RT-PCR检测肿瘤微转移
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)05-0414-05
转移是恶性肿瘤的一个重要标志，是肿瘤手术后复发、放疗和化疗失败的主要原因，也是肿瘤患者治愈率得不到提高的主要影响因素。许多肿瘤在淋巴结、外周血、骨髓中微转移灶的检出对肿瘤的诊断、分期、复发和预后的判断、手术、综合治疗的选择具有极其明显的指导意义。由于微转移的肿瘤细胞数较少，很多用于检测癌转移的方法，如HE染色、连续切片、免疫组织化学、组织培养等方法很难取得理想的结果。近年兴起的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术具有敏感性高、特异性强 [1，2] ，简单快速的优点，是检测微转移最好的方法。本文就RT-PCR技术检测肿瘤微转移的近况作一综合复习。
1 微转移的概念
自1869年首次在外周血中发现癌细胞以来，肿瘤微转移逐步引起人们重视。人们发现早期大肠癌可有远处转移，借助活体显微电视系统更可直接观测到手术中癌细胞播散，特别是“无淋巴转移”的Dukes B期患者，有近30%5年内死于局部复发或远处转移，提示淋巴系统或全身存在微转移 [3，4] 。所谓微转移是指用常规病理学方法不能检出的非血液系统恶性肿瘤的转移。在不同的组织这一概念又有具体意义，如淋巴结微转移指常规组织学单水平淋巴结切片未能检出的转移;在血液中，常规方法不能检测出瘤细胞，故任何能检出的血循环中的瘤细胞均属微转移;骨髓的微转移则指在骨髓抽吸和活检标本中检出了瘤细胞，而患者无任何临床和放射影像学上远处或骨髓转移的证据者;肝、肺等组织器官中的微转移指常规检查方法如CT，MRI，单抗放射显影技术不能发现的微小肿瘤细胞灶 [4] 。
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2 微转移细胞的特性
微转移的肿瘤细胞常以单个或微小细胞团的形式存在。临床转移一般都由微转移发展而来，而微转移只有少数才能发展为临床转移。微转移发展为临床转移至少经过4步 [3] :(1)微量肿瘤细胞自原发灶脱离;(2)适应新代谢环境，逃避机体免疫;(3)侵袭远处组织;(4)在新组织中新生血管形成，肿瘤生长。发生微转移的瘤细胞大多数在形态和功能上与原发瘤无明显差异，少数只有一定异质性 [5，6] ，如转移的结肠癌细胞，其CD44V6、nm23、p53、p16的表达较原发灶明显增强，肿瘤本身的细胞骨架蛋白和粘附因子等也发生一定的变化。这些相关基因及蛋白表达的变化或不改变对肿瘤微转移检测提供了一定的标志和帮助。
动物实验表明，血循环中至少有10 4 个肿瘤细胞才可出现显性转移 [8] ，多数肿瘤细胞发生凋亡，少数进入休眠状态，极少数发生增殖淋巴结、血循环、骨髓中存在的微转移，提示肿瘤不再局限于原发灶，有发展为远处转移瘤的可能，但微转移灶可长期处于G 0 期或增殖与死亡处于平衡状态。只有当机体遭受种种打击或免疫力下降时，休眠的肿瘤细胞才摆脱抑制状态而持续增殖，并发展为临床显性转移。
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3 PR-PCR检测微转移的临床意义
3.1 精确肿瘤分期、判断预后 准确地评估癌局部区域的播散程度在预后和治疗上都非常重要，通常这种评估是基于局部淋巴结的组织学检查。存在的问题是因取材不当或细胞形态学证据不足而漏掉很小的转移癌灶。肿瘤淋巴结的微转移的检测可改进分期的准确性，有助于判断患者的预后。Kodera等 [7] 用CEA mRNA RT-PCR检测腹腔冲洗液，发现17例细胞学检查阴性而CEA mRNA表达阳性的患者中有5例出现腹膜的播散和转移。Liefers等 [8] 对26例Ⅱ期大肠癌患者进行了分析，发现5年成活率为50%，而其中14例淋巴结CEA mRNA RT-PCR检测阴性的患者成活率都高达91%。Yeh [9] 用CK19mRNA RT-PCR检测了34例晚期胃癌病人的循环细胞，结果7例检测阳性病人的成活率比17例检测阴性的成活率明显降低。Maehara等 [10] 重新检测了死于术后复发的34例原HE染色病理检查示无淋巴结转移的早期胃癌病例，结果3%～6%的淋巴结有微转移灶，经重新分期后，原34例早期胃癌中，3例应属Ⅱ期，4例为Ⅲ期，1例为Ⅳ期，其预后水平亦不同，有微转移的5年生存率明显低于无微转移者(P<
