银杏叶对兔视网膜缺血再灌注损伤保护作用的研究
【摘要】 目的 探讨银杏叶对视网膜缺血再灌注损伤保护作用。方法 制作兔视网膜缺血再灌注损伤模型，随机分为4组:假手术组;缺血再灌注组;缺血再灌注+ERG1组[60mg/(kg·d)]，缺血再灌注+EGb2组[120mg/(kg·d)]。记录缺血再灌注前，后30min、1h、2h、4h、1天EGb。缺血再灌注组:缺血再灌注前、后12h1天、3天、1周、2周ERG;缺血再灌注+EGb1组、2组:3天、2周病理检查。结果 缺血再灌注组ERG-a波60min恢复到正常，ERG-b波幅度下降，恢复时间减慢。EGb1组，EGb2组b波幅度下降不明显，恢复时间缩短，1天后ERG基本正常。缺血再灌注组，再灌注解除后12h，视网膜水肿，厚度明显增加，24h恢复至正常，3天、7天、2周后视网膜厚度，细胞密度逐渐降低，2周后缺血再灌注组整个视网膜的厚度比正常组明显减少，2周与1周比较差异无显著性(t=0.628，P>0.05)。结论 银杏叶使视网膜缺血再灌注后ERG的b波得以恢复，病理改变减轻，对视网膜缺血再灌注损伤有明显的保护作用。
关键词 银杏叶 视网膜 缺血再灌注 损伤
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)08-0673-03
Gingko biloba extract study the rabbits retina
ischemia-reperfusion injuryprotect function
Lai Zhanxin，Huang Hong，Yang Wenquan，et al.
Department of Ophthalmology，Qingxi Hospital of Dongguan，Guangdong523660.
【Abstract】 Objective Study the gingko biloba extract to the retina ischemia-reperfusion injury protect the function.Methods Manufacture the rabbit retina ischemia-reperfusion injury the model，and is divided into with the machine four group:control group;ischemia-reperfusion group;Ischemia-reperfusion group EGb[60mg/(kg·d)]，group2EGb[120mg/(kg·d)].Record ischemia-reperfusion front，empress30min，1h，2h，4h，1d ERG.Ischemia-reperfusion group:ischemia-reperfusion，Before12h，after1d，3d，1w，2w;ischemia-reperfusion EGb，group2EGb:3d，2w pathology check.Results Ischemia-reperfusion group ERG-a wave60minutes recover normal，EGb-b wave range descent，instauration time reduce slow.group1EGb，group2ERG-b wave the range descent is unkonwn to show，recover time to shorten，1day ERG is basic normal.Ischemia-reperfusion set the more obvious than control group decrease，2weeks and a week of thickness for，ischemia-reperfusion relief empress12hours，seeing the retina dropsy，thickness obviously increasing，24hours recovernormally，after3days，7days，2weeks seeing the retina thickˉness，cell density gradually lowering，after2week ischemia-reperfusion set whole seeing the retina more have no the obvious difference.(t=0.628，P>0.05).Conclusion The gingko biloba extract makes see the retina the ischemia-reperfusion the b wave of the empress ERG can instauration，pathologies to change to alleviate，aegis saw retina isˉchemia-reperfusion injury had obviously the function.
