不明原因习惯性流产患者的主动免疫治疗及其与体内免疫调节的关系
【摘要】 目的 探讨不明原因习惯性流产(UHA)患者主动免疫的疗效，及其与体内抗微淋巴细胞毒抗体(APCA)和T细胞亚群(TH1 、TH2 )的关系。方法 对52例UHA患者进行APCA检测，并对APCA阴性者主动免疫治疗，测定治疗前后的APCA水平和用酶联免疫吸附法检测TH1 (IL-2、IFN-γ)和TH2 (IL-4)细胞因子水平。结果 UHA患者中APCA阴性者占80.31%，显著高于对照组(P<0.05)，主动免疫后UHA患者体内APCA水平显著高于治疗前(P<0.05)以丈夫或无关个体为免疫原的治疗效果差异无显著性(P>0.05);主动免疫后UHA患者体内IL-2、IFN-γ水平显著低于治疗前(P<0.05)，而IL-4水平显著高于治疗前(P<0.05)，和对照组水平相近;经主动免疫治疗后妊娠成功率为76.19%，新生儿健康。结论 UHA患者体内存在低水平的APCA和TH1 /TH2 平衡失常;主动免疫可有效提高APCA水平和纠正TH1 /TH2 平衡失常，提高母胎免疫耐受，防止胎儿被母体排斥，导致流产。
, 百拇医药
关键词 不明原因习惯性流产 主动免疫 抗微淋巴细胞毒抗体 T细胞亚群
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0670-03
Active immunotherapy in UHA patients and the relationship with
immunologicregulation
Chen Hui，Wang Dongmei，Qu Lurong，et al.
Liaoning Institute of Family Planning，Shenyang，Liaoning110031.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of active immunotherapy on unexplained habitual abortion(UHA)and the relationships with APCA and T cellsub-group(T H1 and T H2 ).Methods Peripheral bloods of52cases UHA patients were measured to study wether they had low level APCA and the cases with low level APCA were immunized with others lymphocytes for4times.APCA and T cell sub-group(IL-2，IFN-γ，IL-4)were tested beˉfore and after active immunization.Results APCA negative rate ofUHA cases was80.13%before immunization，sigˉnificantly higher than that of the control group(P<0.05).After immunization，APCA levelof UHA cases were signifiˉcantly higher than those of before(P<0.05)and the effects had no difference between two immunogens of husband or donor(P>0.05);The level of IL-2and IFN-γwere significantly lower than those of before(P<0.05)，the level of IL-4was significantly higher than that of before(P<0.05)，and had no difference with that of control group(P>0.05).76.19%cases achieved pregnancy and newborns were normal.Conclusion UHA patients have low level APˉCA and disorder balance of T H1 /T H2 .Active immunotherapy may increase APCA level and change the disorder balance of T H1 /T H2 to prevent abortion.