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0.05)，前者50%的生存时间为3.3年，后者为6.6年。
3.2 指导治疗 理论上讲，肝移植是肝细胞癌治疗的最佳选择，因为它既切除了肝细胞癌，又减少了肝硬化的发展，但是移植的结果不尽人意，因有50%～70%的病例在移植肝或远处复发 [10] 。肝移植后的高复发率原因被认为是移植前存在着未测出的微转移灶。或手术操作过程中肿瘤细胞释放入血，因而准确地检出淋巴结或外周血转移病灶，才能及时使肿瘤患者接受综合治疗，提高生存率，降低复发率。
骆成玉等 [11] 用CK20mRNA RT-PCR检测大肠癌外周血癌细胞，结果显示大肠癌病人外周血中具有较高的微转移率(59.3%)，即使是Dukes A期病人，外周血微转移率已高达28.6%，他们认为临床可根据大肠癌患者外周血中癌细胞的检出结果进行针对性化疗，既可避免部分病人因不必要的化疗所带来的毒副作用，又可使一些真正高危病人 得益于化疗，从而有的放矢，特别是对于Dukes A期患者，化疗的针对性尤为重要，并不是A期所有病人都不需化疗，部分病人确需化疗。
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通过对微转移的检测，还可确定疗效。骆成玉等 [12] 对大肠癌术后微转移阳性的患者进行短期化疗，结果一半(45.7%)的病人外周血癌细胞被消除，证明早期短期化疗对部分患者有效。
定量PCR的应用 [13] 可了解微转移瘤细胞的数量，通过数量的变化可以观察辅助治疗的疗效，从而为临床筛选化疗药物及治疗方法提供依据。随着临床资料的积累，微转移的检测将对临床治疗发挥更大的作用。
4 RT-PCR检测的基本程序
4.1 靶RNA的选择 RT-PCR检测肿瘤细胞的基本原理是通过扩增出肿瘤细胞“标志性”靶RNA来证实肿瘤细胞的存在。因此，特异性RNA的选择恰当与否是影响RT-PCR检测结果准确、可靠最关键的因素。作为肿瘤细胞“标志”的靶RNA主要包括两类:(1)肿瘤特异性RNA，即mRNA的表达为某种肿瘤细胞所特有，并且几乎所有的这种肿瘤细胞均有表达，而其他组织细胞不表达，如尤文氏瘤家族所特有的嵌合性EWS/FLI-1mRNA、EWS/ERG mRNA等 [14] ;(2)组织特异性RNA，即为该肿瘤起源组织所特有的mRˉNA，而正常循环血中或骨髓中的细胞不表达这种mRˉNA [15] ，如肝癌细胞的AFR mRNA [16] 等。目前，由于多数实体瘤细胞缺乏肿瘤特异性RNA，因此多采用组织特异性RNA检测这类肿瘤。胃肠癌至今尚未发现肿瘤特异性RNA，检测时也一般选择组织特异性RNA，由于靶RNA在细胞外很不稳定，所以只要组织或体液中能检出特异性RNA，就意味着有肿瘤细胞的存在。CK19mRNA，CK20mRˉNA及CEA mRNA是胃肠癌微转移最常选择的靶RNA [17] ，此外，MMP-7，CD44mRNA也可用于大肠癌的微转移检测 [18，19] ，但CK mRNA能在间皮细胞中表达，故不能检测腹腔内的微转移。
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4.2 引物的设计 引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，它的设计尤为重要。RT-PCR引物的设计，首先应清楚所选择的组织特异性标志物的基因序列，识别出外显子与内含子的连接部位，使设计的引物能跨越外显子的断裂连接区。这使RT-PCR扩增产物的片段长度较基因组DNA扩增的短，因而能很容易地将污染的基因组DNA扩增产物区分开来。有时，为增加检测的敏感性，需设计两对引物进行巢式RT-PCR扩增。
4.3 检测方法 以RNA为模板，联合逆转录反应和PCR，以达到检测单个细胞或少数细胞中的特异RNA。检测的步骤如下:(1)收集待检标本-80℃保存备用，血标本或含红细胞较多的样本先用密度离心法去除 [20] ;(2)以酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法或其他方法提取RNA，-80℃贮存待检;(3)逆转录合成cDNA;(4)以cDNA为模板，用特异的PCR引物扩增靶RNA;将扩增的PCR产物凝胶电泳;(5)用核苷酸测序、限制性酶谱或寡核苷酸探针方法鉴定PCR扩增产物 [21] 。
