TE85细胞中BcL-2和Bax的表达及临床意义
【摘要】 目的 应用原位杂交及流式细胞术研究TNF-α、IL-1β作用下TE85人成骨样细胞株BcL-2、Bax mRNA表达与凋亡关系。方法 培养细胞分为4组:对照组，TNF-α组，IL-1β组，TNF-α+IL-1β组。BcL-2、Bax原位杂交结果用图像分析软件半定量测定其平均灰度值及积分光密度，经流式细胞仪测定FITC-Annexin V及PI双标记后TE85细胞凋亡率。结果 细胞因子作用下，3组BcL-2mRNA表达量均较对照组有一定增加，但同时Bax mRNA表达升高更明显，同时流式细胞仪测定TNF-α组、IL-1β组细胞凋亡(Annexin V + /PI - )明显增加(P<0.01)，而TNF-α+IL-1β共同作用下，TE85细胞凋亡率进一步上升(P<0.01)，表明随着胞内Bax/BcL-2比值上升，细胞将进一步趋向凋亡。结论 成骨细胞凋亡在骨质疏松症发病过程中扮演主要角色，而Bax/BcL-2比值变化可相当程度上反映其生存情况。
关键词 成骨细胞BcL-2 Bax 流式细胞仪 凋亡
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【文献标识码】 【文章编号】 1726-6424(2003)04-0289-04
BcL-2and Bax expression and apoptosis in human osteoblast-likeosteosarcoma
cell line TE85
Li Ang，Sun Lan，Qing Maosheng，et al.
The Hospital of Traditional Chinese Medicine of Shenzhen，Shenzhen518033.
【Abstract】 Objective To explore the relationship between the gene expression of BcL-2and Bax and huˉman osteoblast apoptosis.Methods The cultured humanosteoblast-like osteosarcoma cell line TE85was divided inˉto control group，TNF-αgroup，IL-1βgroup，TNF-α+IL-1βgroup.In situ hybridization was used to detect the expression of BcL-2and Bax mRNA，and image analysis was done to measure the gray scale and average integral opˉtical density.Stained with fluorescein isothiocyanate(FITC)labeled Annexin V and propidium iodide(PI)，the apoptotic TE85cells was quantified by flow cytometry(FMC).Results BcL-2mRNA expression incressed，simultaneously the expression of Bax markedly increased(P<0.01)，and the percentage of apoptotic cells(Annexin V + /PI - )was inˉcreased(P<0.01).Conclusion Increased TNF-αand IL-1βis a pathologic factor in the process of osteoporosis，and the ratio of Bax/BcL-2may be a useful prognostic parameter for the osteoblast apoptosis.
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Key words osteoblast BcL-2 Bax flow cytometry apoptosis