, 百拇医药
Key words gingko biloba extract retina ischemia-reperfusion injury
银杏叶含有多种药理活性的有效成分，如黄酮类、内酯B、萜类等，其有改善缺血性心肌、脑组织血液供应，清除氧自由基，抗血小板活化因子的药理作用，目前已广泛应用于心脑血管病的治疗。而视网膜缺血再灌注损伤中，银杏叶提取物EGb(estract gingko biloba)的保护作用，国外也有过报道。本文探讨银杏叶对视网膜缺血再灌注损伤保护作用。
1 材料与方法
1.1 药品和仪器 银杏叶由深圳海王医药集团提供(批号19980106)，每片20mg，含银杏叶提取物9.6mg(黄酮20%，萜类6%)，其他分析用试剂均为分析纯。视觉电生理仪为重庆泰克医电仪器有限公司生产。
1.2 实验动物及分组 新西兰大耳白兔24只，体重30±5kg，雌雄兼用(第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供)，随机分为4组:假手术组;缺血再灌注组;缺血再灌注+EGb1组[60mg/(kg·d)]，缺血再灌注+EGb2组[120mg/(kg·d)]。
, 百拇医药
1.3 模型制作 2%戊巴比妥钠25mg/kg静脉麻醉，将连接生理盐水瓶输液管的针头于角膜缘刺入前房，然后升高输液至与动物垂直距离180cm处，此高度可在眼内形成16.64kPa(1kPa=7.5mmHg)的压力，可观察到球结膜苍白，眼底血管断流，维持60min，降低输液瓶高度达动物水平，拔出针头，可见眼球结膜充血，视网膜恢复血供。缺血再灌注+EGb1组，缺血再灌注+EGb2组动物分别于实验前1周及术后给予银杏叶制剂口服60mg/(kg·d)和120mg/(kg·d)。
1.4 标本的取材及切片的制作 缺血再灌注组的兔分别于12h、1天、3天、1周、2周用过量戊巴比妥钠麻醉致死，EGb组分别于缺血再灌注后3天、2周同法处死，摘除眼球，置入0℃生理盐水中，距角膜缘后3mm处做一平行角膜的巩膜切口，沿此切口剪除眼前节及晶体，吸出玻璃体，取颞上部4mm×6mm眼球壁全层组织块固定于10%中性福尔马林液中72h，常规脱水，浸腊，石腊包埋，做4μm厚连续切片。
, 百拇医药 1.5 视网膜电流图(electroretinogram，ERG)记录 用托吡卡胺+新福林散瞳，经过30min暗适应后记录ERG正常值，再行缺血再灌注模型制作。于缺血再灌注后30min、1h、2h、4h、1天记录ERG。动物置于闪烁光源前15cm，频率强度为5Hz，用角膜接触镜电极记录ERG。记录电极放置角膜表面，参考电极放置在舌头，地线与耳相连接，ERG的b波幅度是从a波的低谷至波的峰值，a波幅度从基线0至最低谷值 [1] 。
1.6 病理观察 根据Hughes [2] 缺血再灌注致视网膜损伤 的计数方法，测量视网膜不同层次厚度(μm)和面积细胞密度(50μm宽的细胞核的数目)，计算缺血再灌注引起视网膜细胞丢失水平。
2 结果
2.1 视网膜ERG改变
2.1.1 缺血再灌注组与正常组比较ERG-a波60min恢复到正常，见表1。
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2.1.2 缺血再灌注组 ERG-b波幅度下降，恢复时间减慢。EGb1组，EGb2组b波幅度下降不明显，恢复时间缩短。在1h～1天各时间点上ERG-b波幅度明显高于缺血再灌注组(EGb11h，t=2.832，EGb12h，t=2.306;EGb21h，t=2.577，P<0.05;EGb14h，t=3.307，EGb11d，t=4.778;EGb22h t=5.492，EGb24h t=11.053，EGb21d t=13.113，P<0.01)，见表2。60min后与正常组比较差异无显著性(t=0.956，P>0.05)，1天后ERG基本正常。
表1 缺血再灌注损伤后ERG-a波恢复过程(略)
表2 EGb对ERG-b波幅影响(略)
2.2 病理改变 缺血再灌注组，再灌注解除后12h，视网膜水肿，厚度明显增加，24h恢复至正常，3天、7天、2周后视网膜厚度，细胞密度逐渐降低，2周后缺血再灌注组整个视网膜的厚度比正常组明显减少，视网膜损伤2周与1周比较差异无显著性(t=0.751，P>0.05)。视网膜厚度减少，主要是内核层细胞的减少，而外核层细胞减少不明显，一些神经细胞由2～3排减少至0～1排，与正常比较整个视网膜减少大约30%(t=4.778，P<0.01)，减少最多的是内层视网膜约55%，内核层54%，外核层13%，见表3。在缺血再灌注组，细胞密度降低与正常比较，GCL密度减少60%(t=3.296，P<0.05)，INL密度减少23%(t=2.742，P<0.05)。EGb1组、EGb2组缺血再灌注2周后组织结构视网膜厚度接近正常，视网膜厚度与细胞密度见表4，整个视网膜的厚度减少约20%(t=0.185，P>0.05)，细胞密度减少约15%(t=0.674，P>0.05)，与正常比较差异无显著性。
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表3 缺血再灌注2周后视网膜厚度(略)
表4 缺血再灌注2周后视网膜细胞密度(略)
3 讨论
视网膜神经元损伤影响视功能的病理学基础就是RGC的损伤，包括RGC变性坏死，从而影响光传导功能，导致视力障碍。研究表明，自由基在缺血或损伤后细胞死亡中占重要地位，由于神经元细胞膜由高度不饱和脂质构成，很易受氧自由基攻击发生过氧化反应导致脂质膜的破坏。Nayak [3] 则以升高眼内压法造成兔视网膜缺血，在缺血后重新灌注开始前，同样给予一定量的自由基清除剂，发现视网膜电流图b波振幅的恢复得到明显的改善。由此间接地证明了高眼压致视网膜损伤中有损伤组织的自由基产生。本次实验从视网膜电流图b波振幅下降和病理中内层视网膜变薄，细胞密度下降证实这种结构和功能的损害。ERG-a波反映的是光感受器的活动，而ERG-b波反映的是视网膜内层双极神经元的活动，在实验中发生ERG-a波恢复的幅度超过高眼压前的基本线(不论是治疗组还是对照组)。这种现象在ERG-b波很少见，ERG-b波的恢复缓慢而且不完全，曾经有过报道 [4] 这可能与内视网膜神经元对自由基损伤和缺血敏感有关，而光感受器细胞与脉络膜的血流接近，可能有一定的保护作用。银杏叶主要药理作用:(1)拮抗血小板活化因子(PAF)，银杏内酯目前被认为是最有临床应用价值的天然PAF受体拮抗剂 [5] 。(2)清除自由基，EGb中的还原性羟基功能团可直接发挥抗氧化作用，清除O -2 减轻或阻滞脂质发生过氧化引起的视网膜功能与形态学的损伤 [6] 。在缺血再灌注前给予EGb60mg/(kg·d)，120mg/(kg·d)均可使ERG的b波得以恢复，病理改变减轻，但120mg/(kg·d)剂量效果较明显，说明给予自由基清除剂对于提高视网膜组织的抗氧化损伤的能力有积极作用。在我们实验中只观察EGb两个剂量的作用和2周病理改变，关于EGb的保护是否有剂量依赖以及缺血再灌注后1～2个月治疗眼和未治疗眼有什么不同尚有待研究。
