应用AFM对人膀胱癌组织细胞超微结构的观察研究
【摘要】 目的 应用原子力显微镜(AFM)技术观察研究人膀胱癌组织细胞的超微结构，进而在原子级或纳米级水平上揭示膀胱粘膜上皮组织细胞发生癌变前后的动态变化。方法 手术取人膀胱癌新鲜组织和细胞，分常规固定组(A组)和不做处理组(B组)，分别使用AFM观测成像。结果 两组中同样的标本经不同方法处理后，在相同分辨率下其超微结构存在显著差别。结论 膀胱癌组织细胞在使用戊二醛等常规固定剂处理，使其精细结构遭到破坏后所获得的超微结构图像不能反映其真实形态学变化;相反，应用AFM可实现对未做任何处理的新鲜组织细胞直接实时的动态观测研究，所得图像资料能够揭示其固有的超微结构，因而对在原子级或纳米级分辨率下阐明膀胱上皮细胞发生癌变的机制提供了新的途径。
关键词 原子力显微镜检 膀胱癌 超微结构
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)06-0481-03
Using the AFM to observe and study the ultrastructure
, http://www.100md.com
of the tissue and cells of the human bladder cancer
Chen Bin，Han Li，Bai Jinliang，et al.
The Department of Urology，The First Hospital of Lanzhou Medical College，Lanzhou730000.
【Abstract】 Objective Using the AFM(atomic force microscopy)to observe and study the ultrastructure of the tissue and cells of the human bladder was performed.Methods The fresh tissue and cells of the human bladder cancer from the operation were divided into A and B group in random，whose ultrastructure would beobserved using the AFM.Results The obvious differences were found between thoseimages of the ultrastructure of the A and B group in the same resolving ratio，and this phenomenon was due to the different fixing methods.Conclusion The AFM was a novel method to observe and analyse the ultrastructure of the tissue and cells of the human bladder cancer directly and real-timely.This experimental modelwould play an important role for elucidating the cancerous mechaˉnism of the bladder normal cells at the atomic or nano-meter level.
, 百拇医药
Key words atomic force microscopy human bladder cancer ultrastrcuture
1982年，国际商业机器公司苏黎世实验室的Gerd Binˉning和Heinrich Rohrer [1] 共同研制成功了世界第一台新型的表面分析仪器—扫描隧道显微镜(Scanning Tunneling Microˉscope，简称STM)，他们因此而获得1986年诺贝尔物理学奖。1986年，Binning等 [2] 又在扫描隧道显微镜的基础上成功研制出原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，简称AFM)，它是通过应用氮化硅探针扫描样本表面时，由悬臂的起伏反馈测到的探针与样本表面原子间的力场变化，从而描绘出样本表面原子级分辨率的三维图像。AFM不要求样品梯度脱水、染色、临界点干燥、喷涂导体物质，也不必达到真空条件即可实现在纳米级分辨率水平上、常规生理环境中对活细胞表面超微结构的三维成像观察和数据分析 [3] 。它的出现弥补了扫描电镜(SEM)需要样品必须导电的严重不足，克服了样品制备、观测条件限制等多方面的困难，从此开拓了一个研究生命科学的崭新途径。由此，人们对生命的认识开始深入到原子级或纳米级水平上的超微观领域。
, 百拇医药
因此，为探讨应用AFM技术研究人膀胱癌组织细胞超微结构的可行性，从而为在原子级或纳米级水平上揭示膀胱上皮组织细胞发生癌变前后的动态变化提供必要的条件，本研究阐述和对比研究了利用AFM实现对人膀胱癌组织细胞超微结构成像观察的实验方法。
1 材料和方法
1.1 新鲜人膀胱癌组织细胞样本的提取 同一膀胱癌患者(术前经尿膀胱镜取活检病理证实)行膀胱部分切除术，打开膀胱后直接钳夹切取膀胱癌组织两块(每块约1cm×1cm大小)。
