性对照，以肺癌组织表达阳性片做阳性对照，正常肺组织为阴性对照，以TAB替代一抗做空白对照。阳性标准:10%～25%细胞着色(+)，25%～50%细胞着色(++)，>50%细胞着色(+++)。
, http://www.100md.com
1.3 DNA制备 采用酚-氯仿提取法，并测OD值备用。
1.4 PCR-SSCP检测 取PCR扩增产物5μl加入SSCP上样缓冲液，于沸水中10min，冰浴后立即上样于垂直电泳槽中的SSCP胶中。恒压50V，恒温15℃，12h后取出电泳胶放入100ml固定液中，在脱色摇床上固定12h，1g/L硝酸银染色30min，加入显色液显色后，用166.5mmol/L乙酸中止反应，封胶。
1.4.1 PCR扩增p53基因5-8外显子 应用四对引物(由北京大学医学院病理分子生物室合成)其序列如下:
Exon5:5′TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA3′5′CGCTATCTGAGCAGCCGCTCAT3′
Exon6:5′GATTGCTCTTAGGTCTGGCCCCT3′5′CAGACCTCAGCGGCTCATAGG3′
, 百拇医药
Exon7:5′CTGGGTTGGCTCTGACTGTACCA3′5′TGACCTGGAGTCTTCCAGTGTG3′
Exon8:5′GTAGTGGTAATCTACTGGGACGGA3′5′CTCGCTTAGTGCTCCCTGGGGGC3′
1.4.2 PCR扩增反应条件 95℃2min，95℃40s，55℃40s，72℃30s，30个循环，72℃延伸5min。
1.4.3 PCR-SSCP分析 取5μl PCR扩增产物+5μl SSCP上样液，100℃水浴10min立即上样于垂直电泳槽中SSCP胶孔中，恒压，恒温，电泳12h。
1.4.4 银染 取出电泳凝胶固定12h，0.1%硝酸银染色30min，1%乙酸终止反应，封胶。
1.4.5 结果判断 每次电泳的肿瘤标本都以正常肺组织扩增作对照，若同时电泳的肿瘤标本与正常相比较出现条带增多、减少或位置变动，即说明该样品存在基因突变。
, 百拇医药
2 结果
蛋白免疫组化反应:p53基因蛋白的阳性率为64.3%(9/14)。p53基因突变谱:p53基因的5、6、7、8外显子突变率为57.1%(8/14)。p53蛋白的免疫组化以应和p53基因突变谱与SCLC患者的年龄、性别、肿瘤的大小等无明显的相关性。
3 讨论
3.1 p53基因的突变在人类肺癌中是最常见的基因变异之一 人类基因片段外显子的长度多在200bp以内，应用PCR扩增的片段小于200bp时，PCR-SSCP检测基因突变的敏感性可达90%以上 [2] 。因此该方法已经成为人们用于检测人类基因突变的常用方法之一。有研究认为 [3] ，p53基因突变是肺癌最常见的基因变异之一。p53基因突变广泛分布在5—8层外显子，我们应用PCR-SSCP技术对14例SCLC的p53基因5—8外显子进行检测，其突变率达57.1%。比Kishimoto等 [4] 采用PCR-SSCP技术检测NSCLC p535—8外显子总突变率52.0%为高。故认为PCR-SSCP技术在检测SCLC中是一种非常显著和实用的方法，同时也是SCLC发生的重要关键性基因。
, 百拇医药
3.2 p53蛋白过度表达可以作为SCLC生物学行为的主要标志物 p53蛋白过度表达与临床上肺癌的病理相关性，过去已有较多的报道，大多数的研究结果认为p53过度表达预示着肺癌患者肿瘤的侵袭能力强，预后差 [5，6] 。Gaaman等人 [7] 使用免疫组化技术研究NSCLC，发现p53过度表达者占50.0%。我们应用识别p53蛋白第18—26位氨基酸表位的单克隆抗体D O-7对14例SCLC进行免疫组化染色，阳性率达64.3%，显著高于NSCLC。因此，p53蛋 白过度表达可以作为SCLC的主要指标和SCLC生物学行为的主要标志物。
3.3 p53蛋白与p53基因阳性率不一致性 在检测的14例SCLC中，免疫组化阳性率为64.3%，而PCR—SSCP分析的阳性率为57.1%，二者之间存在着不平衡性。我们认为:除突变型p53蛋白被免疫组化方法检出外，近年来研究认为 [8] ，一些细胞基因产物，如MDM 2 蛋白也可以与野生型p53蛋白作用而影响其降解过PCR-SSCP的阳性率。另外，位于5—8以外的外显子没有被检测到，也是其原因之一。
, 百拇医药
3.4 肺癌中的p53基因突变率居人类各种肿瘤之首 [9] p53突变图谱的变化与人类癌症的病因和发病学密切相关，p53功能失活在肺癌的发生、发展过程中起着非常重要的作用。因此，进一步阐明p53的生物学特性和作用机理对于肺癌的早期诊断、生物学行为的判断、发生学等都具有重要的意义。而揭示肺癌中p53基因的突变位点至关重要，这方面的工作，有待于进一步研究。
参考文献
1 Lin AY，Ihed DC.Recent developments in the treatment of Lung cancer.JA-MA，1992，367-1661.