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参考文献
1 Gavrieli Y，Sherman Y，Ben Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation.The Journal of Cell Biology，1992，119(3):493-501.
2 Buchi ER.Cell death in the rat retina after a pressure induced ischemia reperfusion insult:an electron microscopic study I.Ganglion cell layer and miner nuclear layer.Exp Eye Res，1992，55:605-613.
3 Hayreh SS，WeingeistTA.Experimental occlusion of the central artery of theretina，IV:retinal tolerance time to acute ischemia.Br J Ophtholˉmol，1980，64，818-825.
, http://www.100md.com
4 Osborne NN，Larsen A，Barnett NL.Influence of excitatory amino acids and ischemia in rat retinal choline acetyltrans ferase containing cells.Inˉvest Ophthalmol Vis Sci，1995，36，1692-1700.
5 Hockenbery D.Defing apoptosis.Am J Pathol，1995，146(1):16-20.
6 Grosche J，Hartig W，Reichenback-A.Expression of glial fibrillary acidic protein(GFAP)，glutamine synthetase(GS)，and Bcl-2proˉtooncogine protein byMuller(glial)cells in retinal light damage of rats.Neruosci-Lett，1995，185(2):119-122.
(收稿日期:2003-05-21) (编辑 一坤), http://www.100md.com(赖展新)
关键词 银杏叶 视网膜 缺血再灌注 损伤
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)08-0673-03
Gingko biloba extract study the rabbits retina
ischemia-reperfusion injuryprotect function
Lai Zhanxin，Huang Hong，Yang Wenquan，et al.
Department of Ophthalmology，Qingxi Hospital of Dongguan，Guangdong523660.
【Abstract】 Objective Study the gingko biloba extract to the retina ischemia-reperfusion injury protect the function.Methods Manufacture the rabbit retina ischemia-reperfusion injury the model，and is divided into with the machine four group:control group;ischemia-reperfusion group;Ischemia-reperfusion group EGb[60mg/(kg·d)]，group2EGb[120mg/(kg·d)].Record ischemia-reperfusion front，empress30min，1h，2h，4h，1d ERG.Ischemia-reperfusion group:ischemia-reperfusion，Before12h，after1d，3d，1w，2w;ischemia-reperfusion EGb，group2EGb:3d，2w pathology check.Results Ischemia-reperfusion group ERG-a wave60minutes recover normal，EGb-b wave range descent，instauration time reduce slow.group1EGb，group2ERG-b wave the range descent is unkonwn to show，recover time to shorten，1day ERG is basic normal.Ischemia-reperfusion set the more obvious than control group decrease，2weeks and a week of thickness for，ischemia-reperfusion relief empress12hours，seeing the retina dropsy，thickness obviously increasing，24hours recovernormally，after3days，7days，2weeks seeing the retina thickˉness，cell density gradually lowering，after2week ischemia-reperfusion set whole seeing the retina more have no the obvious difference.(t=0.628，P>0.05).Conclusion The gingko biloba extract makes see the retina the ischemia-reperfusion the b wave of the empress ERG can instauration，pathologies to change to alleviate，aegis saw retina isˉchemia-reperfusion injury had obviously the function.