在骨的正常发育及病理情况下均存在骨细胞凋亡，Manolagas [1] 研究发现在骨正常吸收重建过程中即有60%～70%成骨细胞在不同阶段凋亡，而仅有30%～40%成骨细胞转化为骨衬细胞(bone lining cell)或骨细胞。Hock JM等 [2] 证实绝经后骨质疏松患者骨的快速丢失是由于骨陷窝内的成骨细胞发生异常凋亡。本实验应用FITC-Annexin V/PI双标记技术，通过流式细胞仪(flow cytometer，FCM)检测细胞因子TNF-α、IL-1β作用下人成骨样细胞TE85凋亡情况，并结合BcL-2、Bax原位杂交半定量分析进一步探讨凋亡在骨质疏松症发病过程中的作用机制。
1 材料和方法
1.1 细胞株 TE85人成骨样细胞株，由美国UCSF Cell Culture Facility赠送;Mc-Coy’s5A培养基，Gibco公司。
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1.2 实验试剂 细胞因子:重组人TNF-α(活性≥1.4J/mg)，Pepro Tech公司;FITC-Annexin V/PI双染试剂盒，Pharmingen公司;BcL-2及Bax之地高辛标记cDNA多相寡核苷酸探针，SABC试剂盒，DAB及AEC显色剂试剂盒，武汉博士德公司。
1.3 实验仪器 FACS Calibur流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司;倒置显微镜及照相系统，日本Olympus公司;MetaMorph图像分析软件3.51版，美国Universal Imaging公司。
1.4 细胞培养 取培养瓶中传代72h TE85细胞，倾去培养液，用0.25%胰酶消化1min，待细胞分散后，移去消化液，加入含10%胎牛血清的McCoy’s5A培养液，反复吹打，使细胞悬浮于培养液中，并调细胞浓度为4×10 4 /ml，加入24孔板，细胞培养24h分别加入3组细胞因子，终浓度分别为:TNF-α组40U/ml;IL-1β组10U/ml;TNF-α+IL-1β组(40U/ml+10U/ml)。以不加细胞因子之正常培养细胞作为对照组
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1.5 Bcl-2/Bax原位杂交 经多聚赖氨酸及1‰DEPC处理后的爬片进行细胞培养，加入细胞因子作用72h后取出细胞爬片，3%H 2 O 2 处理，3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶消化，加入BcL-2或Bax探针，40℃湿盒中杂交过夜，梯度SSC洗涤，封闭，依次滴加Ⅰ抗、Ⅱ抗，PBS洗涤，DAB或AEC避光显色。以PBS代替探针作阴性对照，胞浆内出现棕黄色或红色为阳性表达作显微镜下观察，采用MetaMorph图像分析软件3.51版本对细胞进行半定量分析，每爬片取5视野，测定其平均灰度值(average gray scale)及积分光密度(inˉtegral optical density，IOD)作统计指标。
1.6 流式细胞仪检测 培养细胞经胰蛋白酶消化后，PBS洗细胞2次，用试剂盒中缓冲液悬浮细胞，并调整细胞浓度为1×10 6 /ml，加入100μl细胞悬浮液(含1×10 5 细胞)至一试管，每试管中加入标记有异硫氰酸荧光素(FITC)的磷酯酰丝氨酸结合蛋白V(Annexin V)5μl，然后加入2μl碘化丙啶(PI)，混匀置冰浴暗处孵育15min，加入400μl缓冲液，上流式细胞仪分析，上机每标本检测细胞设定为10000个。
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1.7 统计学分析 SPSS10.0软件作均值方差分析，并进行各组间t检验，数据以X±s描述。
2 结果
2.1 Bcl-2原位杂交实验 见图1。TNF-α组与对照组比较，BcL-2表达灰度值及积分光密度差异有显著性(P<0.05);IL-1β组与对照组比较差异无显著性，TNF-α+IL-1β组与对照组比较，灰度值差异有显著性(P<0.05)，积分光密度值差异有极显著性(P<0.01)。
图1 TE85细胞BcL-2表达原位杂交结果灰度值和积分光密度(略)
2.2 Bax原位杂交实验 见图2。与对照组比较，3组灰度值差异均有极显著性(P<0.01)，TNF-α组与TNF-α+IL-1β组灰度值差异有显著性(P<0.05);TNF-α组、IL-1β组积分光密度值同对照组比较差异有显著性(P<0.05)，TNF-α+IL-1β组则差异有极显著性(P<0.01)，TNF-α组、IL-1β组积分光密度值同TNF-α+IL-1β组比较差异有极显著性(P<0.01)。