1.2 一个样本以2.5%的戊二醛固定30min后，用PBS液清洗两遍，空气中干燥后再经PBS清洗两遍，然后依次梯度脱水、临界点干燥、环氧树脂包裹后，切片(厚度1mm)并置于AFM样品台上扫描观察。
1.3 另一样本不做任何处理，待其在室温下自由干燥后，在不超过1h内直接置于AFM样品台上扫描成像。
, 百拇医药
1.4 AFM 由清华大学物理系提供。型号:NanoⅢa(Digital Instrument Company，美国)。
1.5 AFM测量方法 [4] 实验中采用接触模式AFM(Contact-mode AFM)，它是通过测量样品表面原子与探针尖表面原子之间的斥力来反馈成像的。探针材料为氮化硅(Si3 N4)，集成于一个弹性系数为0.06N/m的微悬臂梁的末端。针尖形状为金字塔形，针尖曲率半径约为3nm。当探针在样品表面扫描时，样品表面的轮廓变化使探针与样品之间的作用力发生变化，从而造成悬臂梁发生弯曲变形。通过跟踪悬臂梁的弯曲变形即可测出样品表面的轮廓变化。在AFM中采用“光束反射探测”技术测量悬臂的弯曲变形，其原理如图1所示。光电探测器的输出能反映样品表面的轮廓变化，据此即可获得样品表面轮廓的图像。被测样品位于由管状压电陶瓷(PZT)制成的扫描器上，扫描器一方面实现样品在水平方向的扫描运动，另一方面产生样品在垂直方向的运动，从而描绘出样品的三维结构。
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图1 AFM原理示意图(略)
1.6 实测方法的确定 对A组已固定并包裹后的样品切片直接测试时发现，由于切片表面肉眼不能看到的凹凸不平在AFM探针下非常明显，造成探针起伏太大几乎未能成像。因而样品重新切片，并对预测面(即切削面)做适当的磨削处理，光镜观察基本平整后再置于样品台上测试成像。B组新鲜标本直接用解剖刀小心地切取0.5cm×0.5cm大小的一块组织，注意切缘整齐，然后两组待测样品均用双面胶粘贴于样品台上，进行AFM测试。
2 结果
2.1 A组样品不同测量范围的AFM图像 AFM在不同扫描范围下的测量结果。图像的扫描范围越小，对应的放大倍数越大。(a)测量范围为20μm×20μm的超微结构图像(见图2)。(b)测量范围为15μm×15μm的超微结构图像(见图3)。
2.2 B组样品不同测量范围的AFM图像(见图4、图5)。 图2 测量范围为20μm×20μm的超微结构图像 图3 测量范围为15μm×15μm 的超微结构图像
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图4 在20μm×20μm的测量范围内能够辨认出呈梭形的单个膀胱癌细胞(略)
图5 在50μm×50μm的测量范围内能够看到排列有序、形状类似、大小基本均等的多个膀胱癌细胞 (略)
3 讨论
3.1 应用原子力显微镜研究膀胱癌的可行性 以往对膀胱癌细胞超微结构的观察主要依靠扫描电镜和透射电镜技术。众所周知，这两种方法要求对标本做严格而繁琐的处理。在戊二醛固定、脱水、包埋、钴铀电子染色、离子溅射镀膜或其他方法镀膜等过程中，组织细胞不可避免地会遭受不同程度的破坏。然而，时至今日我们仍然不得不使用这些技术去解释细胞的超微结构变化，很少对这种人为处理过的标本的所得结果提出质疑。而随着原子力显微镜技术在生命科学中的广泛应用，我们终于能够实现实时直观地观察研究不经处理甚至是鲜活组织细胞的超微结构的目的。本实验中，我们成功地得到了膀胱癌组织细胞的AFM图像，可以清晰地辨认出呈梭形的单个膀胱癌细胞，而且直观地发现癌细胞胞膜之间存在直接的物质连接。对常规处理过的标本的成像也获得成功。由此，我们认为应用原子力显微镜技术研究膀胱癌组织细胞的超微结构是切实可行的。
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3.2 两组标本AFM图像的对比 已用常规方法处理过的标本(A组)，虽然经切削剖平后也能在AFM下成像，但组织结构非常凌乱，细胞胞膜凹凸不平，排列不规则，明显已经遭到破坏。三维图像上这种现象更为明显，细胞胞膜似乎伸出许多形状粗重的伪足而与周围组织相连，但我们认为这种伪足并非出自癌细胞本身，可能是组织细胞在固定、脱水或镀膜的过程中被外力牵拉所致。可以看到图像中的细胞外形很不规则，排列也无规律可循，细胞之间的联系不很清楚，因此，经处理的组织细胞的超微形态已发生巨大变化，已经不能反映它们固有的结构基础，由此得出的实验结论值得怀疑。与之相反，未做任何处理的标本(B组)其组织细胞在微结构在AFM下成像清晰，在20μm×20μm的测量范围内能够辨认出呈梭形的单个膀胱癌细胞，其胞核突出，呈多层状结构的胞膜形态完整，胞膜边缘有密集的毛刺样突起，这种结构可能正是癌细胞向附近组织细胞发生浸润的结构基础(见图3)。另外，在50μm×50μm的测量范围内(见图4)我们能够看到排列有序、形状类似、大小基本均等的多个膀胱癌细胞。我们直观地发现各个癌细胞胞膜之间存在有直接的连接，这些连接物质呈丝条状或微管状，几乎融合成片，细胞之间的信息也许正是通过这些确实存在的连接在一刻不停地传递着。
, 百拇医药