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5 临床应用研究
5.1 淋巴结微转移的检测 Noguchi等 [22] 根据MUC1(多形上皮粘蛋白的核心蛋白)在乳腺癌中高表达而在非上皮肿瘤少有表达的特性，应用RT-PCR方法对15例乳腺癌的50个淋巴结MUC1mRNA进行检测，其中免疫组化显示转移者MUCI mRNA均为阳性，另有6个淋巴结MUC1mRNA阳性，但免疫组化染色阴性，提示此6个淋巴结中的微转移只能通过RT-PCR检测MUC1mRNA才能发现。Wong等 [23] 对14例行根治术的大肠癌病人区域淋巴结进行CD44mRNA RT-PCR检测，结果9例阳性，其中1例常规组织学检测阴性。Mori等 [24] 用CEA mRNA RT-PCR检测胃肠癌和乳腺癌的117个淋巴结，30个组织学证实有转移者，CEA mRNA均为阳性，87个组织学检测阴性中仍有47个CEA mRNA阳性。
5.2 外周血微转移的检测 Mori等 [25] 采用RT-PCR方法检测55例消化道肿瘤及乳腺癌病人外周血的CEA mRNA，结果对照组阴性，41例行根治术病人中11例(27%)CEA mRNA阳性，认为不仅乳腺癌而且消化道肿瘤是全身性疾病。Komeda等 [26] 采用RT-PCR法检测原发性肝癌(HCC)外周血AFP mRNA，阳性率36%(23/64)，而肝转移癌、良性肝病和正常对照均为阴性。Wong等 [23] 分别对24例大肠癌及3例对照病人的外周血进行CD44V mRNA RT-PCR检测，结果24例大肠癌血标本中4例(16.7%)阳性，而3例对照病人血标本均阴性。
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5.3 骨髓微转移的检测 Gerhard等 [27] 采用CEA mRNA巢式RT-PCR法检测15例腹部恶性肿瘤骨髓微转移，并与免疫组化术作对照，结果显示CEA mRNA巢式RT-PCR较免疫组化法更敏感，CEA mRNA阳性6例，而免疫组化法仅3例。Datta等 [28] 研究表明，CK19mRNA可作为乳腺癌患者骨髓的血中瘤细胞的标志，6例骨髓检测发现5例阳性，作者认为，应用RT-PCR检测乳腺癌患者骨髓及血中CK19mRNA对于判断乳腺癌转移及监测治疗效果可能有重要意义。Mijajma等 [29] 检查了神经母细胞瘤患者骨髓中的TH mRNA的表达，发现12例骨髓存在肿瘤细胞者，其骨髓TH mRNA均为阳性，而26例骨髓中未发现瘤细胞者，TH mRNA也有6例阳性，且TH mRNA阳性率随肿瘤进展而升高。Soeth等 [30] 用CK20mRNA作为靶mRNA，通过RT-PCR检测结肠癌患者中的骨髓微转移，结果显示其阳性率随着肿瘤分期的提高而提高。
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5.4 腹腔微转移的检测 癌细胞脱落到腹腔是腹膜种植移植的主要原因，腹腔冲洗细胞学检测可预测预后，但缺乏敏感性，阴性结果患者仍有腹膜转移。Nakarishi等 [31] 报道了以CEA mRNA RT-PCR法检测消化道肿瘤腹腔内脱落细胞，结果对照组阴性阳性率为31%(15/48)，敏感性显著高于细胞学检查，而阳性率与肿瘤浸润深度有关，阴性病人(33例)随访659天，无腹膜种植，因此通过CEA mRNA的检测可以准确判断腹腔转移。
6 RT-PCR检测微转移的敏感性和特异性
6.1 敏感性 RT-PCR检测肿瘤细胞敏感性高，可以在1ml管血中检出一个上皮来源的肿瘤细胞 [32，33] ;2ml正常血液中检测出一个黑色素细胞 [34] ;能在10 7 淋巴细胞中找出3个黑色素细胞 [35] ，能在10 7 个淋巴细胞中检测到一个MCF-7细胞 [36] ;能在10 7 正常细胞中检测到1个成神经细胞 [37] ，能在10 6 正常外周血单核细胞中检测到1个乳腺癌细胞 [38] 。显然用RT-PCR法具有细胞形态学、免疫组织化学技术不可比拟的敏感性。