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图2 TE85细胞Bax表达原位杂交结果灰度值和积分光密度 (略)
2.3 流式细胞仪检测 见图3，表1。FITC-Annexin V/PI双标记流式细胞仪检测结果显示:与对照组比较，细胞因子TNF-α或IL-1β作用下，凋亡细胞(R2象限，Annexin V + /PI - )数量明显上升，差异有极显著性(P<0.01);TNF-α+IL-1β共同作用与TNF-α或IL-1β单独作用比较，凋亡细胞数量百分比差异有极显著性(P<0.01);TNF-α组同IL-1β组比较，凋亡细胞(R2象限，Annexin V + /PI - )百分比也有明显上升(P<0.05)。各组细胞因子作用下，坏死细胞(R3象限，Annexin V + /PI + )数量较对照组也增加明显(P<0.01)，但TNF-α组与TNF-α+IL-1β组差异无显著性。图3 TE85细胞凋亡FITC-Annexin V/PI标记流式细胞仪检测结果(略)
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表1 凋亡细胞(R2，Annexin V + /PI - )及坏死细胞(R3，Annexin V + /PI + )结果比较(%)(略)
3 讨论
骨作为一种不断重建的组织，其骨量很大程度取决于构成该组织的活性细胞数量。构成骨组织的细胞主要包括骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等，其中骨细胞的数量及活性对于骨量的维持起着重要的作用 [3] 。成骨细胞起源于多能的骨基质间充质干细胞，生发过程为骨原性干细胞→早期骨祖细胞→晚期骨祖细胞→前成骨细胞→成骨细胞→骨细胞，其最终有3种转归可能:被埋于其自身分泌的骨基质中转变为骨细胞;或转变为静止的骨衬细胞;或凋亡 [4] 。骨转换中成骨细胞形成新骨和破骨细胞吸收旧骨的过程在时间上和空间上紧密偶联并发生在同一骨再建单位中，成骨细胞的异常凋亡可造成骨形成———骨吸收平衡被破坏或解偶联，骨吸收大于骨形成 [5] ，所以骨细胞的正常生存周期对于骨量的维持和骨质疏松症的防治有重要意义。
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在骨细胞生存的微环境中，存在多种细胞因子或激素，其中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)不仅作为一种强有力的刺激破骨细胞性骨吸收因子，在绝经后骨质疏松症的发病中起着重要作用，同时还可促进成骨细胞的凋亡 [6，7] 。在骨质疏松组织中呈高表达的白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)在体内也可以显著促进成骨细胞的凋亡 [8] 。细胞凋亡过程大致可分为5个不同的阶段:即凋亡的启动或激发，细胞内凋亡信号的传导及调控，凋亡效应分子的激活，蛋白及DNA分子的断裂，细胞死亡。细胞凋亡过程被多种基因所调控，其中的BcL-2基因家族包括BcL-2、Bax、Bak等基因，主要定位在核膜的胞质面、内质网及线粒体外膜上，通常以二聚体的形式发挥作用。BcL-2表达水平高于Bax时，随着BcL-2蛋白的表达量的升高，越来越多的Bax二聚体分开，与BcL-2形成比Bax-Bax更稳定的Bax-BcL-2异源二聚体，从而“中和”了Bax诱导凋亡的作用，细胞凋亡受抑制;Bax表达水平高于BcL-2时，则形成Bax-Bax同源二聚体，细胞凋亡增强 [9] 。如Jilˉka等 [10] 研究发现抗Fas抗体所诱导人类成骨样细胞MG-63凋亡与Bax/BcL-2蛋白表达比率的上升有关。还有研究表明 [11] ，其他促进或抑制细胞凋亡的基因影响最终也可归结为Bax/BcL-2比值的改变，用Bax/BcL-2比值来反映促进或抑制细胞凋亡之间的平衡是可行的。
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本实验选用重组人TNF-α、IL-1β作用下人的成骨样细胞TE85，BcL-2及Bax原位杂交结果观察到:同对照组比较BcL-2mRNA表达量，TNF-α组与TNF-α+IL-1β组差异均有显著性(P<0.05)。另一方面，3组灰度值及积分光密度值所反映的Bax mRNA表达量与对照组比较，差异均有极显著性(P<0.01)，同时，TNF-α组灰度值、TNF-α组及IL-1β组的积分光密度与TNF-α+IL-1β组比较，差异均有显著性(P<0.05)。表明细胞因子作用于体外培养TE85细胞后，BcL-2及Bax mRNA表达均有升高，但Bax mRNA表达升高更明显，故细胞内Bax/BcL-2比值上升，表达生成更多的Bax蛋白，细胞则趋向凋亡。本实验数据也显示，3组BcL-2mRNA表达均较未受细胞因子刺激的对照组升高(P<0.05)，提示细胞接受致病信号刺激后，随着Bax表达上调，可能细胞内存在一定抗凋亡机制从而造成BcL-2表达量也相应增加。