3.3 原子力显微镜研究癌细胞的优势和缺陷 原子力显微镜操作简便，对样品处理要求不高，不用包埋、切片，也不用对细胞进行染色，样本可在空气中或液体中直接观察，所以可检测的样品范围很广。但是，正像Hong Xing You [5] 提 出的那样，在AFM检测过程中，探针对细胞的作用力不可避免，细胞形态的变化持续存在，因而对所得图像中赝像的辨识极为重要。但随着AFM技术的发展，一种被称作非接触模式的AFM已经产生，它可以最大程度地减少探针对所测样品的直接接触，从而有效避免细胞变形。另外，在探针表面附着抗体分子去探测样品表面相应的抗原、以及抗原-抗体之间相互作用的技术也已有人在做初步实验，相信，原子力显微镜在医学各学科中的应用将是极有前途的。
4 结论
4.1 运用原子力显微镜技术观察研究膀胱癌组织细胞的超微结构是切实可行的一种实验方法。
4.2 鲜活组织不做任何处理即可进行观察测定，所得图像较处理过的样品更为清晰，反映的图像信息准确可靠，细胞形态能够完整保留，局部的微细结构不受破坏，细胞之间的关系清楚，为进一步深入研究细胞癌变的内在机理奠定了超微形态学基础。
, http://www.100md.com
4.3 随着AFM技术的发展，诸如辨别细胞种类、减少外力损伤、剔除假像伪像等问题将会逐步解决，原子力显微镜在医学科学领域的应用也会更加广泛和深入。
参考文献
1 Binnig G，Rohrer H.Scanning tunnelling microscopy.Helv.Phys Acta，1982，55:726.
2 Binnig G，Quate C，F，Gerber Ch.Atomic force microscope.Phys Rev Lett，1986，59:930-933.
3 黄益民，李稼，刘丹晶，等.原子力显微镜对自由基损伤的红细胞膜表面化精细结构的研究.北京生物医学工程，1999，1:18-23.
4 刘丽丽，王金华，刘安伟.原子力显微镜对APA生物薄膜超微结构的研究.中国生物医学工程学报，1999，1(18):30-34.
5 Hong Xing You，Joan M，Shenwen Zhang，et al.Atomic force microscopy imaging of living cells:a preliminary study of the disruptive elect of the cantilever tip on cell morphology.Ultramicroscopy，2000，82:297-305.
(收稿日期:2003-02-12)(编辑 纪永健), 百拇医药(陈斌)
关键词 原子力显微镜检 膀胱癌 超微结构
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)06-0481-03
Using the AFM to observe and study the ultrastructure
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of the tissue and cells of the human bladder cancer
Chen Bin，Han Li，Bai Jinliang，et al.
The Department of Urology，The First Hospital of Lanzhou Medical College，Lanzhou730000.
【Abstract】 Objective Using the AFM(atomic force microscopy)to observe and study the ultrastructure of the tissue and cells of the human bladder was performed.Methods The fresh tissue and cells of the human bladder cancer from the operation were divided into A and B group in random，whose ultrastructure would beobserved using the AFM.Results The obvious differences were found between thoseimages of the ultrastructure of the A and B group in the same resolving ratio，and this phenomenon was due to the different fixing methods.Conclusion The AFM was a novel method to observe and analyse the ultrastructure of the tissue and cells of the human bladder cancer directly and real-timely.This experimental modelwould play an important role for elucidating the cancerous mechaˉnism of the bladder normal cells at the atomic or nano-meter level.