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6.2 特异性 RT-PCR的特异性是由于其扩增引物的高 度选择性决定的，但就检测结果而言，其特异性主要由靶RNA所决定。以肿瘤特异性RNA做为肿瘤“标志”，检测结果的特异性强，而以组织特异性RNA作为靶RNA，其特异性在各个肿瘤之间有差异。Kar等 [39] 和Hillaire [40] 研究表明，HCC患者血中白蛋白mRNA是反映肝癌细胞存在的良好指标，其检出率与HCC的临床分期，肿瘤转移和复发有关，但是Matsumura等 [41] 发现白蛋白mRNA在急慢性肝病、健康志愿者血中均能检出，假阳性较高，认为不适合作为检测HCC患者的血中瘤细胞标志。Burchill等 [42] 以细胞角蛋白CK18、19、20作为靶RNA，进行RT-PCR检测，发现CK18、CK19mRNA在正常外周血中均有较高的阳性率，分别为88%、40%，而CK20mRNA正常外周血中为阴性。Gunn等 [43] 对大肠癌病人淋巴结进行CK19和CK20mRNA RT-PCR检测，结果对照组的40枚淋巴结中，34枚CK19阳性，无CK20阳性，作者认为，作为大肠癌淋巴结微转移的标志CK19mRNA缺乏特异性，相反CK20mRNA具有较高特异性，应当作进一步的研究。Gunn等 [43] 还对大肠癌骨髓标本进行CK19、CK20mRNA RT-PCR检测，结果对照组12个骨髓标本中的5个CK19mRNA阳性，但无一对照组标本CK20mRNA阳性。但Aihara等 [44] 用CK19mRNA RT-PCR检测9例胃癌患者的外周血及其中的21例门静脉血时(包括8份Ⅳ期病变血样)，均未发现1例循环癌细胞存在的证据。Bostick等 [45] 分别对大肠癌患者、乳腺癌患者、正常人、良性疾病患者淋巴结进行CEA、CK19、CK20、肿瘤相关抗原733.2(GA733.2)、粘蛋白1(MUC-1)的mRNA RT-PCR检测，发现正常人外周血和淋巴结中只有CK20无表达，其他标志物都有不同程度的假阳性。然而，Bustim等 [45] 则怀疑CK20的特异性，其原因是在正常人，慢性胰腺炎患者、肝腺瘤患者分别出现外周血、骨髓CK20表达阳性。因此，部分组织特异性mRNA能否作为瘤细胞的标志尚需进一步临床研究来证实。
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7 RT-PCR检测的局限性
RT-PCR具有极高的敏感性，但用这一方法检测微转移可能会导致假阳性和假阴性结果。假阳性产生的原因有:(1)靶RNA的非特异性表达，如白细胞中存在的有CEA高度相关的同源基因序列 [46] ;CK19mRNA可在正常组织或细胞中表达 [47] 等。(2)标本采集对上皮细胞的污染。(3)PCR扩增条件的控制不当。(4)非特异性细胞低水平的非法转录。假阴性产生的原因是:(1)提取的总RNA被灭活或污染的RNA酶降解。(2)靶RNA低水平表达，达不到检测的限度要求。(3)血样标本的采集处于癌细胞释放的间歇期。为避免出现假阳性和假阴性，检测中需加设阳性及阴性对照，一般以表达靶RNA的肿瘤细胞株作为阳性对照，而以表达靶RNA的其他肿瘤细胞株或不加入模板RNA作阴性对照。为验证提取的RNA是否完整，需设立内参对照。
8 小结
, http://www.100md.com RT-PCR检测方法尽管有一定局限性，但它是从转录水平上检测组织或细胞中存在的特异靶RNA，与其蛋白的翻译表达无关，检测结果直观，易于判断，避免了常规细胞学检测时带有的主观性，因而优于常规细胞学方法和测定蛋白质的免疫组化方法 [47] 。RT-PCR法是把整个淋巴结或小块组织标本的RNA提取出来，再作PCR扩增，克服了免疫组化只取数个切片的缺点。但是，RT-PCR检测费用昂贵，限制了其广泛的临床研究。再者，许多实验结果相差较大，这可能与技术方法、病例选择不同有关，相信随着长期随访的建立及检测方法的不断改进和特异性靶RNA的发现，肿瘤患者的淋巴结、血液、骨髓及各脏器部位单个肿瘤细胞的微转移的诊断将更为敏感、特异、可靠。肿瘤微转移的确诊，对手术选择术式及清扫范围，确定术前、术后治疗方案，减少肿瘤的转移和复发将起到重要作用，从而带来诊断、治疗的根本变化。
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作者单位:1 010050内蒙古医学院附属医院外科
