组织工程技术在泌尿外科重建中的研究进展
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)02-0128-03
泌尿系外科重建术是用替代材料修复治疗一些由于先天性或因炎症、感染、肿瘤或创伤而引起的泌尿系病损的一种治疗方法。目前替代材料有4种来源:(1)合成材料;(2)非泌尿系来源的天然替代材料;(3)患者自体泌尿系组织;(4)组织工程学。合成材料存在结构、机械性能和生物相容性等方面的问题而易导致手术失败。非泌尿系来源的天然替代材料也常因其与泌尿系统组织生物特性不同而导致许多问题:如用肠壁组织替代部分膀胱壁，则存在代谢异常、感染、尿路结石和粘液分泌增多等一系列并发症 [1] ，并且天然材料随移植时间的推移会发生挛缩。自体泌尿系组织是泌尿外科重建术中最佳替代材料，但因其来源有限以及术后存在膀胱容量不足等其他问题，因此临床应用受到限制。
随着生命科学、材料科学及相关学科的迅猛发展，诞生一门新兴交叉学科—组织工程学。组织工程学的兴起为泌尿系组织或器官的重建开辟了新的途径。组织工程学是应用工程学生物材料学和生命科学技术，根据哺乳动物组织、功能和结构生理机能，研究能够修复或替代病损组织或器官功能的一门边缘科学 [2，3] 。其基本原理和方法是先分离自体或异体组织的细胞，经体外扩增达到一定的数量后，将这些细胞种植在预先构建好的聚合物或天然细胞外基质骨架上。这种骨架提供了细胞三维生长的支架，在适宜的条件下(体内和体外)，细胞沿聚合物骨架迁移、铺展、生长和分化，最终形成具有特定形态和功能的工程组织，亦可直接植入同种或异种细胞外基质替代物(Extracellular Matrix，ECM)，其周边正常组织沿植入的ECM再生，而形成组织替代。
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1 生物支架应用研究现状
生物支架在组织工程学中起很关键作用，理想的生物支架应具备正常细胞外基质的功能:(1)良好的组织相容性，不发生排斥反应;(2)具有三维立体结构，能提供细胞粘附和生长空间;(3)无毒性，适当降解速率，降解产物应可吸收;(4)易塑型有一定的强度对抗外力，并能调节细胞粘附、增殖、转移和分化 [4～8] 。
1.1 天然材料 是指从动物或人体组织中通过酶解及盐类、酸类提取的结构蛋白，并通过人工合成基底膜，使其结构更加接近机体成分结构。其主要成分是胶原纤维、弹性纤维和网状纤维。含有能促进细胞粘附因子，有较高的张力和弹性，但其塑型性差，尚存在外来胶原产生免疫反应问题 [9，10] 。
1.2 细胞外基质 主要指小肠粘膜下层(SIS)，膀胱粘膜下层(BAMG)。通过生物化学方法去除组织中的细胞及一些抗原成分，仅保留无细胞的细胞外基质框架，因其与细胞外基质十分接近，因而有利于细胞粘附和生长。缺点是:小肠粘膜可以再生，且肠腔狭窄不易形成较大腔，浆膜去除后会发生很大收缩，影响扩大效果 [10～13] 。
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1.3 人工合成支架 主要有聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、L型聚乳酸(PLLA)等。这类人工材料制成基膜，可作为细胞的附着物或移植复合物的内在结构，为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获取足够的营养物质，进行气体交换，排除废物。人们尚可将此种替代材料按要求制成各种形状及不同大小，还可通过改变聚合物的组成比例，对其降解时间精确控制。以避免降解时间过短，正常组织来不及形成支架而塌陷，或是降解时间过长造成炎症反应等。此类材料缺点是组织相容性差，可引起不同程度炎症反应 [5，9] 。
2 组织器官替代的研究
国内外对泌尿系组织替代研究开展的很广泛，目前在一些组织器官的修复或替代的研究已取得了初步的成功，已有少数成果初步应用于临床。
