石蜡切片厚度对流式细胞仪分析细胞周期的影响
【摘要】 目的 探讨石蜡组织制备单细胞悬液过程中，细胞碎片产生的原因，及其对流式细胞仪检测结果的影响。方法 以小型猪的肠系膜淋巴结为实验对象，将淋巴结分别制成新鲜组织单细胞悬液和石蜡组织块;石蜡组织块切割成不同厚度的薄片，再制成单细胞悬液;流式细胞仪分别检测其DNA含量;采用MultiCycle for Windows分析软件分析它们之间的差异。结果 新鲜组织的G 0 /G 1 期、S期、G 2 /M期细胞所占比例、G 0 /G 1 峰的CV值及Debris值与石蜡组织之间存在差异;而不同厚度石蜡切片组织间制备的样本所测结果亦不相同。结论 不同厚度石蜡切片组织制备的细胞悬液，对流式细胞仪检测细胞周期分析的结果有影响;以采用60μm厚的切片组织制备细胞悬液为最佳。
关键词 流式细胞仪 DNA 石蜡切片
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)24-2260-03
, 百拇医药
在肿瘤研究中，应用流式细胞仪技术分析肿瘤细胞的DNA含量及各周期细胞群体数目，已成为肿瘤临床诊断、疗效评价及预后推测的重要参考依据 [1，2] 。DNA双螺旋结构碱基对与某些核酸荧光染料有良好的亲和力，在激发光的激发下，产生特定的荧光，运用流式细胞仪检测并分析这些荧光强度，从而了解细胞群体中各周期的分布状况，即G 0 /G 1 期、S期、G 2 /M期细胞所占的百分比。检测细胞周期状态的标本，可以是培养细胞、实体组织细胞及体液中收集的细胞;亦可以是新鲜组织，冰冻组织及石蜡包埋组织。尤其是石蜡包埋组织，已成为利用流式细胞仪进行回顾性与追踪性研究的材料。然而在利用石蜡包埋组织进行细胞周期分析时，其结果与新鲜组织比较，主要受到细胞碎片(Deˉbris)的影响 [3，4] 。Rabinovich认为这可能是石蜡包埋组织在制备单细胞悬液时，切片切面的部分细胞被切割，经消化酶消化后，被切割的细胞将变成细胞碎片。为探讨石蜡包埋组织制备单细胞悬液过程对流式细胞仪检测结果的影响，采用不同厚度切片组织与新鲜组织进行对比研究。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器 肠系膜淋巴结取材于5只小型猪，将同一淋巴结切割成大、小2块。大块组织经梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋;小块组织立即制备细胞悬液。碘化丙啶(PI)、RNAse、磷酸盐缓冲液、胃蛋白酶、Triton X-100、酒精、盐酸(1mol/L)、切片机(德国产)、恒温水箱、电冰箱、振荡器、离心机、酸度计、分析天平、过滤网、流式细胞仪(美国产Altra Hypersort System)。
1.2 制备细胞数为1×10 6 的单细胞悬液
1.2.1 石蜡包埋组织的单细胞悬液制备 石蜡包埋组织，用切片机进行连续切片，其切片厚度分别为80μm、60μm、40μm、20μm，将组织切片、制备1×10 6 个单细胞悬液。其步骤如下:将切片分别置入4只试管，加入8ml二甲苯室温脱蜡，24h、5h，弃二甲苯;依次加入100%、95%、70%、50%的梯度酒精5ml洗去二甲苯，每步间隔10min，弃酒精;加入蒸馏水5ml，洗涤10min;弃蒸馏水，加入2ml0.5%的胃蛋白酶(pH1.5～2.0)消化液，置37℃恒温水箱中轻轻震荡，水浴消化5～10min;消化完毕，加入生理盐水终止消化，以300目尼龙网过滤、1500rpm离心，5min;生理盐水漂洗，500rpm，10min离心2次。对未消化完全的组织块进行二次消化。
, 百拇医药
1.2.2 新鲜淋巴组织单细胞悬液的制备 2～4mm 3 组织，加入2ml0.5%的胃蛋白酶(pH1.5～2.0)消化液。其余步骤同上。
1.3 染色
