复方酮康唑擦剂抗真菌活性研究
【摘要】 目的 评价复方酮康唑擦剂体外抗皮肤丝状真菌活性。方法 用微量液基稀释法测定复方酮康唑擦剂对4株致病皮肤丝状真菌(串珠镰刀菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌及黑曲霉菌)的最低抑菌浓度(MIC)。结果 复方酮康唑擦剂及酮康唑对串珠镰刀菌的MIC分别为0.13mg/L及2mg/L，对烟曲霉菌的MIC分别为0.25mg/L及0.5mg/L，对黄曲霉菌的MIC分别为2mg/L及16mg/L，对黑曲霉菌的MIC均为0.25mg/L。上述结果显示复方酮康唑擦剂对串珠镰刀菌、烟曲霉菌和黑曲霉菌的作用较强，对黄曲霉菌的作用较弱。复方酮康唑擦剂对串珠镰刀菌和黄曲霉菌的抗菌活性是酮康唑的8倍，对烟曲霉菌的抗菌活性是酮康唑的2倍，对黑曲霉菌的作用强度与酮康唑的相似。结论 复方酮康唑擦剂对串珠镰刀菌、黄曲霉菌和烟曲霉菌的体外抗菌活性比酮康唑的明显增强，说明酮康唑和氮酮对这些致病菌有协同抗真菌作用。提示抗真菌皮肤制剂的配方中加入氮酮除可增加抗真菌药的皮肤透性外，适当浓度的氮酮与抗真菌药还有协同抗真菌作用。
关键词 酮康唑 氮酮 丝状真菌 药敏试验
, http://www.100md.com
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)08-0692-02
Antifungal activity of ketaconazole tincture against fungi in vitro
Wang Tianxiang，Xu Yan，Wang Xiaochong，et al.
Department of Dermatology Geological Hospital of Henan Province，Zhengzhou450006.
【Abstract】 Objective To evaluate antifungal activities of ketaconazole tincture against pathogenic filamentous fungi in vitro.Methods The minimum inhibitory concentration(MIC)of ketaconazole tincture against4strains of skin pathogenic filamentous fungi(Fusarium moniliforme，Aspergillus fumigatus.Aspergillus flavus，and Aspegillus niger)were determined by modified NCCLS M38-P broth microdilution method.Ketaconazole served as control.Reˉsults MICs of ketaconazole tincture and ketaconazole were0.13mg/L and2mg/L against Fusarium monilifore，0.25mg/L and0.25mg/L against Aspergillus fumigatus，2mg/L and16mg/L against Aspergillas flavns，0.25mg/L and0.25mg/L against Aspergillusniger，respectively.The ketaconazole tincture proved to be highly active against Fusarium monilifore，Aspergillus fumigatus and Aspergillus niger，and also exerted good activities against Aspergillus flavu.The antifungal activities of ketaconazole tincture against Fusarium monilifore and Aspergillus flavus were8times higher than that of ketaconazole.Conclusion The antifungal activities of ketaconazole tincture against pathogenic filamentous fungi were much higher than that of ketaconazole.This means that ketacoazole and azone have cooperative antifungal activities.It suggests that azone is incorporated into the skin formulations of antifungal drugs，It may have two funcˉtions.One is promoting the skin absorption of antifungal drugs，anotheris cooperative antifungal activities with antifunˉgal drugs.The two functions of azone may increase therapeutic action of antifungal agents.