早期凋亡细胞虽维持其细胞膜的完整性，但因细胞膜的磷脂对称性改变而使磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)暴露于细胞膜外，PS可特异结合标记有异硫氰酸荧光素(FITC)的连接素V(Annexin V);碘化丙啶(Propidium ioˉdide，PI)是一种核酸染料，可使变性染色质着色，但不能透过完整的细胞膜。将Annexin-V进行荧光素(如FITC)标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，使用Annexin V/PI双参数法可将正常细胞、凋亡细胞、坏死细胞区分开来，利用流式细胞仪可检测出早期凋亡，因而具有更高的灵敏性及特异性，这是目前先进、高效的凋亡细胞的检测方法 [12] 。TE85细胞体外培养对照组显示其自然凋亡率约为1%(0.96±0.27)，而在细胞因子TNF-α或IL-1β作用下，凋亡细胞(R2象限，Annexin V + /PI - )数量明显上升，在TNF-α+IL-1β共同作用下，HOS TE85凋亡细胞比例又有明 显升高。对照比较BcL-2、Bax原位杂交半定量分析数据，可见若细胞内Bax/BcL-2比值上升，则细胞进一步趋向凋亡，FITC-Annexin V/PI双标记流式细胞仪检测则R2象限(Annexin V + /PI - )所反映的凋亡细胞比例上升。
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体内TNF-α主要来源是巨噬细胞，也可通过成骨细胞自分泌产生。有研究显示:骨质疏松妇女血中TNF-α增加，并和腰椎骨密度下降呈负相关 [13] 。而目前已知可直接启动细胞凋亡的信号途径是通过两种细胞因子:Fas配体(Fas ligand，FasL)或TNF与细胞膜表面的相应受体Fas或TNFR结合后所发生的凋亡反应。本实验结果中，TNF-α及IL-1β单独作用下，以TNF-α组Bax/BcL-2比值上升较明显，TNF-α组凋亡细胞(R2象限，Annexin V + /PI - )与IL-1β组比较，差异有显著性(P<0.05)，提示TNF-α诱导成骨细胞凋亡的生物学效应更强。
Klein等 [14] 发现在老年低骨密度的患者中，骨组织活检发现成骨细胞数目明显减少，并有凋亡小体出现。Tomkinˉson等 [15] 研究绝经后骨质疏松妇女，行髂骨活检发现存在典型骨细胞凋亡征象以及骨细胞凋亡的比例上升，而对去卵巢大鼠应用雌激素替代治疗可显著降低凋亡指数。提示在绝经后妇女和老年人中，由凋亡引起的成骨细胞数量降低及成骨功能减退，是引起骨重建失衡的重要原因。而抑制成骨细胞凋亡可明显减慢骨量丢失过程，如Jilka等 [10] 研究表明:甲状旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)间断性注射增加骨量机制主要在于抑制了骨细胞和成骨细胞的凋亡。所以细胞因子通过诱导成骨细胞发生异常凋亡而致骨吸收-形成偶联细胞数量失调，是骨质疏松发生的主要病理基础之一，但由于凋亡所特有的形态学改变维持时间很短，加之破骨细胞活性增强后骨组织的转换率升高，凋亡细胞在骨组织中不留任何痕迹，以致人们所能观察到的凋亡细胞所占比率较低，而Bax/BcL-2比值可作为衡量成骨细胞生存能力及评价其凋亡的指标之一。
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参考文献
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15 Tomkinson A，Reeve J，Shaw RW，et al.The death of osteocytes via apoptosis accompanies estrogen withgrawal in human bone.J Clin Enˉdocrinol Metab，1997，82:3128-3135.