1.3.1 染液配制 PI0.2mg、枸橼酸钠100mg、NaCl156mg，Triton X-1001.0%，RNAse1μg/ml，蒸馏水100ml，配制成20μg/mlPI的去污染液。
1.3.2 细胞染色 用PBS将细胞悬浮浓度调至1×10 6 个/ml，取细胞悬液2ml，1500rpm离心，弃上清液，混匀，加入浓度为20μg/mlPI去污染液2.0ml，轻轻摇动，避光20min，上机。
1.4 仪器调试与参数的设定 (1)检测标准荧光微球的CV值，调试仪器，CV值应≤2%。(2)采用线性放大，以标准荧光微球检查放大器的线性度。(3)直方图标记荧光道数的值为512。G 0 /G 1 峰荧光道数为100以上，通过调节PMT(光电倍增管)的电压值，获得正常二倍体细胞的G 1 峰的理想位置。(4)阈值设置。
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1.5 分析软件 采用MultiCycle for Windows分析软件分析，分析模型(见图1)。使用SPSS11.0统计软件进行统计分析。
2 结果
新鲜组织制备的细胞悬液样本，位于G 0 /G 1 峰左侧的细胞碎片峰小(见图2～6)，而由石蜡包埋组织制备的细胞悬液样本，在G 0 /G 1 峰左侧可见到有不同程度的细胞碎片峰;其细胞碎片峰的变化与切片厚度有关，随着切片的厚度变薄，细胞碎片增加，影响实验结果(见表1，2)。新鲜组织制备的细胞悬液与石蜡切片组织制备的细胞悬液之间存在差异(见表1)。新鲜组织制备的细胞悬液与80μm、60μm的石蜡切片组织制成细胞悬液之间的差异无显著性(P>0.05);与40μm、20μm的石蜡切片组织制备细胞悬液之间的差异有显著性(P<0.05);而同一石蜡组织块，80μm、60μm与40μm、20μm组织切片制备的细胞悬液之间的差异有显著性(P<0.05);80μm与60μm的切片组织制备样本之间的质量评价指数差异无显著性(P>0.05)。
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表1 新鲜组织及各种厚度的石蜡切片样本对细胞周期状态的影响各期细胞
注: ˇ P<0.05(与新鲜组织制备的样本比较)， # P<0.05(与80μm石蜡组织切片制备的样本比较)， & P<0.05(与60μm石蜡组织切片制备的样本比较)分析软件分析显示，新鲜组织制备的样本与80μm、60μm的石蜡切片组织制备样本之间的差异无显著性(P>0.05);与40μm、20μm的石蜡切片组织制备的样本之间的差异有显著性(P<0.05)。同一石蜡组织块，80μm、60μm与 40μm、20μm的切片组织制备细胞悬液样本间比较，其质量评价指数之间的差异有显著性(P<0.05);80μm与60μm的切片组织制备细胞悬液样本之间的质量评价指数差异无显著性(P>0.05，见表2)。
表2 新鲜组织及各种厚度的石蜡切片样本对质量评价指标的影响
注: ˇ P<0.05(与新鲜组织制备的样本比较)， # P<0.05(与80μm石蜡组织切片制备的样本比较)， & P<0.05(与60μm石蜡组织切片制备的样本比较)
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3 讨论
流式细胞仪分析细胞周期，是通过检测嵌入DNA双螺旋结构碱基对的核酸荧光染料被激发后的荧光强度得以实现。在同一组织块内，其细胞周期分布应基本相同，G 0 /G 1 峰的CV值也应十分接近的。但本实验结果显示了它们之间存在差异，分析原因:可能是石蜡包埋的组织在制备单细胞悬液时，切片切面的部分细胞被切割，产生细胞碎片，其DNA含量少于未被切割细胞的DNA含量。在正常的组织 中，绝大多数细胞处于G 0 /G 1 期，因此，被切割的细胞绝大多数是G 0 /G 1 期细胞。