, 百拇医药
Key words ketaconazole azone filamentous fungi drug susceptibility test
酮康唑属三唑类广谱抗真菌药，体外实验证明该药对皮肤真菌有较强的抑菌作用 [1，2] 。临床口服给药用于治疗皮肤真菌病有较好的疗效 [3] ，但因可引起胃肠道反应及致死性肝损伤 [4，5] ，限制了其在临床上的应用。自1997年起，我们开发出2%复方酮康唑擦剂，在配方中加入氮酮增加酮康唑的皮肤透入，用于治疗皮肤浅部真菌病，获得满意疗效。氮酮除增加酮康唑的皮肤透入外，其与酮康唑有无协同抗真菌活性，目前尚未见报道。本研究通过药敏实验评价复方酮康唑擦剂的体外抗真菌活性。
1 材料和方法
1.1 菌株和菌液制备 串珠镰刀菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌各1株，均由中国微生物保藏中心提供。将待测菌株先经马铃薯琼脂培养基培养，实验时用无菌生理盐水洗下培养物，经滤纸过滤后成分生孢子混悬液，计数并用RPMI1640培养液稀释为10 5 分生孢子(CUF)/ml，4℃冰箱贮存备用，实验时按1:5稀释为2×10 4 CUF/ml菌液。
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1.2 药物及药液稀释 酮康唑(南京第二制药厂)，新氮酮(台湾独资新乡高金化学有限公司)，2%复方酮康唑擦剂(酮康唑20g，氮酮20ml，75%乙醇至1000ml)。2%复方酮康唑擦剂及酮康唑均用二甲基亚砜(DMSO)溶解，-28℃保存备用。
1.3 培养基 马铃薯琼脂培养基:RPMI1640培养基(用0.165MMOPS缓冲剂调整pH至7.0)。
1.4 微量液基稀释法测定最低抑菌浓度(MIC) 参照美国临床实验室标准委员会(NCCLS)最新方案1998年版NCLLS标准(M-38P) [6] ，进行丝状真菌药敏试验。2%复方酮康唑擦剂及酮康唑组:将两组药物均先配制成含酮康唑1600mg/L贮存液，实验时按M-38P方案稀释药物。将各浓度药液加入微孔培养板，每孔100μl，再向各孔加入100μl菌液(最终菌浓度10 4 CUF/ml)，递减系列药物浓度为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mg/L。另设阳性对照组(生长对照，无药含菌)和阴性对照组(无药无菌)，每组平行3份。35℃培养24h。串珠镰刀菌35℃培养48h。
, 百拇医药
结果判断:将微孔培养板置镜面上用肉眼观察，按M-38P方案的标准，以0～4分记录。0分:表示无真菌生长，培养液清晰;1分:表示真菌略有生长(约25%左右)，培养液微混;2分:表示约有50%左右真菌生长，培养液混浊明显;3分:表示培养液混浊度略低于生长对照孔;4分:表示培养液混浊度与生长对照孔相同。酮康唑的MIC终点判定界限以1分标准判断。
2 结果
复方酮康唑擦剂及酮康唑对串珠镰刀菌的MIC详见表1。结果显示复方酮康唑擦剂对串珠镰刀菌、烟曲霉菌和黑曲霉菌的作用较强，对黄曲霉菌的作用较弱。酮康唑液对黑曲霉菌的作用较强，对烟曲霉菌、串珠镰刀菌的作用依次递减，对黄曲霉菌的作用最弱。复方酮康唑擦剂对串珠镰刀菌和黄曲霉菌的抗菌活性是酮康唑的8倍，对烟曲霉菌的抗菌活性是酮康唑的2倍，对黑曲霉菌的作用强度与酮康唑的相似。
表1 酮康唑擦剂对4株丝状真菌的MIC测定结果 (略 )
, 百拇医药
3 讨论
酮康唑属三唑类广谱抗真菌药，该类药的作用机制是抑制真菌细胞膜上麦角甾醇的合成，作用位点是抑制羊毛甾醇P45014-α-去甲基酶的活性。麦角甾醇为真菌细胞膜上重要组成物质，而人类细胞膜上的甾醇主要为胆甾醇。因此，该类化合物抗真菌具有特异性 [7] 。但普通配方中酮康唑的皮肤透性较差，临床疗效不佳。我们在配方中加入高效皮肤促渗剂氮酮后，临床疗效明显增加，说明氮酮可明显增加酮康唑的皮肤透性。已有实验证明，含1%氮酮制剂的透皮增强作用比含50%DMF或DMSO等的大13倍 [8] 。 但氮酮与酮康唑有无抗真菌协同作用尚未见报道。本研究用微量液基稀释法测定复方酮康唑擦剂对4株丝状真菌的最低抑菌浓度。结果显示，复方酮康唑擦剂对串珠镰刀菌、黄曲霉菌的抗真菌活性是酮康唑的8倍，对烟曲霉菌的抗菌活性是酮康唑的2倍;表明氮酮与酮康唑有抗真菌协同作用。提示将氮酮加入其他抗真菌皮肤制剂中，氮酮可能具有增加抗真菌药皮肤透性和协同抑菌的双重作用。
, http://www.100md.com
氮酮对真菌的抑菌机制尚不清楚。刘体全等 [9] 对0.5%氮酮进行了抑菌实验研究，结果显示，氮酮对革兰阳性菌及芽孢和厌氧菌的最小抑菌浓度不超过20mg/L。金葡菌经氮酮作用后，其酶活性对照组明显增强，说明菌体内多种酶大量外漏。透射电镜下观察到枯草杆菌经氮酮作用后，菌体表面出现许多小孔，不规则断裂和菌内容性膨出等现象。上述结果证实氮酮具有极强的抗菌作用是因为破坏了细菌壁结构，从而导致了菌内容物的外流，抑制了细菌的生长繁殖。氮酮对真菌的抑菌机制是否与对细菌的相同，尚待进一步研究。
参考文献
1 Fernandez-Torres B，Carrillo AJ，Martin E，et al.In vitro activities of10antifungal drugs against508dermatophyte strains.Antimicrob Agents Chemother，2001，45(9):2524.
, 百拇医药
2 Espinel-Ingroff A，Dawson K，Pfaller M，et al.Comparative and collabˉorative evaluation of standardization of antifugal susceptibility testing for filamentous fungi.Antimicrob Agents Chemother，1995，39(2):314.