基金项目:国家中医药管理局科研基金资助项目(97C042)
作者单位:1 518033深圳市中医院骨科
2 100005中国协和医科大学基础医学研究所
3 100035北京积水潭医院研究所
(收稿日期:2003-08-04) (编辑 夫凡), 百拇医药(李昂)
关键词 成骨细胞BcL-2 Bax 流式细胞仪 凋亡
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【文献标识码】 【文章编号】 1726-6424(2003)04-0289-04
BcL-2and Bax expression and apoptosis in human osteoblast-likeosteosarcoma
cell line TE85
Li Ang，Sun Lan，Qing Maosheng，et al.
The Hospital of Traditional Chinese Medicine of Shenzhen，Shenzhen518033.
【Abstract】 Objective To explore the relationship between the gene expression of BcL-2and Bax and huˉman osteoblast apoptosis.Methods The cultured humanosteoblast-like osteosarcoma cell line TE85was divided inˉto control group，TNF-αgroup，IL-1βgroup，TNF-α+IL-1βgroup.In situ hybridization was used to detect the expression of BcL-2and Bax mRNA，and image analysis was done to measure the gray scale and average integral opˉtical density.Stained with fluorescein isothiocyanate(FITC)labeled Annexin V and propidium iodide(PI)，the apoptotic TE85cells was quantified by flow cytometry(FMC).Results BcL-2mRNA expression incressed，simultaneously the expression of Bax markedly increased(P<0.01)，and the percentage of apoptotic cells(Annexin V + /PI - )was inˉcreased(P<0.01).Conclusion Increased TNF-αand IL-1βis a pathologic factor in the process of osteoporosis，and the ratio of Bax/BcL-2may be a useful prognostic parameter for the osteoblast apoptosis.
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Key words osteoblast BcL-2 Bax flow cytometry apoptosis
在骨的正常发育及病理情况下均存在骨细胞凋亡，Manolagas [1] 研究发现在骨正常吸收重建过程中即有60%～70%成骨细胞在不同阶段凋亡，而仅有30%～40%成骨细胞转化为骨衬细胞(bone lining cell)或骨细胞。Hock JM等 [2] 证实绝经后骨质疏松患者骨的快速丢失是由于骨陷窝内的成骨细胞发生异常凋亡。本实验应用FITC-Annexin V/PI双标记技术，通过流式细胞仪(flow cytometer，FCM)检测细胞因子TNF-α、IL-1β作用下人成骨样细胞TE85凋亡情况，并结合BcL-2、Bax原位杂交半定量分析进一步探讨凋亡在骨质疏松症发病过程中的作用机制。
1 材料和方法