2 浙江大学医学院附属二院外科
(收稿日期:2003-07-01)
(编辑 何蓓), 百拇医药(孟兴凯)
转移是恶性肿瘤的一个重要标志，是肿瘤手术后复发、放疗和化疗失败的主要原因，也是肿瘤患者治愈率得不到提高的主要影响因素。许多肿瘤在淋巴结、外周血、骨髓中微转移灶的检出对肿瘤的诊断、分期、复发和预后的判断、手术、综合治疗的选择具有极其明显的指导意义。由于微转移的肿瘤细胞数较少，很多用于检测癌转移的方法，如HE染色、连续切片、免疫组织化学、组织培养等方法很难取得理想的结果。近年兴起的逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术具有敏感性高、特异性强 [1，2] ，简单快速的优点，是检测微转移最好的方法。本文就RT-PCR技术检测肿瘤微转移的近况作一综合复习。
1 微转移的概念
自1869年首次在外周血中发现癌细胞以来，肿瘤微转移逐步引起人们重视。人们发现早期大肠癌可有远处转移，借助活体显微电视系统更可直接观测到手术中癌细胞播散，特别是“无淋巴转移”的Dukes B期患者，有近30%5年内死于局部复发或远处转移，提示淋巴系统或全身存在微转移 [3，4] 。所谓微转移是指用常规病理学方法不能检出的非血液系统恶性肿瘤的转移。在不同的组织这一概念又有具体意义，如淋巴结微转移指常规组织学单水平淋巴结切片未能检出的转移;在血液中，常规方法不能检测出瘤细胞，故任何能检出的血循环中的瘤细胞均属微转移;骨髓的微转移则指在骨髓抽吸和活检标本中检出了瘤细胞，而患者无任何临床和放射影像学上远处或骨髓转移的证据者;肝、肺等组织器官中的微转移指常规检查方法如CT，MRI，单抗放射显影技术不能发现的微小肿瘤细胞灶 [4] 。
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2 微转移细胞的特性
微转移的肿瘤细胞常以单个或微小细胞团的形式存在。临床转移一般都由微转移发展而来，而微转移只有少数才能发展为临床转移。微转移发展为临床转移至少经过4步 [3] :(1)微量肿瘤细胞自原发灶脱离;(2)适应新代谢环境，逃避机体免疫;(3)侵袭远处组织;(4)在新组织中新生血管形成，肿瘤生长。发生微转移的瘤细胞大多数在形态和功能上与原发瘤无明显差异，少数只有一定异质性 [5，6] ，如转移的结肠癌细胞，其CD44V6、nm23、p53、p16的表达较原发灶明显增强，肿瘤本身的细胞骨架蛋白和粘附因子等也发生一定的变化。这些相关基因及蛋白表达的变化或不改变对肿瘤微转移检测提供了一定的标志和帮助。
动物实验表明，血循环中至少有10 4 个肿瘤细胞才可出现显性转移 [8] ，多数肿瘤细胞发生凋亡，少数进入休眠状态，极少数发生增殖淋巴结、血循环、骨髓中存在的微转移，提示肿瘤不再局限于原发灶，有发展为远处转移瘤的可能，但微转移灶可长期处于G 0 期或增殖与死亡处于平衡状态。只有当机体遭受种种打击或免疫力下降时，休眠的肿瘤细胞才摆脱抑制状态而持续增殖，并发展为临床显性转移。
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3 PR-PCR检测微转移的临床意义
3.1 精确肿瘤分期、判断预后 准确地评估癌局部区域的播散程度在预后和治疗上都非常重要，通常这种评估是基于局部淋巴结的组织学检查。存在的问题是因取材不当或细胞形态学证据不足而漏掉很小的转移癌灶。肿瘤淋巴结的微转移的检测可改进分期的准确性，有助于判断患者的预后。Kodera等 [7] 用CEA mRNA RT-PCR检测腹腔冲洗液，发现17例细胞学检查阴性而CEA mRNA表达阳性的患者中有5例出现腹膜的播散和转移。Liefers等 [8] 对26例Ⅱ期大肠癌患者进行了分析，发现5年成活率为50%，而其中14例淋巴结CEA mRNA RT-PCR检测阴性的患者成活率都高达91%。Yeh [9] 用CK19mRNA RT-PCR检测了34例晚期胃癌病人的循环细胞，结果7例检测阳性病人的成活率比17例检测阴性的成活率明显降低。Maehara等 [10] 重新检测了死于术后复发的34例原HE染色病理检查示无淋巴结转移的早期胃癌病例，结果3%～6%的淋巴结有微转移灶，经重新分期后，原34例早期胃癌中，3例应属Ⅱ期，4例为Ⅲ期，1例为Ⅳ期，其预后水平亦不同，有微转移的5年生存率明显低于无微转移者(P<