3 虞瑞光.酮康唑的药理与临床应用.国外医学·皮肤病学分册，1984，10(1):1.
4 张炜.对酮康唑的再评价.国外医学·皮肤病学分册，1986，12(4):254.
5 陈新谦，金有豫.新编药物学，第14版.北京:人民卫生出版社，1998，109.
6 National Committee for Clinical Laboratory Standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of conidiumforming filˉamentousfungi:Proposed standard NCCLS document M38-P National Committee for Clinical Laboratory Standards.Wayne，1998，1-21.
7 王海燕，荒井雅吉，供田洋，等.微生物来源的Azole类抗真菌活性增强剂-FKI-0076AB和C的研究.中国抗生素杂志，2001，26(2):89.
8 黄恺.新型高效皮肤渗透促进剂-氮酮.国外医学·皮肤病学分册，1987，13(1):4.
9 刘体全，谭巨莲，王利青，等.氮酮抑菌实验研究.药学杂志，1999，34(7):465.
(编辑 亦平), http://www.100md.com(王天祥)
关键词 酮康唑 氮酮 丝状真菌 药敏试验
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)08-0692-02
Antifungal activity of ketaconazole tincture against fungi in vitro
Wang Tianxiang，Xu Yan，Wang Xiaochong，et al.
Department of Dermatology Geological Hospital of Henan Province，Zhengzhou450006.
【Abstract】 Objective To evaluate antifungal activities of ketaconazole tincture against pathogenic filamentous fungi in vitro.Methods The minimum inhibitory concentration(MIC)of ketaconazole tincture against4strains of skin pathogenic filamentous fungi(Fusarium moniliforme，Aspergillus fumigatus.Aspergillus flavus，and Aspegillus niger)were determined by modified NCCLS M38-P broth microdilution method.Ketaconazole served as control.Reˉsults MICs of ketaconazole tincture and ketaconazole were0.13mg/L and2mg/L against Fusarium monilifore，0.25mg/L and0.25mg/L against Aspergillus fumigatus，2mg/L and16mg/L against Aspergillas flavns，0.25mg/L and0.25mg/L against Aspergillusniger，respectively.The ketaconazole tincture proved to be highly active against Fusarium monilifore，Aspergillus fumigatus and Aspergillus niger，and also exerted good activities against Aspergillus flavu.The antifungal activities of ketaconazole tincture against Fusarium monilifore and Aspergillus flavus were8times higher than that of ketaconazole.Conclusion The antifungal activities of ketaconazole tincture against pathogenic filamentous fungi were much higher than that of ketaconazole.This means that ketacoazole and azone have cooperative antifungal activities.It suggests that azone is incorporated into the skin formulations of antifungal drugs，It may have two funcˉtions.One is promoting the skin absorption of antifungal drugs，anotheris cooperative antifungal activities with antifunˉgal drugs.The two functions of azone may increase therapeutic action of antifungal agents.