2 Spagnole DV，Turbett CR.Polymearse chain reaction and single-strand conformartion Polymorphism analysis(PCR-SSCP).Anovel means of deˉtecting DNA mutation.Adv Anat Pathol，1994，1:61.
, 百拇医药
3 Ryrerg G，Kure E，Lystard S，et al.p53mutation in Lung tumor relationˉship putative Sucepibilitymarkers for cancer.Cancer Res，1994，54:1551.
4 Kisnimoto Y，Shiraishi M.A beration of the p53tumor Suppressor gene in human non-small celllung carcinomas of the lung cancer.Cancer Res，1992，52:4779.
5 Fontanin G，Bigini D，Vignati S，et al.p53expression in Nsclc:clinical andbiological correlations.Cancer Res，1993，13:737.
, 百拇医药
6 Quinlan DC，Davidson AG，Summres.CL，et al.Accumulation of p53proˉtein correlates with a poor prognosis in human lung cancer.Cancer Res，1992，52:4828.
7 Canman J，Ruggen B，Momikis，et al.Detecton of p53in primay lung tuˉmorw and non-small cll lung carcinoma cell line.Am J Pathol，1991，139:839.
8 Han PA，Lane DP.p53tumor patholopy:can we trust immunohisˉtochenistry?J pathol，1994，172:1.
9 Greenbatt MS，Bennett WPK，Hollatein M，et al.Mutation in the p53tuˉmor suppressor gene cluse to cancer etiology and molecular phthologpneˉsis.Cancer Res，1994，54:4855.
(收稿日期:2003-05-05) (编辑 秋实), 百拇医药(职锦州)
关键词 小细胞肺癌 p53基因 聚合酶链式反应———单链构象多态性 点突变
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)02-0105-02
The study of clinical significance of p53mutation in small cell lung cancer
Zhi Jinzhou，Wang Laifu，Liu Zhao，et al.
, http://www.100md.com
Infectious Hospital of Xinxiang，Xinxiang453000.
【Abstract】 Objective To discuss the production and development mechanismof the small cell lung cancer(SCLC)and raise the level of diagnosis to the SCLC patients in the early clinic period.Mehtods p53gene mutation in SCLC of14Paraffin embedded tissue section is observed by immunohistochemical staining(LSAB method)and Polymerize chain reacton and single strand conformation Polymorphism(PCR-SSCP)analysis.Results The positive rate of immunoˉhistochemical reaction is64.3%(9/14).p53gene point mutation in5，6，7and8are respectively21.4%(3/14);14.3%(2/14);7.1%(1/14).Conclusion High mutation rate of p53gene exiting in SCLC might be the crucial gene case of the human lung carcinoma.