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0.05)，前者50%的生存时间为3.3年，后者为6.6年。
3.2 指导治疗 理论上讲，肝移植是肝细胞癌治疗的最佳选择，因为它既切除了肝细胞癌，又减少了肝硬化的发展，但是移植的结果不尽人意，因有50%～70%的病例在移植肝或远处复发 [10] 。肝移植后的高复发率原因被认为是移植前存在着未测出的微转移灶。或手术操作过程中肿瘤细胞释放入血，因而准确地检出淋巴结或外周血转移病灶，才能及时使肿瘤患者接受综合治疗，提高生存率，降低复发率。
骆成玉等 [11] 用CK20mRNA RT-PCR检测大肠癌外周血癌细胞，结果显示大肠癌病人外周血中具有较高的微转移率(59.3%)，即使是Dukes A期病人，外周血微转移率已高达28.6%，他们认为临床可根据大肠癌患者外周血中癌细胞的检出结果进行针对性化疗，既可避免部分病人因不必要的化疗所带来的毒副作用，又可使一些真正高危病人 得益于化疗，从而有的放矢，特别是对于Dukes A期患者，化疗的针对性尤为重要，并不是A期所有病人都不需化疗，部分病人确需化疗。
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通过对微转移的检测，还可确定疗效。骆成玉等 [12] 对大肠癌术后微转移阳性的患者进行短期化疗，结果一半(45.7%)的病人外周血癌细胞被消除，证明早期短期化疗对部分患者有效。
定量PCR的应用 [13] 可了解微转移瘤细胞的数量，通过数量的变化可以观察辅助治疗的疗效，从而为临床筛选化疗药物及治疗方法提供依据。随着临床资料的积累，微转移的检测将对临床治疗发挥更大的作用。
4 RT-PCR检测的基本程序
4.1 靶RNA的选择 RT-PCR检测肿瘤细胞的基本原理是通过扩增出肿瘤细胞“标志性”靶RNA来证实肿瘤细胞的存在。因此，特异性RNA的选择恰当与否是影响RT-PCR检测结果准确、可靠最关键的因素。作为肿瘤细胞“标志”的靶RNA主要包括两类:(1)肿瘤特异性RNA，即mRNA的表达为某种肿瘤细胞所特有，并且几乎所有的这种肿瘤细胞均有表达，而其他组织细胞不表达，如尤文氏瘤家族所特有的嵌合性EWS/FLI-1mRNA、EWS/ERG mRNA等 [14] ;(2)组织特异性RNA，即为该肿瘤起源组织所特有的mRˉNA，而正常循环血中或骨髓中的细胞不表达这种mRˉNA [15] ，如肝癌细胞的AFR mRNA [16] 等。目前，由于多数实体瘤细胞缺乏肿瘤特异性RNA，因此多采用组织特异性RNA检测这类肿瘤。胃肠癌至今尚未发现肿瘤特异性RNA，检测时也一般选择组织特异性RNA，由于靶RNA在细胞外很不稳定，所以只要组织或体液中能检出特异性RNA，就意味着有肿瘤细胞的存在。CK19mRNA，CK20mRˉNA及CEA mRNA是胃肠癌微转移最常选择的靶RNA [17] ，此外，MMP-7，CD44mRNA也可用于大肠癌的微转移检测 [18，19] ，但CK mRNA能在间皮细胞中表达，故不能检测腹腔内的微转移。
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4.2 引物的设计 引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，它的设计尤为重要。RT-PCR引物的设计，首先应清楚所选择的组织特异性标志物的基因序列，识别出外显子与内含子的连接部位，使设计的引物能跨越外显子的断裂连接区。这使RT-PCR扩增产物的片段长度较基因组DNA扩增的短，因而能很容易地将污染的基因组DNA扩增产物区分开来。有时，为增加检测的敏感性，需设计两对引物进行巢式RT-PCR扩增。
4.3 检测方法 以RNA为模板，联合逆转录反应和PCR，以达到检测单个细胞或少数细胞中的特异RNA。检测的步骤如下:(1)收集待检标本-80℃保存备用，血标本或含红细胞较多的样本先用密度离心法去除 [20] ;(2)以酸性硫氰酸胍-酚-氯仿法或其他方法提取RNA，-80℃贮存待检;(3)逆转录合成cDNA;(4)以cDNA为模板，用特异的PCR引物扩增靶RNA;将扩增的PCR产物凝胶电泳;(5)用核苷酸测序、限制性酶谱或寡核苷酸探针方法鉴定PCR扩增产物 [21] 。