2.1 肾 肾功能衰竭病人肾移植以前只能靠透析维持生命，但肾脏不是单一滤除代谢废物的器官，它同时具有内分泌功能，因此长期进行透析的患者，其体内代谢将会发生改变，并由此引发一系列并发症 [11，14] 。有数据表明长期应用血液透析的患者，其5年生存率仅为43% [15] 。Humes等用纤维管内种植上肾脏细胞，形成人工滤过系统、人工肾小管、人工合成滤过和肾小管联合系统。实验测试表明，这些人工合成的系统有滤过和重吸收功能。它可以转运钠离子、碳酸氢根阴离子、糖、阴离子。同时测得有氨基酸生长，这种系统能分泌谷胱甘肽还原酶和促红细胞生长素。能清除自由基，滤过率明显优于对照组，可降低实验动物血中BUN和SCr水平 [8，14] 。Atala等人已成功地将远端小管、肾小管、近端小管三种细胞分离培养，成功地培养出肾小管、肾小球。且已证明其分泌的黄色液体含尿酸和肌酐 [6，8，10] 。但目前的研究成果距离真正意义的肾脏替代仍很遥远。
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2.2 输尿管 理想的输尿管替代材料应具备如下标准:(1)与正常输尿管组织结构相近;(2)与宿主输尿管蠕动节律一致;(3)充足的血供;(4)无尿液渗漏，不被吸收;(5)不引起免疫反应;(6)无结石形成;(7)技术上简便可行;(8)吻合口处不易形成狭窄;(9)有正常神经再生及灵敏的药理学反应 [15] 。Dahms等用异体输尿管细胞外基质进行输尿管替代，研究发现:1周时ECM边缘腔内面已见移行上皮细胞，管壁有肌细胞长入。6周时ECM区已修复至近正常输尿管组织结构。12周后可观察到神经组织再生，尽管数量明显少于正常，但形态正常。4个月后明显增多。3周后的血尿常规及血生化正常，淋巴细胞毒实验与术前差异无显著性。12、24周行IVU检查，输尿管显影通畅良好，未见结石形成。
2.3 膀胱 对于膀胱的修复替代研究较多，所用支架材料上述三种均有报道，但以SIS、BAMG应用较多。Yoo(1996年)应用组织工程技术进行了再造膀胱的实验研究 [16] 。首先对狗进行膀胱活检以获取小块组织，体外培养并大量扩增膀胱上皮细胞和平滑肌细胞，经扩增后的两种细胞分别被接种到支架材料两侧，形成细胞与支架材料的复合体。单纯支架材料作为对照组。在实验狗的膀胱顶部作十字形切开术，用细胞支架材料复合体修复膀胱壁获得成 。Oberpenning(1999) [17] 将18只狗行保留膀胱三角区的膀胱次全切除术，并对缺损的膀胱进行修复。实验随机分为以下三组:A组仅行膀胱三角区闭合术;B组单纯应用可降解支架材料进行修复;C组应用再造的组织工程化细胞支架复合体进行修复重建膀胱。所有动物在术前术后行尿动力学和X线照片检查，并分别在术后不同时间处死动物，行组织学及免疫组织化学检查，结果显示:术后11个月取材，检查发现A组和B组膀胱分别保持术前容量的 24%和46%，而C组膀胱的平均容量为术前的95%。A组和B组膀胱顺应性都明显地降低，术后11个月，分别为术前的10%和42%，而C组膀胱顺应性几乎未发生变化。组织学检查亦显示了正常的膀胱壁结构:移行上皮细胞层、基底层和肌细胞层。上皮细胞层和肌细胞层的免疫细胞化学分析表明:在平滑肌细胞层有α-肌动蛋白阳性表达以及在移行上皮细胞层有角蛋白-7与AE1/AE3阳性表达，与此同时，移植物针对S-100染色阳性，表明再造的膀胱器官内有神经组织长入。上述结果均表明，组织工程化膀胱具有良好的膀胱修复能力和潜在的临床应用前景。
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2.4 尿道 尿道重建或修补，最初采用管型支架，种上膀胱粘膜及平滑肌细胞，进行动物实验获得成功 [5] 。但现今多以BAMG、SIS或其他生物支架不带细胞，主要依靠宿主细胞向支架上长入 [11，13，18，19] 。术后尿道造影未见狭窄，尿动力学检查亦正常 [13，19] 。目前已有用同种异体BAMG进行尿道修复的报告，术后随访3年效果良好 [13，18] 。其问题是:(1)缺损大的移植后是否能有足够的宿主长入支架;(2)具体多大缺损适合应用该方式还不知道;(3)术后仍有尿瘘发生 [9，11] ;(4)不带细胞的BAMG尿道重建其收缩可能会产生狭窄 [6] 。优点是:减少供体损伤尤其适合多次手术，可用于组织短缺的病人;减少手术和住院时间，手术操作简单损伤小 [13，18] 。本研究小组应用组织工程技术，将人工皮肤制成似尿道的管状物，移入动物体内继续培养，已获得初步成功。
参考文献
1 Melmon KL，Rosen SW.Am J Med，1964;36:595-617.
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2 Pollok JM，Valant JP.Semin Pediatr Surg，1996，5(3):191-196.