, 百拇医药
Key words ketaconazole azone filamentous fungi drug susceptibility test
酮康唑属三唑类广谱抗真菌药，体外实验证明该药对皮肤真菌有较强的抑菌作用 [1，2] 。临床口服给药用于治疗皮肤真菌病有较好的疗效 [3] ，但因可引起胃肠道反应及致死性肝损伤 [4，5] ，限制了其在临床上的应用。自1997年起，我们开发出2%复方酮康唑擦剂，在配方中加入氮酮增加酮康唑的皮肤透入，用于治疗皮肤浅部真菌病，获得满意疗效。氮酮除增加酮康唑的皮肤透入外，其与酮康唑有无协同抗真菌活性，目前尚未见报道。本研究通过药敏实验评价复方酮康唑擦剂的体外抗真菌活性。
1 材料和方法
1.1 菌株和菌液制备 串珠镰刀菌、烟曲霉菌、黄曲霉菌、黑曲霉菌各1株，均由中国微生物保藏中心提供。将待测菌株先经马铃薯琼脂培养基培养，实验时用无菌生理盐水洗下培养物，经滤纸过滤后成分生孢子混悬液，计数并用RPMI1640培养液稀释为10 5 分生孢子(CUF)/ml，4℃冰箱贮存备用，实验时按1:5稀释为2×10 4 CUF/ml菌液。
, http://www.100md.com
1.2 药物及药液稀释 酮康唑(南京第二制药厂)，新氮酮(台湾独资新乡高金化学有限公司)，2%复方酮康唑擦剂(酮康唑20g，氮酮20ml，75%乙醇至1000ml)。2%复方酮康唑擦剂及酮康唑均用二甲基亚砜(DMSO)溶解，-28℃保存备用。
1.3 培养基 马铃薯琼脂培养基:RPMI1640培养基(用0.165MMOPS缓冲剂调整pH至7.0)。
1.4 微量液基稀释法测定最低抑菌浓度(MIC) 参照美国临床实验室标准委员会(NCCLS)最新方案1998年版NCLLS标准(M-38P) [6] ，进行丝状真菌药敏试验。2%复方酮康唑擦剂及酮康唑组:将两组药物均先配制成含酮康唑1600mg/L贮存液，实验时按M-38P方案稀释药物。将各浓度药液加入微孔培养板，每孔100μl，再向各孔加入100μl菌液(最终菌浓度10 4 CUF/ml)，递减系列药物浓度为16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125mg/L。另设阳性对照组(生长对照，无药含菌)和阴性对照组(无药无菌)，每组平行3份。35℃培养24h。串珠镰刀菌35℃培养48h。
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结果判断:将微孔培养板置镜面上用肉眼观察，按M-38P方案的标准，以0～4分记录。0分:表示无真菌生长，培养液清晰;1分:表示真菌略有生长(约25%左右)，培养液微混;2分:表示约有50%左右真菌生长，培养液混浊明显;3分:表示培养液混浊度略低于生长对照孔;4分:表示培养液混浊度与生长对照孔相同。酮康唑的MIC终点判定界限以1分标准判断。
2 结果
复方酮康唑擦剂及酮康唑对串珠镰刀菌的MIC详见表1。结果显示复方酮康唑擦剂对串珠镰刀菌、烟曲霉菌和黑曲霉菌的作用较强，对黄曲霉菌的作用较弱。酮康唑液对黑曲霉菌的作用较强，对烟曲霉菌、串珠镰刀菌的作用依次递减，对黄曲霉菌的作用最弱。复方酮康唑擦剂对串珠镰刀菌和黄曲霉菌的抗菌活性是酮康唑的8倍，对烟曲霉菌的抗菌活性是酮康唑的2倍，对黑曲霉菌的作用强度与酮康唑的相似。
表1 酮康唑擦剂对4株丝状真菌的MIC测定结果 (略 )
, 百拇医药
3 讨论