, 百拇医药
Key words UHA active immunization APCA T cell sub-group
习惯性流产有一半以上原因不明，随着生殖医学的发展，多数学者认为其和母胎免疫耐受低下密切相关[1]。本研究通过对不明原因习惯性流产(UHA)患者的主动免疫治疗疗效的观察，及对治疗前后体内抗微淋巴细胞毒抗体(APCA)和T细胞亚群(TH1 、TH2 )水平的测定，来探讨对UHA患者主动免疫的疗效及其与体内免疫调节的关系。
1 资料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 UHA组 52例2001年4月～2002年6月就诊于中国医科大学第二临床学院妇产科优生遗传门诊的连续3次或3次以上流产的患者，年龄25～40岁，平均31.6岁，排除遗传、内分泌、解剖异常、感染和自身免疫性疾病因素，确诊为UHA。
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1.1.2 对照组 24例同期选取的就诊于中国医科大学第二临床学院妇产科节育门诊的要求放置宫内节育器的正常非孕妇女，年龄24～41岁，平均30.2岁，无自然流产、死胎及死产史。同时亦排除遗传、内分泌、解剖异常、感染和自身免疫性疾病因素。
1.2 观察指标 UHA组行ACPA检测，试验阴性者随机分为两组，以丈夫或无关个体的淋巴细胞为免疫原行主动免疫治疗，测定治疗前后的APCA和TH1 (IL-2、IFN-γ)和TH2 (IL-4)细胞因子水平，随访治疗后的妊娠结局;对照组行APCA和TH1 (IL-2、IFN-γ)和TH2 (IL-4)细胞因子检测。
1.3 检测方法
1.3.1 ACPA检测 采用妻子血清与丈夫的淋巴细胞共同孵育后染色镜检，计数死亡的淋巴细胞百分率来定量，若<10%为ACPA试验阴性。
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1.3.2 主动免疫疗法 取肘静脉血10ml，常规分离，提取淋巴细胞，用生理盐水洗涤3次后加生理盐水0.6ml稀释，在患者前臂三角肌处作皮下皮内各2点接种(活细胞在1×107 以上)。每周1次，共4次。上述操作严格无菌，治疗结束后争取在6个月内妊娠。
1.3.3 IL-2、IFN-γ和IL-4的检测 取肘静脉血2ml，肝素抗凝，用Hank液等倍稀释后，加至淋巴细胞分离液中，离心后收集界面细胞，再次用Hank液洗3次后用1640培养液调整淋巴细胞浓度在1×106 /ml，加入1%植物血凝素，37℃5%CO2 孵育和培养48h，离心收集上清液，-20℃保存待测。采用酶联免疫吸附法，步骤按试剂盒(深圳晶美生物制剂有限公司产品)说明进行，检测TH1 (IL-2、IFN-γ)和TH2 (IL-4)细胞因子水平。
1.3.4 统计学方法 计量资料用t检验，计数资料用χ2 检验，所有数据输入统计分析软件SPSS10.0for Windows专业版进行统计处理，P<0.05差异有显著性。
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2 结果
2.1 UHA患者主动免疫治疗前ACPA检测情况 对52例UHA患者及24例对照组进行ACPA检测发现，UHA患者的ACPA阴性率为80.77%，而对照组只有20.83%，二者差异有显著性(P<0.05)。
2.2 UHA患者主动免疫治疗前后ACPA水平的变化 通过对UHA患者主动免疫治疗前后ACPA检测结果分析发现，无论以丈夫还是以无关个体的淋巴细胞为免疫原行主动免疫治疗均能显著提高UHA患者体内ACPA水平(P<0.05)，且两种治疗结果差异无显著性(P>0.05)，见表1。
表1 UHA患者主动免疫治疗前后ACPA水平的变化 (略 )
2.3 UHA患者主动免疫治疗前后IL-2、IFN-γ和IL-4水平的变化 UHA患者主动免疫治疗前后T细胞亚群水平变化显著，IL-2、IFN-γ较前显著下降，而IL-4水平较前显著升高(P<0.05)，且治疗前IL-2、IFN-γ和IL-4水平与对照组相比差异有显著性(P<0.05)，治疗后各因子水平与对照组相近(P>0.05)，见表2。
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表2 UHA患者主动免疫治疗前后IL-2、IFN-γ和IL-4水平的比较 (略 )