3 Langer R，Vacanti JP.Science，1993，260:920-925.
4 ProbstM，Ddahyia R，Cairrer S，et al.Britsh Joumal of Urology，1997，79:505-515.
5 Atala A，Freeman MR，Vacanti PJ，et al.J Urol，1993，vol150:608-612.
6 Atala A.Future perspectives in reconstructive surgery using tissue engiˉneering.Urologic clinics of north America，1999，26:157-165.
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7 Reddy PP，Barrieras PJ，Wilson G，et al.J Urol，2000，vol164:936-941.
8 Amiel GE，Yoo JJ.World J Urol，2000，18:71-79.
9 Byung soo kim，Carlos E.Baze，Anthony Atala.J urol，2000，18:2-9.
10 Karl Dietrich sievert，Emil A Tanagho.World J Urol，2000，18:19-25.
11 Fang Chen，James，Yoo J，et al.Urology，1999，54(3):407-410.
12 James J Yoo，Jun Meng，Frank Oberpeming，et al.Urology，1998，51(2):221-225.
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13 Fang Chen，Yoo JJ，Atala A.World J Urol，2000，18:67-70.
14 Huavid Humes.Kidney Int，1995，48:26-32.
15 Woods JD，Dvaid Humes.Kindey Seminars in Nephrology，1997，vol17(4):381-386.
16 Glavac D，Neumann HPH，Wittke C，et al.Hum Genet，1996，98:271-280.
17 Yoshida M，Ashida SH，Kondo K，et al.Jpn J Cancer Res，2000，91:204 -212.
18 Atala A，Luis Guzman，Alan B，et al.J Urol，1999，vol162:1148-1151.
19 Sievert KD，Bakircioclu ME，Lora Numes，et al.J Urol，2000，vol163:1958-1965.
(收稿日期:2003-04-28) (编辑 李年令), 百拇医药(张春阳)
泌尿系外科重建术是用替代材料修复治疗一些由于先天性或因炎症、感染、肿瘤或创伤而引起的泌尿系病损的一种治疗方法。目前替代材料有4种来源:(1)合成材料;(2)非泌尿系来源的天然替代材料;(3)患者自体泌尿系组织;(4)组织工程学。合成材料存在结构、机械性能和生物相容性等方面的问题而易导致手术失败。非泌尿系来源的天然替代材料也常因其与泌尿系统组织生物特性不同而导致许多问题:如用肠壁组织替代部分膀胱壁，则存在代谢异常、感染、尿路结石和粘液分泌增多等一系列并发症 [1] ，并且天然材料随移植时间的推移会发生挛缩。自体泌尿系组织是泌尿外科重建术中最佳替代材料，但因其来源有限以及术后存在膀胱容量不足等其他问题，因此临床应用受到限制。
随着生命科学、材料科学及相关学科的迅猛发展，诞生一门新兴交叉学科—组织工程学。组织工程学的兴起为泌尿系组织或器官的重建开辟了新的途径。组织工程学是应用工程学生物材料学和生命科学技术，根据哺乳动物组织、功能和结构生理机能，研究能够修复或替代病损组织或器官功能的一门边缘科学 [2，3] 。其基本原理和方法是先分离自体或异体组织的细胞，经体外扩增达到一定的数量后，将这些细胞种植在预先构建好的聚合物或天然细胞外基质骨架上。这种骨架提供了细胞三维生长的支架，在适宜的条件下(体内和体外)，细胞沿聚合物骨架迁移、铺展、生长和分化，最终形成具有特定形态和功能的工程组织，亦可直接植入同种或异种细胞外基质替代物(Extracellular Matrix，ECM)，其周边正常组织沿植入的ECM再生，而形成组织替代。
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1 生物支架应用研究现状