, 百拇医药
Key words SCLC p53gene PCR-SSCP point mutation
肺癌在当今世界各国范围内其发生率正在逐年上升，它也是最常见的死亡原因之一。尽管近10年来在癌症的诊治方面已有许多新方法、新技术的问世，但肺癌的疗效仍很差，尤其是小细胞肺癌(SCLC) [1] 。为进一步探讨SCLC发生的分子机理，为临床早期诊断、提高疗效带来新的希望，本文对SCLC的p53基因进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料 源于我院和新乡医学院1991～2001年125例肺癌的石蜡包埋组织，选出其中SCLC14例作为研究对象，占11.2%。
1.2 免疫组化 主要试剂:鼠抗人p53单克隆抗体(Do-7、Dako公司)，生物素标记的兔抗体IgG(Link，Reagent公司)。染色方法:按试剂盒说明书采用LSAB法。DAB-H 2 O 2 显色，苏木素复染。每次实验均设阳性及阴性对照，以肺癌组织表达阳性片做阳性对照，正常肺组织为阴性对照，以TAB替代一抗做空白对照。阳性标准:10%～25%细胞着色(+)，25%～50%细胞着色(++)，>50%细胞着色(+++)。
, http://www.100md.com
1.3 DNA制备 采用酚-氯仿提取法，并测OD值备用。
1.4 PCR-SSCP检测 取PCR扩增产物5μl加入SSCP上样缓冲液，于沸水中10min，冰浴后立即上样于垂直电泳槽中的SSCP胶中。恒压50V，恒温15℃，12h后取出电泳胶放入100ml固定液中，在脱色摇床上固定12h，1g/L硝酸银染色30min，加入显色液显色后，用166.5mmol/L乙酸中止反应，封胶。
1.4.1 PCR扩增p53基因5-8外显子 应用四对引物(由北京大学医学院病理分子生物室合成)其序列如下:
Exon5:5′TACTCCCCTGCCCTCAACAAGA3′5′CGCTATCTGAGCAGCCGCTCAT3′
Exon6:5′GATTGCTCTTAGGTCTGGCCCCT3′5′CAGACCTCAGCGGCTCATAGG3′
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Exon7:5′CTGGGTTGGCTCTGACTGTACCA3′5′TGACCTGGAGTCTTCCAGTGTG3′
Exon8:5′GTAGTGGTAATCTACTGGGACGGA3′5′CTCGCTTAGTGCTCCCTGGGGGC3′
1.4.2 PCR扩增反应条件 95℃2min，95℃40s，55℃40s，72℃30s，30个循环，72℃延伸5min。
1.4.3 PCR-SSCP分析 取5μl PCR扩增产物+5μl SSCP上样液，100℃水浴10min立即上样于垂直电泳槽中SSCP胶孔中，恒压，恒温，电泳12h。
1.4.4 银染 取出电泳凝胶固定12h，0.1%硝酸银染色30min，1%乙酸终止反应，封胶。
1.4.5 结果判断 每次电泳的肿瘤标本都以正常肺组织扩增作对照，若同时电泳的肿瘤标本与正常相比较出现条带增多、减少或位置变动，即说明该样品存在基因突变。
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2 结果
蛋白免疫组化反应:p53基因蛋白的阳性率为64.3%(9/14)。p53基因突变谱:p53基因的5、6、7、8外显子突变率为57.1%(8/14)。p53蛋白的免疫组化以应和p53基因突变谱与SCLC患者的年龄、性别、肿瘤的大小等无明显的相关性。
3 讨论
3.1 p53基因的突变在人类肺癌中是最常见的基因变异之一 人类基因片段外显子的长度多在200bp以内，应用PCR扩增的片段小于200bp时，PCR-SSCP检测基因突变的敏感性可达90%以上 [2] 。因此该方法已经成为人们用于检测人类基因突变的常用方法之一。有研究认为 [3] ，p53基因突变是肺癌最常见的基因变异之一。p53基因突变广泛分布在5—8层外显子，我们应用PCR-SSCP技术对14例SCLC的p53基因5—8外显子进行检测，其突变率达57.1%。比Kishimoto等 [4] 采用PCR-SSCP技术检测NSCLC p535—8外显子总突变率52.0%为高。故认为PCR-SSCP技术在检测SCLC中是一种非常显著和实用的方法，同时也是SCLC发生的重要关键性基因。