酮康唑属三唑类广谱抗真菌药，该类药的作用机制是抑制真菌细胞膜上麦角甾醇的合成，作用位点是抑制羊毛甾醇P45014-α-去甲基酶的活性。麦角甾醇为真菌细胞膜上重要组成物质，而人类细胞膜上的甾醇主要为胆甾醇。因此，该类化合物抗真菌具有特异性 [7] 。但普通配方中酮康唑的皮肤透性较差，临床疗效不佳。我们在配方中加入高效皮肤促渗剂氮酮后，临床疗效明显增加，说明氮酮可明显增加酮康唑的皮肤透性。已有实验证明，含1%氮酮制剂的透皮增强作用比含50%DMF或DMSO等的大13倍 [8] 。 但氮酮与酮康唑有无抗真菌协同作用尚未见报道。本研究用微量液基稀释法测定复方酮康唑擦剂对4株丝状真菌的最低抑菌浓度。结果显示，复方酮康唑擦剂对串珠镰刀菌、黄曲霉菌的抗真菌活性是酮康唑的8倍，对烟曲霉菌的抗菌活性是酮康唑的2倍;表明氮酮与酮康唑有抗真菌协同作用。提示将氮酮加入其他抗真菌皮肤制剂中，氮酮可能具有增加抗真菌药皮肤透性和协同抑菌的双重作用。
, http://www.100md.com
氮酮对真菌的抑菌机制尚不清楚。刘体全等 [9] 对0.5%氮酮进行了抑菌实验研究，结果显示，氮酮对革兰阳性菌及芽孢和厌氧菌的最小抑菌浓度不超过20mg/L。金葡菌经氮酮作用后，其酶活性对照组明显增强，说明菌体内多种酶大量外漏。透射电镜下观察到枯草杆菌经氮酮作用后，菌体表面出现许多小孔，不规则断裂和菌内容性膨出等现象。上述结果证实氮酮具有极强的抗菌作用是因为破坏了细菌壁结构，从而导致了菌内容物的外流，抑制了细菌的生长繁殖。氮酮对真菌的抑菌机制是否与对细菌的相同，尚待进一步研究。
参考文献
1 Fernandez-Torres B，Carrillo AJ，Martin E，et al.In vitro activities of10antifungal drugs against508dermatophyte strains.Antimicrob Agents Chemother，2001，45(9):2524.
, 百拇医药
2 Espinel-Ingroff A，Dawson K，Pfaller M，et al.Comparative and collabˉorative evaluation of standardization of antifugal susceptibility testing for filamentous fungi.Antimicrob Agents Chemother，1995，39(2):314.
3 虞瑞光.酮康唑的药理与临床应用.国外医学·皮肤病学分册，1984，10(1):1.
4 张炜.对酮康唑的再评价.国外医学·皮肤病学分册，1986，12(4):254.
5 陈新谦，金有豫.新编药物学，第14版.北京:人民卫生出版社，1998，109.
6 National Committee for Clinical Laboratory Standards.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of conidiumforming filˉamentousfungi:Proposed standard NCCLS document M38-P National Committee for Clinical Laboratory Standards.Wayne，1998，1-21.
7 王海燕，荒井雅吉，供田洋，等.微生物来源的Azole类抗真菌活性增强剂-FKI-0076AB和C的研究.中国抗生素杂志，2001，26(2):89.
8 黄恺.新型高效皮肤渗透促进剂-氮酮.国外医学·皮肤病学分册，1987，13(1):4.
9 刘体全，谭巨莲，王利青，等.氮酮抑菌实验研究.药学杂志，1999，34(7):465.
(编辑 亦平), http://www.100md.com(王天祥)