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5 临床应用研究
5.1 淋巴结微转移的检测 Noguchi等 [22] 根据MUC1(多形上皮粘蛋白的核心蛋白)在乳腺癌中高表达而在非上皮肿瘤少有表达的特性，应用RT-PCR方法对15例乳腺癌的50个淋巴结MUC1mRNA进行检测，其中免疫组化显示转移者MUCI mRNA均为阳性，另有6个淋巴结MUC1mRNA阳性，但免疫组化染色阴性，提示此6个淋巴结中的微转移只能通过RT-PCR检测MUC1mRNA才能发现。Wong等 [23] 对14例行根治术的大肠癌病人区域淋巴结进行CD44mRNA RT-PCR检测，结果9例阳性，其中1例常规组织学检测阴性。Mori等 [24] 用CEA mRNA RT-PCR检测胃肠癌和乳腺癌的117个淋巴结，30个组织学证实有转移者，CEA mRNA均为阳性，87个组织学检测阴性中仍有47个CEA mRNA阳性。
5.2 外周血微转移的检测 Mori等 [25] 采用RT-PCR方法检测55例消化道肿瘤及乳腺癌病人外周血的CEA mRNA，结果对照组阴性，41例行根治术病人中11例(27%)CEA mRNA阳性，认为不仅乳腺癌而且消化道肿瘤是全身性疾病。Komeda等 [26] 采用RT-PCR法检测原发性肝癌(HCC)外周血AFP mRNA，阳性率36%(23/64)，而肝转移癌、良性肝病和正常对照均为阴性。Wong等 [23] 分别对24例大肠癌及3例对照病人的外周血进行CD44V mRNA RT-PCR检测，结果24例大肠癌血标本中4例(16.7%)阳性，而3例对照病人血标本均阴性。
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5.3 骨髓微转移的检测 Gerhard等 [27] 采用CEA mRNA巢式RT-PCR法检测15例腹部恶性肿瘤骨髓微转移，并与免疫组化术作对照，结果显示CEA mRNA巢式RT-PCR较免疫组化法更敏感，CEA mRNA阳性6例，而免疫组化法仅3例。Datta等 [28] 研究表明，CK19mRNA可作为乳腺癌患者骨髓的血中瘤细胞的标志，6例骨髓检测发现5例阳性，作者认为，应用RT-PCR检测乳腺癌患者骨髓及血中CK19mRNA对于判断乳腺癌转移及监测治疗效果可能有重要意义。Mijajma等 [29] 检查了神经母细胞瘤患者骨髓中的TH mRNA的表达，发现12例骨髓存在肿瘤细胞者，其骨髓TH mRNA均为阳性，而26例骨髓中未发现瘤细胞者，TH mRNA也有6例阳性，且TH mRNA阳性率随肿瘤进展而升高。Soeth等 [30] 用CK20mRNA作为靶mRNA，通过RT-PCR检测结肠癌患者中的骨髓微转移，结果显示其阳性率随着肿瘤分期的提高而提高。
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5.4 腹腔微转移的检测 癌细胞脱落到腹腔是腹膜种植移植的主要原因，腹腔冲洗细胞学检测可预测预后，但缺乏敏感性，阴性结果患者仍有腹膜转移。Nakarishi等 [31] 报道了以CEA mRNA RT-PCR法检测消化道肿瘤腹腔内脱落细胞，结果对照组阴性阳性率为31%(15/48)，敏感性显著高于细胞学检查，而阳性率与肿瘤浸润深度有关，阴性病人(33例)随访659天，无腹膜种植，因此通过CEA mRNA的检测可以准确判断腹腔转移。
6 RT-PCR检测微转移的敏感性和特异性
6.1 敏感性 RT-PCR检测肿瘤细胞敏感性高，可以在1ml管血中检出一个上皮来源的肿瘤细胞 [32，33] ;2ml正常血液中检测出一个黑色素细胞 [34] ;能在10 7 淋巴细胞中找出3个黑色素细胞 [35] ，能在10 7 个淋巴细胞中检测到一个MCF-7细胞 [36] ;能在10 7 正常细胞中检测到1个成神经细胞 [37] ，能在10 6 正常外周血单核细胞中检测到1个乳腺癌细胞 [38] 。显然用RT-PCR法具有细胞形态学、免疫组织化学技术不可比拟的敏感性。