2.4 UHA患者主动免疫治疗后妊娠结局 主动免疫后，再次妊娠36例，其中30例足月产健康儿，2例正在妊娠中(B超检查胎儿发育良好)，4例又出现自然流产，查妊娠物染色体正常。另有6例至今未孕，治疗有效率为76.19%。
3 讨论
3.1 UHA与APCA和T细胞亚群的关系 生殖免疫学认为，妊娠是一种同种异体移植，与移植免疫学的区别在于移植物一旦被受体免疫机制识别便遭到排斥，而胚胎则相反，只有被受体的免疫机制识别才能被接纳，妊娠得以维持。对于UHA的机理多数学者倾向于患者对胚胎的父系抗原呈免疫低反应，因而无法产生足够的保护性抗体，以致胚胎遭到母体排斥而流产[2] 。这类患者的免疫低反应与夫妻间HLA相容性增大有关，ACPA即是针对胚胎父系HLA-1类的IgG抗体，早孕时出现，近足月下降，分娩后又上升，多次妊娠妇女体内检出率达50%以上，而UHA患者体内缺乏此抗体[3] 。由于夫妻间HLA相容性增大，来自胚胎的父系抗原不能刺激母体产生足够的APCA，所以UHA患者体内APˉCA水平低下。本研究通过对UHA患者检查结果发现，UHA患者中APCA阴性率显著高于对照组，和Scott研究结果一致[3] 。
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T细胞亚群中TH1 分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，主要介导细胞免疫、炎症反应和急性排斥反应等;TH2 分泌IL-4、IL-5等细胞因子，介导B淋巴细胞增殖、抗体产生和同种排斥反应耐受，二者相互制约使机体处于免疫平衡状态。在本研究中，和对照组相比UHA患者体内IL-2、IFN-γ水平显著升高，而IL-4水平显著降低，说明T细胞亚群细胞因子的平衡向TH1 型偏离，和UHA密切相关。国外大量研究也证明UHA与滋养细胞抗原刺激后产生的异常的TH1 型免疫应答密切相关[4] 。
3.2 主动免疫及其与APCA的关系 主动免疫产生的初衷是利用他人的淋巴细胞、白细胞、单核细胞等作为免疫原免疫UHA妇女，诱导其体内产生抗HLA、抗TLX封闭抗体，从而防止胚胎或胎儿父系抗原被母体免疫系统识别和杀伤。由于其实验条件要求复杂且疗效有争议[5]，所以，目前国内外尚未普遍开展。
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本研究通过对主动免疫治疗前后的HLA-Ⅰ型抗体即APCA的检测发现，治疗后APCA的水平较治疗前显著升高，且再次妊娠的成功率达76.19%，证明主动免疫的合理性，当然也支持UHA发病机理和UHA患者体内保护性抗体不足有关。另外主动免疫后新生儿健康，母亲亦无因治疗而发现新的免疫方面的疾病，提示主动免疫治疗UHA是安全的。
本研究发现，无论以丈夫或无关个体的淋巴细胞作为免疫原进行免疫，均能使UHA患者体内APCA水平显著升高，两种治疗方式结果差异无显著性。这就为那些丈夫有恙(如HBsAg阳性)而不能提供免疫原的UHA妇女提供了有效的治疗方式。
3.3 主动免疫与T细胞亚群的关系 本研究结果发现，主动免疫后UHA患者体内IL-2、IFN-γ因子表达水平显著下降，而IL-4表达水平显著升高，从而使UHA患者体内T细胞亚群水平接近对照组水平，提示主动免疫治疗有助于UHA患者体内T细胞亚群因子表达的平衡向利于TH2 方向转换，进而诱导母体对胚胎的免疫耐受，使妊娠得以维持。这也可能是主动免疫使妊娠得以维持的又一机制。
, 百拇医药
总之，本研究显示UHA患者体内APCA水平低下，T细胞亚群细胞因子平衡失调，通过对其主动免疫治疗可以提高体内APCA水平，促进T细胞亚群细胞因子平衡向利于妊娠的TH2 型细胞介导的免疫应答转换，使再次妊娠的成功率提高。但有关主动免疫治疗的具体机制仍十分复杂，待进一步研究。
参考文献
1 Komlos L，Vardimon D，Notmann J，et al.Mixed maternal-paternal lymphocytecultures before and after immunotherapy for recurrent sponˉtaneous abortion.Am J Reprod Immunol，1996，35:30-33.