被切割细胞所产生的细胞碎片与核酸染料结合量少于未被切割细胞的G 0 /G 1 期细胞，故产生的荧光强度较未被切割细胞弱，在DNA含量分析图中，被切割细胞的荧光道数值应小于未被切割细胞的荧光道数值。在石蜡切片组织制备单细胞悬液的细胞周期分析直方图(图3、4、5、6)中，G 0 /G 1 峰的左侧出现了明显细胞碎片峰。细胞碎片峰的变化规律是随着切片的厚度的变薄而随之增高。 新鲜组织制备的细胞悬液与石蜡切片组织制备的细胞悬液比较分析结果显示，新鲜组织G 0 /G 1 期细胞数目多于石蜡切片组织，并且厚切片的G 0 /G 1 期细胞数目较薄切片的多;而新鲜组织S期、G 2 /M期细胞数目较石蜡切片组织少，厚切片的较薄切片的少;新鲜组织获得的质量评价指标较石蜡组织切片高，厚组织切片获得的质量评价指标较薄组织切片高。导致这种结果的原因:并非是组织细胞本身固有的差别，而是石蜡组织在制备单细胞悬液过程中，被切割的细胞(细胞碎片)干扰所致。被切割的细胞越多，对结果干扰越强，与组织细胞的真实值相差愈远。
, http://www.100md.com
新鲜组织与80μm及60μm的石蜡切片组织制备的样本之间存在的差异小，理论上讲，以石蜡组织制备单细胞悬液，可采用80μm或60μm两种切片厚度。但在制备细胞悬 液过程中，80μm较60μm切片组织的消化时间延长，增加消化难度，可能也增加了细胞碎片。因此，采用石蜡组织制备细胞悬液，以采用60μm厚的切片组织为好。
参考文献
1 陶德定，冷彦，覃吉超，等.新鲜肿瘤标本固定细胞的DNA含量的分析比较.癌症，2001，20(5):502-5041.
2 崔巍，牛福玲，何丽云，等.流式细胞术检测细胞凋亡的分析软件比较.北京中医药大学学报，2001，24(6):45-47.
3 Rabinovich P.S.Multicycle DNA content and cell cycle analysis softˉware，University of Washington，1998，2:18-2:52.
4 金国秀，方国安，刘波，等.流式细胞术DNA分析影响因素探讨.上海医学检验杂志，2000，15(3):151.
基金项目:湖南省自然基金资助项目(批号03Jjy3029)
作者单位:421001衡阳南华大学科研试验中心
(编辑青 山), http://www.100md.com(唐国华)
关键词 流式细胞仪 DNA 石蜡切片
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)24-2260-03
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在肿瘤研究中，应用流式细胞仪技术分析肿瘤细胞的DNA含量及各周期细胞群体数目，已成为肿瘤临床诊断、疗效评价及预后推测的重要参考依据 [1，2] 。DNA双螺旋结构碱基对与某些核酸荧光染料有良好的亲和力，在激发光的激发下，产生特定的荧光，运用流式细胞仪检测并分析这些荧光强度，从而了解细胞群体中各周期的分布状况，即G 0 /G 1 期、S期、G 2 /M期细胞所占的百分比。检测细胞周期状态的标本，可以是培养细胞、实体组织细胞及体液中收集的细胞;亦可以是新鲜组织，冰冻组织及石蜡包埋组织。尤其是石蜡包埋组织，已成为利用流式细胞仪进行回顾性与追踪性研究的材料。然而在利用石蜡包埋组织进行细胞周期分析时，其结果与新鲜组织比较，主要受到细胞碎片(Deˉbris)的影响 [3，4] 。Rabinovich认为这可能是石蜡包埋组织在制备单细胞悬液时，切片切面的部分细胞被切割，经消化酶消化后，被切割的细胞将变成细胞碎片。为探讨石蜡包埋组织制备单细胞悬液过程对流式细胞仪检测结果的影响，采用不同厚度切片组织与新鲜组织进行对比研究。
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1 材料与方法