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Key words atomic force microscopy human bladder cancer ultrastrcuture
1982年，国际商业机器公司苏黎世实验室的Gerd Binˉning和Heinrich Rohrer [1] 共同研制成功了世界第一台新型的表面分析仪器—扫描隧道显微镜(Scanning Tunneling Microˉscope，简称STM)，他们因此而获得1986年诺贝尔物理学奖。1986年，Binning等 [2] 又在扫描隧道显微镜的基础上成功研制出原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，简称AFM)，它是通过应用氮化硅探针扫描样本表面时，由悬臂的起伏反馈测到的探针与样本表面原子间的力场变化，从而描绘出样本表面原子级分辨率的三维图像。AFM不要求样品梯度脱水、染色、临界点干燥、喷涂导体物质，也不必达到真空条件即可实现在纳米级分辨率水平上、常规生理环境中对活细胞表面超微结构的三维成像观察和数据分析 [3] 。它的出现弥补了扫描电镜(SEM)需要样品必须导电的严重不足，克服了样品制备、观测条件限制等多方面的困难，从此开拓了一个研究生命科学的崭新途径。由此，人们对生命的认识开始深入到原子级或纳米级水平上的超微观领域。
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因此，为探讨应用AFM技术研究人膀胱癌组织细胞超微结构的可行性，从而为在原子级或纳米级水平上揭示膀胱上皮组织细胞发生癌变前后的动态变化提供必要的条件，本研究阐述和对比研究了利用AFM实现对人膀胱癌组织细胞超微结构成像观察的实验方法。
1 材料和方法
1.1 新鲜人膀胱癌组织细胞样本的提取 同一膀胱癌患者(术前经尿膀胱镜取活检病理证实)行膀胱部分切除术，打开膀胱后直接钳夹切取膀胱癌组织两块(每块约1cm×1cm大小)。
1.2 一个样本以2.5%的戊二醛固定30min后，用PBS液清洗两遍，空气中干燥后再经PBS清洗两遍，然后依次梯度脱水、临界点干燥、环氧树脂包裹后，切片(厚度1mm)并置于AFM样品台上扫描观察。
1.3 另一样本不做任何处理，待其在室温下自由干燥后，在不超过1h内直接置于AFM样品台上扫描成像。
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1.4 AFM 由清华大学物理系提供。型号:NanoⅢa(Digital Instrument Company，美国)。
1.5 AFM测量方法 [4] 实验中采用接触模式AFM(Contact-mode AFM)，它是通过测量样品表面原子与探针尖表面原子之间的斥力来反馈成像的。探针材料为氮化硅(Si3 N4)，集成于一个弹性系数为0.06N/m的微悬臂梁的末端。针尖形状为金字塔形，针尖曲率半径约为3nm。当探针在样品表面扫描时，样品表面的轮廓变化使探针与样品之间的作用力发生变化，从而造成悬臂梁发生弯曲变形。通过跟踪悬臂梁的弯曲变形即可测出样品表面的轮廓变化。在AFM中采用“光束反射探测”技术测量悬臂的弯曲变形，其原理如图1所示。光电探测器的输出能反映样品表面的轮廓变化，据此即可获得样品表面轮廓的图像。被测样品位于由管状压电陶瓷(PZT)制成的扫描器上，扫描器一方面实现样品在水平方向的扫描运动，另一方面产生样品在垂直方向的运动，从而描绘出样品的三维结构。
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图1 AFM原理示意图(略)
1.6 实测方法的确定 对A组已固定并包裹后的样品切片直接测试时发现，由于切片表面肉眼不能看到的凹凸不平在AFM探针下非常明显，造成探针起伏太大几乎未能成像。因而样品重新切片，并对预测面(即切削面)做适当的磨削处理，光镜观察基本平整后再置于样品台上测试成像。B组新鲜标本直接用解剖刀小心地切取0.5cm×0.5cm大小的一块组织，注意切缘整齐，然后两组待测样品均用双面胶粘贴于样品台上，进行AFM测试。
2 结果
2.1 A组样品不同测量范围的AFM图像 AFM在不同扫描范围下的测量结果。图像的扫描范围越小，对应的放大倍数越大。(a)测量范围为20μm×20μm的超微结构图像(见图2)。(b)测量范围为15μm×15μm的超微结构图像(见图3)。
2.2 B组样品不同测量范围的AFM图像(见图4、图5)。 图2 测量范围为20μm×20μm的超微结构图像 图3 测量范围为15μm×15μm 的超微结构图像
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图4 在20μm×20μm的测量范围内能够辨认出呈梭形的单个膀胱癌细胞(略)
图5 在50μm×50μm的测量范围内能够看到排列有序、形状类似、大小基本均等的多个膀胱癌细胞 (略)