2 李大金，朱影，王明雁，等.反复流产的免疫流行学研究.中华医学杂志，1998，78:94-97.
, http://www.100md.com
3 Scott JR，Rate NS，Branch DW.Immunologic aspects of recurrent aborˉtion and fetal death.Obstet Gynecol，1987，70:645.
4 Hill JA，Polgan K，Arderson DJ.T-Helper1Type immunity to troˉphoblast in women with recurrent spontaneous abortion.JAMA，1995，273(24):1933-1936.
5 Tedesco F，Pausa M，Bulla R，et al.The maternal-fetal immune relaˉtionship in pregnancy.Recent Prog Med，1997，88(9):406-414.
(编辑 张璇), http://www.100md.com(陈辉)
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关键词 不明原因习惯性流产 主动免疫 抗微淋巴细胞毒抗体 T细胞亚群
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)05-0670-03
Active immunotherapy in UHA patients and the relationship with
immunologicregulation
Chen Hui，Wang Dongmei，Qu Lurong，et al.
Liaoning Institute of Family Planning，Shenyang，Liaoning110031.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of active immunotherapy on unexplained habitual abortion(UHA)and the relationships with APCA and T cellsub-group(T H1 and T H2 ).Methods Peripheral bloods of52cases UHA patients were measured to study wether they had low level APCA and the cases with low level APCA were immunized with others lymphocytes for4times.APCA and T cell sub-group(IL-2，IFN-γ，IL-4)were tested beˉfore and after active immunization.Results APCA negative rate ofUHA cases was80.13%before immunization，sigˉnificantly higher than that of the control group(P<0.05).After immunization，APCA levelof UHA cases were signifiˉcantly higher than those of before(P<0.05)and the effects had no difference between two immunogens of husband or donor(P>0.05);The level of IL-2and IFN-γwere significantly lower than those of before(P<0.05)，the level of IL-4was significantly higher than that of before(P<0.05)，and had no difference with that of control group(P>0.05).76.19%cases achieved pregnancy and newborns were normal.Conclusion UHA patients have low level APˉCA and disorder balance of T H1 /T H2 .Active immunotherapy may increase APCA level and change the disorder balance of T H1 /T H2 to prevent abortion.
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Key words UHA active immunization APCA T cell sub-group