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6.2 特异性 RT-PCR的特异性是由于其扩增引物的高 度选择性决定的，但就检测结果而言，其特异性主要由靶RNA所决定。以肿瘤特异性RNA做为肿瘤“标志”，检测结果的特异性强，而以组织特异性RNA作为靶RNA，其特异性在各个肿瘤之间有差异。Kar等 [39] 和Hillaire [40] 研究表明，HCC患者血中白蛋白mRNA是反映肝癌细胞存在的良好指标，其检出率与HCC的临床分期，肿瘤转移和复发有关，但是Matsumura等 [41] 发现白蛋白mRNA在急慢性肝病、健康志愿者血中均能检出，假阳性较高，认为不适合作为检测HCC患者的血中瘤细胞标志。Burchill等 [42] 以细胞角蛋白CK18、19、20作为靶RNA，进行RT-PCR检测，发现CK18、CK19mRNA在正常外周血中均有较高的阳性率，分别为88%、40%，而CK20mRNA正常外周血中为阴性。Gunn等 [43] 对大肠癌病人淋巴结进行CK19和CK20mRNA RT-PCR检测，结果对照组的40枚淋巴结中，34枚CK19阳性，无CK20阳性，作者认为，作为大肠癌淋巴结微转移的标志CK19mRNA缺乏特异性，相反CK20mRNA具有较高特异性，应当作进一步的研究。Gunn等 [43] 还对大肠癌骨髓标本进行CK19、CK20mRNA RT-PCR检测，结果对照组12个骨髓标本中的5个CK19mRNA阳性，但无一对照组标本CK20mRNA阳性。但Aihara等 [44] 用CK19mRNA RT-PCR检测9例胃癌患者的外周血及其中的21例门静脉血时(包括8份Ⅳ期病变血样)，均未发现1例循环癌细胞存在的证据。Bostick等 [45] 分别对大肠癌患者、乳腺癌患者、正常人、良性疾病患者淋巴结进行CEA、CK19、CK20、肿瘤相关抗原733.2(GA733.2)、粘蛋白1(MUC-1)的mRNA RT-PCR检测，发现正常人外周血和淋巴结中只有CK20无表达，其他标志物都有不同程度的假阳性。然而，Bustim等 [45] 则怀疑CK20的特异性，其原因是在正常人，慢性胰腺炎患者、肝腺瘤患者分别出现外周血、骨髓CK20表达阳性。因此，部分组织特异性mRNA能否作为瘤细胞的标志尚需进一步临床研究来证实。
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7 RT-PCR检测的局限性
RT-PCR具有极高的敏感性，但用这一方法检测微转移可能会导致假阳性和假阴性结果。假阳性产生的原因有:(1)靶RNA的非特异性表达，如白细胞中存在的有CEA高度相关的同源基因序列 [46] ;CK19mRNA可在正常组织或细胞中表达 [47] 等。(2)标本采集对上皮细胞的污染。(3)PCR扩增条件的控制不当。(4)非特异性细胞低水平的非法转录。假阴性产生的原因是:(1)提取的总RNA被灭活或污染的RNA酶降解。(2)靶RNA低水平表达，达不到检测的限度要求。(3)血样标本的采集处于癌细胞释放的间歇期。为避免出现假阳性和假阴性，检测中需加设阳性及阴性对照，一般以表达靶RNA的肿瘤细胞株作为阳性对照，而以表达靶RNA的其他肿瘤细胞株或不加入模板RNA作阴性对照。为验证提取的RNA是否完整，需设立内参对照。
8 小结
, http://www.100md.com RT-PCR检测方法尽管有一定局限性，但它是从转录水平上检测组织或细胞中存在的特异靶RNA，与其蛋白的翻译表达无关，检测结果直观，易于判断，避免了常规细胞学检测时带有的主观性，因而优于常规细胞学方法和测定蛋白质的免疫组化方法 [47] 。RT-PCR法是把整个淋巴结或小块组织标本的RNA提取出来，再作PCR扩增，克服了免疫组化只取数个切片的缺点。但是，RT-PCR检测费用昂贵，限制了其广泛的临床研究。再者，许多实验结果相差较大，这可能与技术方法、病例选择不同有关，相信随着长期随访的建立及检测方法的不断改进和特异性靶RNA的发现，肿瘤患者的淋巴结、血液、骨髓及各脏器部位单个肿瘤细胞的微转移的诊断将更为敏感、特异、可靠。肿瘤微转移的确诊，对手术选择术式及清扫范围，确定术前、术后治疗方案，减少肿瘤的转移和复发将起到重要作用，从而带来诊断、治疗的根本变化。
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作者单位:1 010050内蒙古医学院附属医院外科
2 浙江大学医学院附属二院外科
(收稿日期:2003-07-01)
(编辑 何蓓), 百拇医药(孟兴凯)