生物支架在组织工程学中起很关键作用，理想的生物支架应具备正常细胞外基质的功能:(1)良好的组织相容性，不发生排斥反应;(2)具有三维立体结构，能提供细胞粘附和生长空间;(3)无毒性，适当降解速率，降解产物应可吸收;(4)易塑型有一定的强度对抗外力，并能调节细胞粘附、增殖、转移和分化 [4～8] 。
1.1 天然材料 是指从动物或人体组织中通过酶解及盐类、酸类提取的结构蛋白，并通过人工合成基底膜，使其结构更加接近机体成分结构。其主要成分是胶原纤维、弹性纤维和网状纤维。含有能促进细胞粘附因子，有较高的张力和弹性，但其塑型性差，尚存在外来胶原产生免疫反应问题 [9，10] 。
1.2 细胞外基质 主要指小肠粘膜下层(SIS)，膀胱粘膜下层(BAMG)。通过生物化学方法去除组织中的细胞及一些抗原成分，仅保留无细胞的细胞外基质框架，因其与细胞外基质十分接近，因而有利于细胞粘附和生长。缺点是:小肠粘膜可以再生，且肠腔狭窄不易形成较大腔，浆膜去除后会发生很大收缩，影响扩大效果 [10～13] 。
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1.3 人工合成支架 主要有聚乳酸(PLA)、聚羟基乙酸(PGA)、L型聚乳酸(PLLA)等。这类人工材料制成基膜，可作为细胞的附着物或移植复合物的内在结构，为细胞提供生存的三维空间，有利于细胞获取足够的营养物质，进行气体交换，排除废物。人们尚可将此种替代材料按要求制成各种形状及不同大小，还可通过改变聚合物的组成比例，对其降解时间精确控制。以避免降解时间过短，正常组织来不及形成支架而塌陷，或是降解时间过长造成炎症反应等。此类材料缺点是组织相容性差，可引起不同程度炎症反应 [5，9] 。
2 组织器官替代的研究
国内外对泌尿系组织替代研究开展的很广泛，目前在一些组织器官的修复或替代的研究已取得了初步的成功，已有少数成果初步应用于临床。
2.1 肾 肾功能衰竭病人肾移植以前只能靠透析维持生命，但肾脏不是单一滤除代谢废物的器官，它同时具有内分泌功能，因此长期进行透析的患者，其体内代谢将会发生改变，并由此引发一系列并发症 [11，14] 。有数据表明长期应用血液透析的患者，其5年生存率仅为43% [15] 。Humes等用纤维管内种植上肾脏细胞，形成人工滤过系统、人工肾小管、人工合成滤过和肾小管联合系统。实验测试表明，这些人工合成的系统有滤过和重吸收功能。它可以转运钠离子、碳酸氢根阴离子、糖、阴离子。同时测得有氨基酸生长，这种系统能分泌谷胱甘肽还原酶和促红细胞生长素。能清除自由基，滤过率明显优于对照组，可降低实验动物血中BUN和SCr水平 [8，14] 。Atala等人已成功地将远端小管、肾小管、近端小管三种细胞分离培养，成功地培养出肾小管、肾小球。且已证明其分泌的黄色液体含尿酸和肌酐 [6，8，10] 。但目前的研究成果距离真正意义的肾脏替代仍很遥远。
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2.2 输尿管 理想的输尿管替代材料应具备如下标准:(1)与正常输尿管组织结构相近;(2)与宿主输尿管蠕动节律一致;(3)充足的血供;(4)无尿液渗漏，不被吸收;(5)不引起免疫反应;(6)无结石形成;(7)技术上简便可行;(8)吻合口处不易形成狭窄;(9)有正常神经再生及灵敏的药理学反应 [15] 。Dahms等用异体输尿管细胞外基质进行输尿管替代，研究发现:1周时ECM边缘腔内面已见移行上皮细胞，管壁有肌细胞长入。6周时ECM区已修复至近正常输尿管组织结构。12周后可观察到神经组织再生，尽管数量明显少于正常，但形态正常。4个月后明显增多。3周后的血尿常规及血生化正常，淋巴细胞毒实验与术前差异无显著性。12、24周行IVU检查，输尿管显影通畅良好，未见结石形成。
2.3 膀胱 对于膀胱的修复替代研究较多，所用支架材料上述三种均有报道，但以SIS、BAMG应用较多。Yoo(1996年)应用组织工程技术进行了再造膀胱的实验研究 [16] 。首先对狗进行膀胱活检以获取小块组织，体外培养并大量扩增膀胱上皮细胞和平滑肌细胞，经扩增后的两种细胞分别被接种到支架材料两侧，形成细胞与支架材料的复合体。单纯支架材料作为对照组。在实验狗的膀胱顶部作十字形切开术，用细胞支架材料复合体修复膀胱壁获得成 。Oberpenning(1999) [17] 将18只狗行保留膀胱三角区的膀胱次全切除术，并对缺损的膀胱进行修复。实验随机分为以下三组:A组仅行膀胱三角区闭合术;B组单纯应用可降解支架材料进行修复;C组应用再造的组织工程化细胞支架复合体进行修复重建膀胱。所有动物在术前术后行尿动力学和X线照片检查，并分别在术后不同时间处死动物，行组织学及免疫组织化学检查，结果显示:术后11个月取材，检查发现A组和B组膀胱分别保持术前容量的 24%和46%，而C组膀胱的平均容量为术前的95%。A组和B组膀胱顺应性都明显地降低，术后11个月，分别为术前的10%和42%，而C组膀胱顺应性几乎未发生变化。组织学检查亦显示了正常的膀胱壁结构:移行上皮细胞层、基底层和肌细胞层。上皮细胞层和肌细胞层的免疫细胞化学分析表明:在平滑肌细胞层有α-肌动蛋白阳性表达以及在移行上皮细胞层有角蛋白-7与AE1/AE3阳性表达，与此同时，移植物针对S-100染色阳性，表明再造的膀胱器官内有神经组织长入。上述结果均表明，组织工程化膀胱具有良好的膀胱修复能力和潜在的临床应用前景。