1.1 材料、试剂与仪器 肠系膜淋巴结取材于5只小型猪，将同一淋巴结切割成大、小2块。大块组织经梯度酒精脱水、二甲苯透明、石蜡包埋;小块组织立即制备细胞悬液。碘化丙啶(PI)、RNAse、磷酸盐缓冲液、胃蛋白酶、Triton X-100、酒精、盐酸(1mol/L)、切片机(德国产)、恒温水箱、电冰箱、振荡器、离心机、酸度计、分析天平、过滤网、流式细胞仪(美国产Altra Hypersort System)。
1.2 制备细胞数为1×10 6 的单细胞悬液
1.2.1 石蜡包埋组织的单细胞悬液制备 石蜡包埋组织，用切片机进行连续切片，其切片厚度分别为80μm、60μm、40μm、20μm，将组织切片、制备1×10 6 个单细胞悬液。其步骤如下:将切片分别置入4只试管，加入8ml二甲苯室温脱蜡，24h、5h，弃二甲苯;依次加入100%、95%、70%、50%的梯度酒精5ml洗去二甲苯，每步间隔10min，弃酒精;加入蒸馏水5ml，洗涤10min;弃蒸馏水，加入2ml0.5%的胃蛋白酶(pH1.5～2.0)消化液，置37℃恒温水箱中轻轻震荡，水浴消化5～10min;消化完毕，加入生理盐水终止消化，以300目尼龙网过滤、1500rpm离心，5min;生理盐水漂洗，500rpm，10min离心2次。对未消化完全的组织块进行二次消化。
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1.2.2 新鲜淋巴组织单细胞悬液的制备 2～4mm 3 组织，加入2ml0.5%的胃蛋白酶(pH1.5～2.0)消化液。其余步骤同上。
1.3 染色
1.3.1 染液配制 PI0.2mg、枸橼酸钠100mg、NaCl156mg，Triton X-1001.0%，RNAse1μg/ml，蒸馏水100ml，配制成20μg/mlPI的去污染液。
1.3.2 细胞染色 用PBS将细胞悬浮浓度调至1×10 6 个/ml，取细胞悬液2ml，1500rpm离心，弃上清液，混匀，加入浓度为20μg/mlPI去污染液2.0ml，轻轻摇动，避光20min，上机。
1.4 仪器调试与参数的设定 (1)检测标准荧光微球的CV值，调试仪器，CV值应≤2%。(2)采用线性放大，以标准荧光微球检查放大器的线性度。(3)直方图标记荧光道数的值为512。G 0 /G 1 峰荧光道数为100以上，通过调节PMT(光电倍增管)的电压值，获得正常二倍体细胞的G 1 峰的理想位置。(4)阈值设置。
, 百拇医药
1.5 分析软件 采用MultiCycle for Windows分析软件分析，分析模型(见图1)。使用SPSS11.0统计软件进行统计分析。
2 结果
新鲜组织制备的细胞悬液样本，位于G 0 /G 1 峰左侧的细胞碎片峰小(见图2～6)，而由石蜡包埋组织制备的细胞悬液样本，在G 0 /G 1 峰左侧可见到有不同程度的细胞碎片峰;其细胞碎片峰的变化与切片厚度有关，随着切片的厚度变薄，细胞碎片增加，影响实验结果(见表1，2)。新鲜组织制备的细胞悬液与石蜡切片组织制备的细胞悬液之间存在差异(见表1)。新鲜组织制备的细胞悬液与80μm、60μm的石蜡切片组织制成细胞悬液之间的差异无显著性(P>0.05);与40μm、20μm的石蜡切片组织制备细胞悬液之间的差异有显著性(P<0.05);而同一石蜡组织块，80μm、60μm与40μm、20μm组织切片制备的细胞悬液之间的差异有显著性(P<0.05);80μm与60μm的切片组织制备样本之间的质量评价指数差异无显著性(P>0.05)。
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表1 新鲜组织及各种厚度的石蜡切片样本对细胞周期状态的影响各期细胞