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Key words gingko biloba extract retina ischemia-reperfusion injury
银杏叶含有多种药理活性的有效成分，如黄酮类、内酯B、萜类等，其有改善缺血性心肌、脑组织血液供应，清除氧自由基，抗血小板活化因子的药理作用，目前已广泛应用于心脑血管病的治疗。而视网膜缺血再灌注损伤中，银杏叶提取物EGb(estract gingko biloba)的保护作用，国外也有过报道。本文探讨银杏叶对视网膜缺血再灌注损伤保护作用。
1 材料与方法
1.1 药品和仪器 银杏叶由深圳海王医药集团提供(批号19980106)，每片20mg，含银杏叶提取物9.6mg(黄酮20%，萜类6%)，其他分析用试剂均为分析纯。视觉电生理仪为重庆泰克医电仪器有限公司生产。
1.2 实验动物及分组 新西兰大耳白兔24只，体重30±5kg，雌雄兼用(第三军医大学野战外科研究所实验动物中心提供)，随机分为4组:假手术组;缺血再灌注组;缺血再灌注+EGb1组[60mg/(kg·d)]，缺血再灌注+EGb2组[120mg/(kg·d)]。
, 百拇医药
1.3 模型制作 2%戊巴比妥钠25mg/kg静脉麻醉，将连接生理盐水瓶输液管的针头于角膜缘刺入前房，然后升高输液至与动物垂直距离180cm处，此高度可在眼内形成16.64kPa(1kPa=7.5mmHg)的压力，可观察到球结膜苍白，眼底血管断流，维持60min，降低输液瓶高度达动物水平，拔出针头，可见眼球结膜充血，视网膜恢复血供。缺血再灌注+EGb1组，缺血再灌注+EGb2组动物分别于实验前1周及术后给予银杏叶制剂口服60mg/(kg·d)和120mg/(kg·d)。
1.4 标本的取材及切片的制作 缺血再灌注组的兔分别于12h、1天、3天、1周、2周用过量戊巴比妥钠麻醉致死，EGb组分别于缺血再灌注后3天、2周同法处死，摘除眼球，置入0℃生理盐水中，距角膜缘后3mm处做一平行角膜的巩膜切口，沿此切口剪除眼前节及晶体，吸出玻璃体，取颞上部4mm×6mm眼球壁全层组织块固定于10%中性福尔马林液中72h，常规脱水，浸腊，石腊包埋，做4μm厚连续切片。
, 百拇医药 1.5 视网膜电流图(electroretinogram，ERG)记录 用托吡卡胺+新福林散瞳，经过30min暗适应后记录ERG正常值，再行缺血再灌注模型制作。于缺血再灌注后30min、1h、2h、4h、1天记录ERG。动物置于闪烁光源前15cm，频率强度为5Hz，用角膜接触镜电极记录ERG。记录电极放置角膜表面，参考电极放置在舌头，地线与耳相连接，ERG的b波幅度是从a波的低谷至波的峰值，a波幅度从基线0至最低谷值 [1] 。
1.6 病理观察 根据Hughes [2] 缺血再灌注致视网膜损伤 的计数方法，测量视网膜不同层次厚度(μm)和面积细胞密度(50μm宽的细胞核的数目)，计算缺血再灌注引起视网膜细胞丢失水平。
2 结果
2.1 视网膜ERG改变
2.1.1 缺血再灌注组与正常组比较ERG-a波60min恢复到正常，见表1。
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2.1.2 缺血再灌注组 ERG-b波幅度下降，恢复时间减慢。EGb1组，EGb2组b波幅度下降不明显，恢复时间缩短。在1h～1天各时间点上ERG-b波幅度明显高于缺血再灌注组(EGb11h，t=2.832，EGb12h，t=2.306;EGb21h，t=2.577，P<0.05;EGb14h，t=3.307，EGb11d，t=4.778;EGb22h t=5.492，EGb24h t=11.053，EGb21d t=13.113，P<0.01)，见表2。60min后与正常组比较差异无显著性(t=0.956，P>0.05)，1天后ERG基本正常。
表1 缺血再灌注损伤后ERG-a波恢复过程(略)
表2 EGb对ERG-b波幅影响(略)
2.2 病理改变 缺血再灌注组，再灌注解除后12h，视网膜水肿，厚度明显增加，24h恢复至正常，3天、7天、2周后视网膜厚度，细胞密度逐渐降低，2周后缺血再灌注组整个视网膜的厚度比正常组明显减少，视网膜损伤2周与1周比较差异无显著性(t=0.751，P>0.05)。视网膜厚度减少，主要是内核层细胞的减少，而外核层细胞减少不明显，一些神经细胞由2～3排减少至0～1排，与正常比较整个视网膜减少大约30%(t=4.778，P<0.01)，减少最多的是内层视网膜约55%，内核层54%，外核层13%，见表3。在缺血再灌注组，细胞密度降低与正常比较，GCL密度减少60%(t=3.296，P<0.05)，INL密度减少23%(t=2.742，P<0.05)。EGb1组、EGb2组缺血再灌注2周后组织结构视网膜厚度接近正常，视网膜厚度与细胞密度见表4，整个视网膜的厚度减少约20%(t=0.185，P>0.05)，细胞密度减少约15%(t=0.674，P>0.05)，与正常比较差异无显著性。