习惯性流产有一半以上原因不明，随着生殖医学的发展，多数学者认为其和母胎免疫耐受低下密切相关[1]。本研究通过对不明原因习惯性流产(UHA)患者的主动免疫治疗疗效的观察，及对治疗前后体内抗微淋巴细胞毒抗体(APCA)和T细胞亚群(TH1 、TH2 )水平的测定，来探讨对UHA患者主动免疫的疗效及其与体内免疫调节的关系。
1 资料与方法
1.1 研究对象
1.1.1 UHA组 52例2001年4月～2002年6月就诊于中国医科大学第二临床学院妇产科优生遗传门诊的连续3次或3次以上流产的患者，年龄25～40岁，平均31.6岁，排除遗传、内分泌、解剖异常、感染和自身免疫性疾病因素，确诊为UHA。
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1.1.2 对照组 24例同期选取的就诊于中国医科大学第二临床学院妇产科节育门诊的要求放置宫内节育器的正常非孕妇女，年龄24～41岁，平均30.2岁，无自然流产、死胎及死产史。同时亦排除遗传、内分泌、解剖异常、感染和自身免疫性疾病因素。
1.2 观察指标 UHA组行ACPA检测，试验阴性者随机分为两组，以丈夫或无关个体的淋巴细胞为免疫原行主动免疫治疗，测定治疗前后的APCA和TH1 (IL-2、IFN-γ)和TH2 (IL-4)细胞因子水平，随访治疗后的妊娠结局;对照组行APCA和TH1 (IL-2、IFN-γ)和TH2 (IL-4)细胞因子检测。
1.3 检测方法
1.3.1 ACPA检测 采用妻子血清与丈夫的淋巴细胞共同孵育后染色镜检，计数死亡的淋巴细胞百分率来定量，若<10%为ACPA试验阴性。
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1.3.2 主动免疫疗法 取肘静脉血10ml，常规分离，提取淋巴细胞，用生理盐水洗涤3次后加生理盐水0.6ml稀释，在患者前臂三角肌处作皮下皮内各2点接种(活细胞在1×107 以上)。每周1次，共4次。上述操作严格无菌，治疗结束后争取在6个月内妊娠。
1.3.3 IL-2、IFN-γ和IL-4的检测 取肘静脉血2ml，肝素抗凝，用Hank液等倍稀释后，加至淋巴细胞分离液中，离心后收集界面细胞，再次用Hank液洗3次后用1640培养液调整淋巴细胞浓度在1×106 /ml，加入1%植物血凝素，37℃5%CO2 孵育和培养48h，离心收集上清液，-20℃保存待测。采用酶联免疫吸附法，步骤按试剂盒(深圳晶美生物制剂有限公司产品)说明进行，检测TH1 (IL-2、IFN-γ)和TH2 (IL-4)细胞因子水平。
1.3.4 统计学方法 计量资料用t检验，计数资料用χ2 检验，所有数据输入统计分析软件SPSS10.0for Windows专业版进行统计处理，P<0.05差异有显著性。
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2 结果
2.1 UHA患者主动免疫治疗前ACPA检测情况 对52例UHA患者及24例对照组进行ACPA检测发现，UHA患者的ACPA阴性率为80.77%，而对照组只有20.83%，二者差异有显著性(P<0.05)。
2.2 UHA患者主动免疫治疗前后ACPA水平的变化 通过对UHA患者主动免疫治疗前后ACPA检测结果分析发现，无论以丈夫还是以无关个体的淋巴细胞为免疫原行主动免疫治疗均能显著提高UHA患者体内ACPA水平(P<0.05)，且两种治疗结果差异无显著性(P>0.05)，见表1。
表1 UHA患者主动免疫治疗前后ACPA水平的变化 (略 )
2.3 UHA患者主动免疫治疗前后IL-2、IFN-γ和IL-4水平的变化 UHA患者主动免疫治疗前后T细胞亚群水平变化显著，IL-2、IFN-γ较前显著下降，而IL-4水平较前显著升高(P<0.05)，且治疗前IL-2、IFN-γ和IL-4水平与对照组相比差异有显著性(P<0.05)，治疗后各因子水平与对照组相近(P>0.05)，见表2。
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表2 UHA患者主动免疫治疗前后IL-2、IFN-γ和IL-4水平的比较 (略 )
2.4 UHA患者主动免疫治疗后妊娠结局 主动免疫后，再次妊娠36例，其中30例足月产健康儿，2例正在妊娠中(B超检查胎儿发育良好)，4例又出现自然流产，查妊娠物染色体正常。另有6例至今未孕，治疗有效率为76.19%。
3 讨论