3 讨论
3.1 应用原子力显微镜研究膀胱癌的可行性 以往对膀胱癌细胞超微结构的观察主要依靠扫描电镜和透射电镜技术。众所周知，这两种方法要求对标本做严格而繁琐的处理。在戊二醛固定、脱水、包埋、钴铀电子染色、离子溅射镀膜或其他方法镀膜等过程中，组织细胞不可避免地会遭受不同程度的破坏。然而，时至今日我们仍然不得不使用这些技术去解释细胞的超微结构变化，很少对这种人为处理过的标本的所得结果提出质疑。而随着原子力显微镜技术在生命科学中的广泛应用，我们终于能够实现实时直观地观察研究不经处理甚至是鲜活组织细胞的超微结构的目的。本实验中，我们成功地得到了膀胱癌组织细胞的AFM图像，可以清晰地辨认出呈梭形的单个膀胱癌细胞，而且直观地发现癌细胞胞膜之间存在直接的物质连接。对常规处理过的标本的成像也获得成功。由此，我们认为应用原子力显微镜技术研究膀胱癌组织细胞的超微结构是切实可行的。
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3.2 两组标本AFM图像的对比 已用常规方法处理过的标本(A组)，虽然经切削剖平后也能在AFM下成像，但组织结构非常凌乱，细胞胞膜凹凸不平，排列不规则，明显已经遭到破坏。三维图像上这种现象更为明显，细胞胞膜似乎伸出许多形状粗重的伪足而与周围组织相连，但我们认为这种伪足并非出自癌细胞本身，可能是组织细胞在固定、脱水或镀膜的过程中被外力牵拉所致。可以看到图像中的细胞外形很不规则，排列也无规律可循，细胞之间的联系不很清楚，因此，经处理的组织细胞的超微形态已发生巨大变化，已经不能反映它们固有的结构基础，由此得出的实验结论值得怀疑。与之相反，未做任何处理的标本(B组)其组织细胞在微结构在AFM下成像清晰，在20μm×20μm的测量范围内能够辨认出呈梭形的单个膀胱癌细胞，其胞核突出，呈多层状结构的胞膜形态完整，胞膜边缘有密集的毛刺样突起，这种结构可能正是癌细胞向附近组织细胞发生浸润的结构基础(见图3)。另外，在50μm×50μm的测量范围内(见图4)我们能够看到排列有序、形状类似、大小基本均等的多个膀胱癌细胞。我们直观地发现各个癌细胞胞膜之间存在有直接的连接，这些连接物质呈丝条状或微管状，几乎融合成片，细胞之间的信息也许正是通过这些确实存在的连接在一刻不停地传递着。
, 百拇医药
3.3 原子力显微镜研究癌细胞的优势和缺陷 原子力显微镜操作简便，对样品处理要求不高，不用包埋、切片，也不用对细胞进行染色，样本可在空气中或液体中直接观察，所以可检测的样品范围很广。但是，正像Hong Xing You [5] 提 出的那样，在AFM检测过程中，探针对细胞的作用力不可避免，细胞形态的变化持续存在，因而对所得图像中赝像的辨识极为重要。但随着AFM技术的发展，一种被称作非接触模式的AFM已经产生，它可以最大程度地减少探针对所测样品的直接接触，从而有效避免细胞变形。另外，在探针表面附着抗体分子去探测样品表面相应的抗原、以及抗原-抗体之间相互作用的技术也已有人在做初步实验，相信，原子力显微镜在医学各学科中的应用将是极有前途的。
4 结论
4.1 运用原子力显微镜技术观察研究膀胱癌组织细胞的超微结构是切实可行的一种实验方法。
4.2 鲜活组织不做任何处理即可进行观察测定，所得图像较处理过的样品更为清晰，反映的图像信息准确可靠，细胞形态能够完整保留，局部的微细结构不受破坏，细胞之间的关系清楚，为进一步深入研究细胞癌变的内在机理奠定了超微形态学基础。
, http://www.100md.com
4.3 随着AFM技术的发展，诸如辨别细胞种类、减少外力损伤、剔除假像伪像等问题将会逐步解决，原子力显微镜在医学科学领域的应用也会更加广泛和深入。
参考文献
1 Binnig G，Rohrer H.Scanning tunnelling microscopy.Helv.Phys Acta，1982，55:726.
2 Binnig G，Quate C，F，Gerber Ch.Atomic force microscope.Phys Rev Lett，1986，59:930-933.
3 黄益民，李稼，刘丹晶，等.原子力显微镜对自由基损伤的红细胞膜表面化精细结构的研究.北京生物医学工程，1999，1:18-23.
4 刘丽丽，王金华，刘安伟.原子力显微镜对APA生物薄膜超微结构的研究.中国生物医学工程学报，1999，1(18):30-34.
5 Hong Xing You，Joan M，Shenwen Zhang，et al.Atomic force microscopy imaging of living cells:a preliminary study of the disruptive elect of the cantilever tip on cell morphology.Ultramicroscopy，2000，82:297-305.
(收稿日期:2003-02-12)(编辑 纪永健), 百拇医药(陈斌)