1.1 细胞株 TE85人成骨样细胞株，由美国UCSF Cell Culture Facility赠送;Mc-Coy’s5A培养基，Gibco公司。
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1.2 实验试剂 细胞因子:重组人TNF-α(活性≥1.4J/mg)，Pepro Tech公司;FITC-Annexin V/PI双染试剂盒，Pharmingen公司;BcL-2及Bax之地高辛标记cDNA多相寡核苷酸探针，SABC试剂盒，DAB及AEC显色剂试剂盒，武汉博士德公司。
1.3 实验仪器 FACS Calibur流式细胞仪，美国Becton Dickinson公司;倒置显微镜及照相系统，日本Olympus公司;MetaMorph图像分析软件3.51版，美国Universal Imaging公司。
1.4 细胞培养 取培养瓶中传代72h TE85细胞，倾去培养液，用0.25%胰酶消化1min，待细胞分散后，移去消化液，加入含10%胎牛血清的McCoy’s5A培养液，反复吹打，使细胞悬浮于培养液中，并调细胞浓度为4×10 4 /ml，加入24孔板，细胞培养24h分别加入3组细胞因子，终浓度分别为:TNF-α组40U/ml;IL-1β组10U/ml;TNF-α+IL-1β组(40U/ml+10U/ml)。以不加细胞因子之正常培养细胞作为对照组
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1.5 Bcl-2/Bax原位杂交 经多聚赖氨酸及1‰DEPC处理后的爬片进行细胞培养，加入细胞因子作用72h后取出细胞爬片，3%H 2 O 2 处理，3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶消化，加入BcL-2或Bax探针，40℃湿盒中杂交过夜，梯度SSC洗涤，封闭，依次滴加Ⅰ抗、Ⅱ抗，PBS洗涤，DAB或AEC避光显色。以PBS代替探针作阴性对照，胞浆内出现棕黄色或红色为阳性表达作显微镜下观察，采用MetaMorph图像分析软件3.51版本对细胞进行半定量分析，每爬片取5视野，测定其平均灰度值(average gray scale)及积分光密度(inˉtegral optical density，IOD)作统计指标。
1.6 流式细胞仪检测 培养细胞经胰蛋白酶消化后，PBS洗细胞2次，用试剂盒中缓冲液悬浮细胞，并调整细胞浓度为1×10 6 /ml，加入100μl细胞悬浮液(含1×10 5 细胞)至一试管，每试管中加入标记有异硫氰酸荧光素(FITC)的磷酯酰丝氨酸结合蛋白V(Annexin V)5μl，然后加入2μl碘化丙啶(PI)，混匀置冰浴暗处孵育15min，加入400μl缓冲液，上流式细胞仪分析，上机每标本检测细胞设定为10000个。
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1.7 统计学分析 SPSS10.0软件作均值方差分析，并进行各组间t检验，数据以X±s描述。
2 结果
2.1 Bcl-2原位杂交实验 见图1。TNF-α组与对照组比较，BcL-2表达灰度值及积分光密度差异有显著性(P<0.05);IL-1β组与对照组比较差异无显著性，TNF-α+IL-1β组与对照组比较，灰度值差异有显著性(P<0.05)，积分光密度值差异有极显著性(P<0.01)。
图1 TE85细胞BcL-2表达原位杂交结果灰度值和积分光密度(略)
2.2 Bax原位杂交实验 见图2。与对照组比较，3组灰度值差异均有极显著性(P<0.01)，TNF-α组与TNF-α+IL-1β组灰度值差异有显著性(P<0.05);TNF-α组、IL-1β组积分光密度值同对照组比较差异有显著性(P<0.05)，TNF-α+IL-1β组则差异有极显著性(P<0.01)，TNF-α组、IL-1β组积分光密度值同TNF-α+IL-1β组比较差异有极显著性(P<0.01)。
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图2 TE85细胞Bax表达原位杂交结果灰度值和积分光密度 (略)