注: ˇ P<0.05(与新鲜组织制备的样本比较)， # P<0.05(与80μm石蜡组织切片制备的样本比较)， & P<0.05(与60μm石蜡组织切片制备的样本比较)分析软件分析显示，新鲜组织制备的样本与80μm、60μm的石蜡切片组织制备样本之间的差异无显著性(P>0.05);与40μm、20μm的石蜡切片组织制备的样本之间的差异有显著性(P<0.05)。同一石蜡组织块，80μm、60μm与 40μm、20μm的切片组织制备细胞悬液样本间比较，其质量评价指数之间的差异有显著性(P<0.05);80μm与60μm的切片组织制备细胞悬液样本之间的质量评价指数差异无显著性(P>0.05，见表2)。
表2 新鲜组织及各种厚度的石蜡切片样本对质量评价指标的影响
注: ˇ P<0.05(与新鲜组织制备的样本比较)， # P<0.05(与80μm石蜡组织切片制备的样本比较)， & P<0.05(与60μm石蜡组织切片制备的样本比较)
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3 讨论
流式细胞仪分析细胞周期，是通过检测嵌入DNA双螺旋结构碱基对的核酸荧光染料被激发后的荧光强度得以实现。在同一组织块内，其细胞周期分布应基本相同，G 0 /G 1 峰的CV值也应十分接近的。但本实验结果显示了它们之间存在差异，分析原因:可能是石蜡包埋的组织在制备单细胞悬液时，切片切面的部分细胞被切割，产生细胞碎片，其DNA含量少于未被切割细胞的DNA含量。在正常的组织 中，绝大多数细胞处于G 0 /G 1 期，因此，被切割的细胞绝大多数是G 0 /G 1 期细胞。被切割细胞所产生的细胞碎片与核酸染料结合量少于未被切割细胞的G 0 /G 1 期细胞，故产生的荧光强度较未被切割细胞弱，在DNA含量分析图中，被切割细胞的荧光道数值应小于未被切割细胞的荧光道数值。在石蜡切片组织制备单细胞悬液的细胞周期分析直方图(图3、4、5、6)中，G 0 /G 1 峰的左侧出现了明显细胞碎片峰。细胞碎片峰的变化规律是随着切片的厚度的变薄而随之增高。 新鲜组织制备的细胞悬液与石蜡切片组织制备的细胞悬液比较分析结果显示，新鲜组织G 0 /G 1 期细胞数目多于石蜡切片组织，并且厚切片的G 0 /G 1 期细胞数目较薄切片的多;而新鲜组织S期、G 2 /M期细胞数目较石蜡切片组织少，厚切片的较薄切片的少;新鲜组织获得的质量评价指标较石蜡组织切片高，厚组织切片获得的质量评价指标较薄组织切片高。导致这种结果的原因:并非是组织细胞本身固有的差别，而是石蜡组织在制备单细胞悬液过程中，被切割的细胞(细胞碎片)干扰所致。被切割的细胞越多，对结果干扰越强，与组织细胞的真实值相差愈远。
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新鲜组织与80μm及60μm的石蜡切片组织制备的样本之间存在的差异小，理论上讲，以石蜡组织制备单细胞悬液，可采用80μm或60μm两种切片厚度。但在制备细胞悬 液过程中，80μm较60μm切片组织的消化时间延长，增加消化难度，可能也增加了细胞碎片。因此，采用石蜡组织制备细胞悬液，以采用60μm厚的切片组织为好。
参考文献
1 陶德定，冷彦，覃吉超，等.新鲜肿瘤标本固定细胞的DNA含量的分析比较.癌症，2001，20(5):502-5041.
2 崔巍，牛福玲，何丽云，等.流式细胞术检测细胞凋亡的分析软件比较.北京中医药大学学报，2001，24(6):45-47.
3 Rabinovich P.S.Multicycle DNA content and cell cycle analysis softˉware，University of Washington，1998，2:18-2:52.
4 金国秀，方国安，刘波，等.流式细胞术DNA分析影响因素探讨.上海医学检验杂志，2000，15(3):151.
基金项目:湖南省自然基金资助项目(批号03Jjy3029)
作者单位:421001衡阳南华大学科研试验中心
(编辑青 山), http://www.100md.com(唐国华)