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3.2 p53蛋白过度表达可以作为SCLC生物学行为的主要标志物 p53蛋白过度表达与临床上肺癌的病理相关性，过去已有较多的报道，大多数的研究结果认为p53过度表达预示着肺癌患者肿瘤的侵袭能力强，预后差 [5，6] 。Gaaman等人 [7] 使用免疫组化技术研究NSCLC，发现p53过度表达者占50.0%。我们应用识别p53蛋白第18—26位氨基酸表位的单克隆抗体D O-7对14例SCLC进行免疫组化染色，阳性率达64.3%，显著高于NSCLC。因此，p53蛋 白过度表达可以作为SCLC的主要指标和SCLC生物学行为的主要标志物。
3.3 p53蛋白与p53基因阳性率不一致性 在检测的14例SCLC中，免疫组化阳性率为64.3%，而PCR—SSCP分析的阳性率为57.1%，二者之间存在着不平衡性。我们认为:除突变型p53蛋白被免疫组化方法检出外，近年来研究认为 [8] ，一些细胞基因产物，如MDM 2 蛋白也可以与野生型p53蛋白作用而影响其降解过PCR-SSCP的阳性率。另外，位于5—8以外的外显子没有被检测到，也是其原因之一。
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3.4 肺癌中的p53基因突变率居人类各种肿瘤之首 [9] p53突变图谱的变化与人类癌症的病因和发病学密切相关，p53功能失活在肺癌的发生、发展过程中起着非常重要的作用。因此，进一步阐明p53的生物学特性和作用机理对于肺癌的早期诊断、生物学行为的判断、发生学等都具有重要的意义。而揭示肺癌中p53基因的突变位点至关重要，这方面的工作，有待于进一步研究。
参考文献
1 Lin AY，Ihed DC.Recent developments in the treatment of Lung cancer.JA-MA，1992，367-1661.
2 Spagnole DV，Turbett CR.Polymearse chain reaction and single-strand conformartion Polymorphism analysis(PCR-SSCP).Anovel means of deˉtecting DNA mutation.Adv Anat Pathol，1994，1:61.
, 百拇医药
3 Ryrerg G，Kure E，Lystard S，et al.p53mutation in Lung tumor relationˉship putative Sucepibilitymarkers for cancer.Cancer Res，1994，54:1551.
4 Kisnimoto Y，Shiraishi M.A beration of the p53tumor Suppressor gene in human non-small celllung carcinomas of the lung cancer.Cancer Res，1992，52:4779.
5 Fontanin G，Bigini D，Vignati S，et al.p53expression in Nsclc:clinical andbiological correlations.Cancer Res，1993，13:737.
, 百拇医药
6 Quinlan DC，Davidson AG，Summres.CL，et al.Accumulation of p53proˉtein correlates with a poor prognosis in human lung cancer.Cancer Res，1992，52:4828.
7 Canman J，Ruggen B，Momikis，et al.Detecton of p53in primay lung tuˉmorw and non-small cll lung carcinoma cell line.Am J Pathol，1991，139:839.
8 Han PA，Lane DP.p53tumor patholopy:can we trust immunohisˉtochenistry?J pathol，1994，172:1.
9 Greenbatt MS，Bennett WPK，Hollatein M，et al.Mutation in the p53tuˉmor suppressor gene cluse to cancer etiology and molecular phthologpneˉsis.Cancer Res，1994，54:4855.
(收稿日期:2003-05-05) (编辑 秋实), 百拇医药(职锦州)