2.3 流式细胞仪检测 见图3，表1。FITC-Annexin V/PI双标记流式细胞仪检测结果显示:与对照组比较，细胞因子TNF-α或IL-1β作用下，凋亡细胞(R2象限，Annexin V + /PI - )数量明显上升，差异有极显著性(P<0.01);TNF-α+IL-1β共同作用与TNF-α或IL-1β单独作用比较，凋亡细胞数量百分比差异有极显著性(P<0.01);TNF-α组同IL-1β组比较，凋亡细胞(R2象限，Annexin V + /PI - )百分比也有明显上升(P<0.05)。各组细胞因子作用下，坏死细胞(R3象限，Annexin V + /PI + )数量较对照组也增加明显(P<0.01)，但TNF-α组与TNF-α+IL-1β组差异无显著性。图3 TE85细胞凋亡FITC-Annexin V/PI标记流式细胞仪检测结果(略)
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表1 凋亡细胞(R2，Annexin V + /PI - )及坏死细胞(R3，Annexin V + /PI + )结果比较(%)(略)
3 讨论
骨作为一种不断重建的组织，其骨量很大程度取决于构成该组织的活性细胞数量。构成骨组织的细胞主要包括骨细胞、成骨细胞、破骨细胞等，其中骨细胞的数量及活性对于骨量的维持起着重要的作用 [3] 。成骨细胞起源于多能的骨基质间充质干细胞，生发过程为骨原性干细胞→早期骨祖细胞→晚期骨祖细胞→前成骨细胞→成骨细胞→骨细胞，其最终有3种转归可能:被埋于其自身分泌的骨基质中转变为骨细胞;或转变为静止的骨衬细胞;或凋亡 [4] 。骨转换中成骨细胞形成新骨和破骨细胞吸收旧骨的过程在时间上和空间上紧密偶联并发生在同一骨再建单位中，成骨细胞的异常凋亡可造成骨形成———骨吸收平衡被破坏或解偶联，骨吸收大于骨形成 [5] ，所以骨细胞的正常生存周期对于骨量的维持和骨质疏松症的防治有重要意义。
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在骨细胞生存的微环境中，存在多种细胞因子或激素，其中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)不仅作为一种强有力的刺激破骨细胞性骨吸收因子，在绝经后骨质疏松症的发病中起着重要作用，同时还可促进成骨细胞的凋亡 [6，7] 。在骨质疏松组织中呈高表达的白细胞介素1(interleukin-1，IL-1)在体内也可以显著促进成骨细胞的凋亡 [8] 。细胞凋亡过程大致可分为5个不同的阶段:即凋亡的启动或激发，细胞内凋亡信号的传导及调控，凋亡效应分子的激活，蛋白及DNA分子的断裂，细胞死亡。细胞凋亡过程被多种基因所调控，其中的BcL-2基因家族包括BcL-2、Bax、Bak等基因，主要定位在核膜的胞质面、内质网及线粒体外膜上，通常以二聚体的形式发挥作用。BcL-2表达水平高于Bax时，随着BcL-2蛋白的表达量的升高，越来越多的Bax二聚体分开，与BcL-2形成比Bax-Bax更稳定的Bax-BcL-2异源二聚体，从而“中和”了Bax诱导凋亡的作用，细胞凋亡受抑制;Bax表达水平高于BcL-2时，则形成Bax-Bax同源二聚体，细胞凋亡增强 [9] 。如Jilˉka等 [10] 研究发现抗Fas抗体所诱导人类成骨样细胞MG-63凋亡与Bax/BcL-2蛋白表达比率的上升有关。还有研究表明 [11] ，其他促进或抑制细胞凋亡的基因影响最终也可归结为Bax/BcL-2比值的改变，用Bax/BcL-2比值来反映促进或抑制细胞凋亡之间的平衡是可行的。
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本实验选用重组人TNF-α、IL-1β作用下人的成骨样细胞TE85，BcL-2及Bax原位杂交结果观察到:同对照组比较BcL-2mRNA表达量，TNF-α组与TNF-α+IL-1β组差异均有显著性(P<0.05)。另一方面，3组灰度值及积分光密度值所反映的Bax mRNA表达量与对照组比较，差异均有极显著性(P<0.01)，同时，TNF-α组灰度值、TNF-α组及IL-1β组的积分光密度与TNF-α+IL-1β组比较，差异均有显著性(P<0.05)。表明细胞因子作用于体外培养TE85细胞后，BcL-2及Bax mRNA表达均有升高，但Bax mRNA表达升高更明显，故细胞内Bax/BcL-2比值上升，表达生成更多的Bax蛋白，细胞则趋向凋亡。本实验数据也显示，3组BcL-2mRNA表达均较未受细胞因子刺激的对照组升高(P<0.05)，提示细胞接受致病信号刺激后，随着Bax表达上调，可能细胞内存在一定抗凋亡机制从而造成BcL-2表达量也相应增加。