3.1 UHA与APCA和T细胞亚群的关系 生殖免疫学认为，妊娠是一种同种异体移植，与移植免疫学的区别在于移植物一旦被受体免疫机制识别便遭到排斥，而胚胎则相反，只有被受体的免疫机制识别才能被接纳，妊娠得以维持。对于UHA的机理多数学者倾向于患者对胚胎的父系抗原呈免疫低反应，因而无法产生足够的保护性抗体，以致胚胎遭到母体排斥而流产[2] 。这类患者的免疫低反应与夫妻间HLA相容性增大有关，ACPA即是针对胚胎父系HLA-1类的IgG抗体，早孕时出现，近足月下降，分娩后又上升，多次妊娠妇女体内检出率达50%以上，而UHA患者体内缺乏此抗体[3] 。由于夫妻间HLA相容性增大，来自胚胎的父系抗原不能刺激母体产生足够的APCA，所以UHA患者体内APˉCA水平低下。本研究通过对UHA患者检查结果发现，UHA患者中APCA阴性率显著高于对照组，和Scott研究结果一致[3] 。
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T细胞亚群中TH1 分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，主要介导细胞免疫、炎症反应和急性排斥反应等;TH2 分泌IL-4、IL-5等细胞因子，介导B淋巴细胞增殖、抗体产生和同种排斥反应耐受，二者相互制约使机体处于免疫平衡状态。在本研究中，和对照组相比UHA患者体内IL-2、IFN-γ水平显著升高，而IL-4水平显著降低，说明T细胞亚群细胞因子的平衡向TH1 型偏离，和UHA密切相关。国外大量研究也证明UHA与滋养细胞抗原刺激后产生的异常的TH1 型免疫应答密切相关[4] 。
3.2 主动免疫及其与APCA的关系 主动免疫产生的初衷是利用他人的淋巴细胞、白细胞、单核细胞等作为免疫原免疫UHA妇女，诱导其体内产生抗HLA、抗TLX封闭抗体，从而防止胚胎或胎儿父系抗原被母体免疫系统识别和杀伤。由于其实验条件要求复杂且疗效有争议[5]，所以，目前国内外尚未普遍开展。
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本研究通过对主动免疫治疗前后的HLA-Ⅰ型抗体即APCA的检测发现，治疗后APCA的水平较治疗前显著升高，且再次妊娠的成功率达76.19%，证明主动免疫的合理性，当然也支持UHA发病机理和UHA患者体内保护性抗体不足有关。另外主动免疫后新生儿健康，母亲亦无因治疗而发现新的免疫方面的疾病，提示主动免疫治疗UHA是安全的。
本研究发现，无论以丈夫或无关个体的淋巴细胞作为免疫原进行免疫，均能使UHA患者体内APCA水平显著升高，两种治疗方式结果差异无显著性。这就为那些丈夫有恙(如HBsAg阳性)而不能提供免疫原的UHA妇女提供了有效的治疗方式。
3.3 主动免疫与T细胞亚群的关系 本研究结果发现，主动免疫后UHA患者体内IL-2、IFN-γ因子表达水平显著下降，而IL-4表达水平显著升高，从而使UHA患者体内T细胞亚群水平接近对照组水平，提示主动免疫治疗有助于UHA患者体内T细胞亚群因子表达的平衡向利于TH2 方向转换，进而诱导母体对胚胎的免疫耐受，使妊娠得以维持。这也可能是主动免疫使妊娠得以维持的又一机制。
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总之，本研究显示UHA患者体内APCA水平低下，T细胞亚群细胞因子平衡失调，通过对其主动免疫治疗可以提高体内APCA水平，促进T细胞亚群细胞因子平衡向利于妊娠的TH2 型细胞介导的免疫应答转换，使再次妊娠的成功率提高。但有关主动免疫治疗的具体机制仍十分复杂，待进一步研究。
参考文献
1 Komlos L，Vardimon D，Notmann J，et al.Mixed maternal-paternal lymphocytecultures before and after immunotherapy for recurrent sponˉtaneous abortion.Am J Reprod Immunol，1996，35:30-33.
2 李大金，朱影，王明雁，等.反复流产的免疫流行学研究.中华医学杂志，1998，78:94-97.
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3 Scott JR，Rate NS，Branch DW.Immunologic aspects of recurrent aborˉtion and fetal death.Obstet Gynecol，1987，70:645.
4 Hill JA，Polgan K，Arderson DJ.T-Helper1Type immunity to troˉphoblast in women with recurrent spontaneous abortion.JAMA，1995，273(24):1933-1936.
5 Tedesco F，Pausa M，Bulla R，et al.The maternal-fetal immune relaˉtionship in pregnancy.Recent Prog Med，1997，88(9):406-414.
(编辑 张璇), http://www.100md.com(陈辉)