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2.4 尿道 尿道重建或修补，最初采用管型支架，种上膀胱粘膜及平滑肌细胞，进行动物实验获得成功 [5] 。但现今多以BAMG、SIS或其他生物支架不带细胞，主要依靠宿主细胞向支架上长入 [11，13，18，19] 。术后尿道造影未见狭窄，尿动力学检查亦正常 [13，19] 。目前已有用同种异体BAMG进行尿道修复的报告，术后随访3年效果良好 [13，18] 。其问题是:(1)缺损大的移植后是否能有足够的宿主长入支架;(2)具体多大缺损适合应用该方式还不知道;(3)术后仍有尿瘘发生 [9，11] ;(4)不带细胞的BAMG尿道重建其收缩可能会产生狭窄 [6] 。优点是:减少供体损伤尤其适合多次手术，可用于组织短缺的病人;减少手术和住院时间，手术操作简单损伤小 [13，18] 。本研究小组应用组织工程技术，将人工皮肤制成似尿道的管状物，移入动物体内继续培养，已获得初步成功。
参考文献
1 Melmon KL，Rosen SW.Am J Med，1964;36:595-617.
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2 Pollok JM，Valant JP.Semin Pediatr Surg，1996，5(3):191-196.
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5 Atala A，Freeman MR，Vacanti PJ，et al.J Urol，1993，vol150:608-612.
6 Atala A.Future perspectives in reconstructive surgery using tissue engiˉneering.Urologic clinics of north America，1999，26:157-165.
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7 Reddy PP，Barrieras PJ，Wilson G，et al.J Urol，2000，vol164:936-941.
8 Amiel GE，Yoo JJ.World J Urol，2000，18:71-79.
9 Byung soo kim，Carlos E.Baze，Anthony Atala.J urol，2000，18:2-9.
10 Karl Dietrich sievert，Emil A Tanagho.World J Urol，2000，18:19-25.
11 Fang Chen，James，Yoo J，et al.Urology，1999，54(3):407-410.
12 James J Yoo，Jun Meng，Frank Oberpeming，et al.Urology，1998，51(2):221-225.
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13 Fang Chen，Yoo JJ，Atala A.World J Urol，2000，18:67-70.
14 Huavid Humes.Kidney Int，1995，48:26-32.
15 Woods JD，Dvaid Humes.Kindey Seminars in Nephrology，1997，vol17(4):381-386.
16 Glavac D，Neumann HPH，Wittke C，et al.Hum Genet，1996，98:271-280.
17 Yoshida M，Ashida SH，Kondo K，et al.Jpn J Cancer Res，2000，91:204 -212.
18 Atala A，Luis Guzman，Alan B，et al.J Urol，1999，vol162:1148-1151.
19 Sievert KD，Bakircioclu ME，Lora Numes，et al.J Urol，2000，vol163:1958-1965.
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