早期凋亡细胞虽维持其细胞膜的完整性，但因细胞膜的磷脂对称性改变而使磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine，PS)暴露于细胞膜外，PS可特异结合标记有异硫氰酸荧光素(FITC)的连接素V(Annexin V);碘化丙啶(Propidium ioˉdide，PI)是一种核酸染料，可使变性染色质着色，但不能透过完整的细胞膜。将Annexin-V进行荧光素(如FITC)标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，使用Annexin V/PI双参数法可将正常细胞、凋亡细胞、坏死细胞区分开来，利用流式细胞仪可检测出早期凋亡，因而具有更高的灵敏性及特异性，这是目前先进、高效的凋亡细胞的检测方法 [12] 。TE85细胞体外培养对照组显示其自然凋亡率约为1%(0.96±0.27)，而在细胞因子TNF-α或IL-1β作用下，凋亡细胞(R2象限，Annexin V + /PI - )数量明显上升，在TNF-α+IL-1β共同作用下，HOS TE85凋亡细胞比例又有明 显升高。对照比较BcL-2、Bax原位杂交半定量分析数据，可见若细胞内Bax/BcL-2比值上升，则细胞进一步趋向凋亡，FITC-Annexin V/PI双标记流式细胞仪检测则R2象限(Annexin V + /PI - )所反映的凋亡细胞比例上升。
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体内TNF-α主要来源是巨噬细胞，也可通过成骨细胞自分泌产生。有研究显示:骨质疏松妇女血中TNF-α增加，并和腰椎骨密度下降呈负相关 [13] 。而目前已知可直接启动细胞凋亡的信号途径是通过两种细胞因子:Fas配体(Fas ligand，FasL)或TNF与细胞膜表面的相应受体Fas或TNFR结合后所发生的凋亡反应。本实验结果中，TNF-α及IL-1β单独作用下，以TNF-α组Bax/BcL-2比值上升较明显，TNF-α组凋亡细胞(R2象限，Annexin V + /PI - )与IL-1β组比较，差异有显著性(P<0.05)，提示TNF-α诱导成骨细胞凋亡的生物学效应更强。
Klein等 [14] 发现在老年低骨密度的患者中，骨组织活检发现成骨细胞数目明显减少，并有凋亡小体出现。Tomkinˉson等 [15] 研究绝经后骨质疏松妇女，行髂骨活检发现存在典型骨细胞凋亡征象以及骨细胞凋亡的比例上升，而对去卵巢大鼠应用雌激素替代治疗可显著降低凋亡指数。提示在绝经后妇女和老年人中，由凋亡引起的成骨细胞数量降低及成骨功能减退，是引起骨重建失衡的重要原因。而抑制成骨细胞凋亡可明显减慢骨量丢失过程，如Jilka等 [10] 研究表明:甲状旁腺激素(Parathyroid hormone，PTH)间断性注射增加骨量机制主要在于抑制了骨细胞和成骨细胞的凋亡。所以细胞因子通过诱导成骨细胞发生异常凋亡而致骨吸收-形成偶联细胞数量失调，是骨质疏松发生的主要病理基础之一，但由于凋亡所特有的形态学改变维持时间很短，加之破骨细胞活性增强后骨组织的转换率升高，凋亡细胞在骨组织中不留任何痕迹，以致人们所能观察到的凋亡细胞所占比率较低，而Bax/BcL-2比值可作为衡量成骨细胞生存能力及评价其凋亡的指标之一。
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基金项目:国家中医药管理局科研基金资助项目(97C042)
作者单位:1 518033深圳市中医院骨科
2 100005中国协和医科大学基础医学研究所
3 100035北京积水潭医院研究所
(收稿日期:2003-08-04) (编辑 夫凡), 百拇医药(李昂)