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表3 缺血再灌注2周后视网膜厚度(略)
表4 缺血再灌注2周后视网膜细胞密度(略)
3 讨论
视网膜神经元损伤影响视功能的病理学基础就是RGC的损伤，包括RGC变性坏死，从而影响光传导功能，导致视力障碍。研究表明，自由基在缺血或损伤后细胞死亡中占重要地位，由于神经元细胞膜由高度不饱和脂质构成，很易受氧自由基攻击发生过氧化反应导致脂质膜的破坏。Nayak [3] 则以升高眼内压法造成兔视网膜缺血，在缺血后重新灌注开始前，同样给予一定量的自由基清除剂，发现视网膜电流图b波振幅的恢复得到明显的改善。由此间接地证明了高眼压致视网膜损伤中有损伤组织的自由基产生。本次实验从视网膜电流图b波振幅下降和病理中内层视网膜变薄，细胞密度下降证实这种结构和功能的损害。ERG-a波反映的是光感受器的活动，而ERG-b波反映的是视网膜内层双极神经元的活动，在实验中发生ERG-a波恢复的幅度超过高眼压前的基本线(不论是治疗组还是对照组)。这种现象在ERG-b波很少见，ERG-b波的恢复缓慢而且不完全，曾经有过报道 [4] 这可能与内视网膜神经元对自由基损伤和缺血敏感有关，而光感受器细胞与脉络膜的血流接近，可能有一定的保护作用。银杏叶主要药理作用:(1)拮抗血小板活化因子(PAF)，银杏内酯目前被认为是最有临床应用价值的天然PAF受体拮抗剂 [5] 。(2)清除自由基，EGb中的还原性羟基功能团可直接发挥抗氧化作用，清除O -2 减轻或阻滞脂质发生过氧化引起的视网膜功能与形态学的损伤 [6] 。在缺血再灌注前给予EGb60mg/(kg·d)，120mg/(kg·d)均可使ERG的b波得以恢复，病理改变减轻，但120mg/(kg·d)剂量效果较明显，说明给予自由基清除剂对于提高视网膜组织的抗氧化损伤的能力有积极作用。在我们实验中只观察EGb两个剂量的作用和2周病理改变，关于EGb的保护是否有剂量依赖以及缺血再灌注后1～2个月治疗眼和未治疗眼有什么不同尚有待研究。
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参考文献
1 Gavrieli Y，Sherman Y，Ben Sasson SA.Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation.The Journal of Cell Biology，1992，119(3):493-501.
2 Buchi ER.Cell death in the rat retina after a pressure induced ischemia reperfusion insult:an electron microscopic study I.Ganglion cell layer and miner nuclear layer.Exp Eye Res，1992，55:605-613.
3 Hayreh SS，WeingeistTA.Experimental occlusion of the central artery of theretina，IV:retinal tolerance time to acute ischemia.Br J Ophtholˉmol，1980，64，818-825.
, http://www.100md.com
4 Osborne NN，Larsen A，Barnett NL.Influence of excitatory amino acids and ischemia in rat retinal choline acetyltrans ferase containing cells.Inˉvest Ophthalmol Vis Sci，1995，36，1692-1700.
5 Hockenbery D.Defing apoptosis.Am J Pathol，1995，146(1):16-20.
6 Grosche J，Hartig W，Reichenback-A.Expression of glial fibrillary acidic protein(GFAP)，glutamine synthetase(GS)，and Bcl-2proˉtooncogine protein byMuller(glial)cells in retinal light damage of rats.Neruosci-Lett，1995，185(2):119-122.
(收稿日期:2003-05-21) (编辑 一坤), http://www.100md.com(赖展新)