三个遗传性FⅦ缺乏症家系的缺陷机制分析
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中华中西医杂志 2003年4月 第4卷 第8期
【摘要】 目的 探讨三个遗传性FⅦ缺乏症家系成员的缺陷机制。方法 检测PT、APTT、Fg、FⅡ、FV、FⅦ、FⅨ、FⅩ等出凝血指标以明确诊断;检测FⅦ:Ag、FⅦ:C、FⅦ:a以鉴别缺陷类型;用DNA直接测序法对外显子及其侧翼进行分析，寻找基因突变。利用蛋白质分子模型模拟软件对基因突变的生物结构病理学进行分析。结果 所有成员的APTT、Fg、FV:C、FⅦ:C、FⅨ:C、FⅩ:C均位于正常值范围内，患者的PT极度延长;FⅦ:C、FⅦ:Ag、FⅦa均显著下降。家系其它成员的PT延长或正常，FⅦ:C、FⅦ:Ag和FⅦa可降低或正常。FⅦ:C、FⅦ:Ag、FⅦa均成比例改变。在3个家系中发现三种基因突变，分别为双杂合子Trp40Cys/Arg353Gln、双杂合子His348Gln/Thr359Met、纯合子Thr359Met。结论 3个遗传性FⅦ缺乏症患者均为CRM - 型，分别为Trp40Cys/Arg353Gln、His348Gln/Thr359Met双杂合及Thr359Met纯合突变，后两者通过影响蛋白质分子的空间构型，从而使FⅦ蛋白分泌异常。
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关键词 遗传性FⅦ缺乏症 基因突变 分子模型
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)08-1121-05
Molecular genetic analysis for three pedigrees of
the inherited coagulation factor VII deficiency
Qu Bin，Chu Haiyan，Wang Hongli，et al
Shanghai Institute of Haematology，Ruijin Hospital，Shanghai Second Medical University，Shanghai200025.
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【Abstract】 Objective To investigate the molecular mechanism of three inherited coagulation factorsⅦ(FⅦ)deficiency pedigrees.Methods The diagnosis was validate by coagulant and haemostatic parameters.FⅦgene mutaˉtions were screened in the propositus and their family members by DNA direct sequencing，analysed the pathology of the biological structure using the protein molecular model to the mutation FⅦ.Results APTT，Fg，FV:C，FⅦ:C，FIX:C，FX:C were in normal range，the PT were much long and FⅦ:C，FⅦ:Ag，FⅦa were reduced in probands.The change of FⅦ:C，FⅦ:Ag，FⅦwere in aproportion.The three kinds of double heterozygous of Trp40Cys/Arg353Gln and His348Gln/Thr359Met and homozygous Thr359Met were identified.Conclusion The double hetˉerozygous Trp40Cys/Arg353Gln and His348Gln/Thr359Met and homozygous Thr359Met mutations in factorⅦgene were identified in three probands with CRM - .The FⅦproteins were abnormal to secrete due to the changing of the space structures of the proteins.
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Key words hereditary coagulation factorⅦdeficiency gene mutation molecular model
凝血因子Ⅶ(coagulation factorⅦ，FⅦ)是血液凝固的起始因子，它的缺陷将造成血液循环系统的一系列失衡，引起多种临床症状 [1] 。遗传性FⅦ缺乏症为一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病，其临床表现为异常出血。为了解FⅦ缺陷症患者基因突变情况，我们对3个无关的FⅦ缺乏症家系共20名成员进行了血浆表型和分子缺陷的初步探讨。
1 资料与方法
1.1 研究对象 家系A来自江苏，先证者是一中年女性，有自发出血史，其父母为近亲结婚，共调查了4代共14个成员，家系其它成员无出血症状;家系B来自浙江，先证者为15岁男性(BⅡ-1)，因轻微外伤导致巨大血肿，经久不消而入院治疗，偶有自发出血症状，其母(BⅠ-1)无出血症状;家系C来自上海，共两代4人，先证者为68岁男性(CⅠ-1)，因手术后渗血不止而发现，其配偶(CⅠ-2)、儿子(CⅡ-1)及女儿(CⅡ-2)均无出血症状。
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1.2 血标本的采集、处理和DNA制备 外周静脉采血，注入预置1/10体积0.129mol/L枸橼酸钠抗凝剂的塑料试管中，于4℃2，000g离心15min分离乏血小板血浆，分装后-80℃保存;用淋巴细胞分离液从全血中分离白细胞，按常规方法 [2] 抽提DNA，-80℃保存待用。
1.3 血浆凝血功能的检测 PT、APTT、Fg、FⅡ:C、FV:C、FⅦ:C、FIX:C、FX:C检测采用一期法，在Stago自动血凝仪上进行;FⅦa及FⅦ:Ag为美国ADI公司试剂盒，FⅦ:Ag检测采用抗FⅦ的单抗夹心法，在FⅦa的检测中采用无活化功能的可溶性组织因子(STF2-219)作为FⅦ的辅因子，以避免FⅦ的非体内活化。
1.4 引物设计 共设计了9对引物以覆盖FⅦ基因的外显子全部区域及外显子/内含子侧翼部分(见表1)。引物合成在391DNA合成仪(Applied Biosystems，USA)上进行。
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1.5 PCR扩增50μl的PCR反应体系包括 1×PCR缓冲液，1.5mM MgCl 2 ，0.2mM dNTP，0.2μM5′端和3′端PCR引物，500ng DNA模板，2U Taq DNA聚合酶(PCR反应试剂均为Takara公司产品)。PCR反应在DNA热循环仪(Perkin-ElmerGetus，USA)上进行，反应条件见表1。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳鉴定。
1.6 PCR产物的纯化和测序分析 PCR产物进行割胶纯化以制备测序模板(MO Bio Labs.Ins试剂盒)，采用双脱氧链终止法在ABI377测序仪上进行测序，用GCG分析进行序列分析，测序结果应用Autoassembler软件与正常序列的比较。
1.7 限制性内切酶分析 取纯化的PCR产物10μl，加入MspI或NspI5U，10×缓冲液2μl，100×BSA0.2μl，加水补足至20μl，37℃水浴酶切2h，2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。
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1.8 等位基因特异的PCR反应 [3] 等位基因特异的PCR反应(ASPCR)可用于分析不能被限制性内切酶识别的基因改变。为了鉴定C11514T是否存在于家系B的其它成员 中，设计出针对突变体11514T的特异性引物(5′GGGCACGTGGTACCTGAT3′)，让突变碱基T位于引物的3′末端。同时合成同样位置的正常序列引物11514C(5′GGGCACGTGGTACCTGAC3′)。用其分别和表1所述8b下游引物配合进行PCR反应，反应体系和反应条件均与前述PCR反应相似。
1.9 蛋白质空间构型计算机模拟分析 采用Swiss-Pdb-Viewer软件对11514C→T(Thr359Met)突变的生物结构病理学进行变异蛋白质三维结构的模拟，并与正常FⅦ蛋白相比较，推测基因突变影响蛋白质功能的可能机制。
表1 引物序列及PCR反应条件(略)
2 结果
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2.1 血浆表型的检测 被检的所有成员的APTT、Fg、FⅡ:C、FV:C、FⅧ:C、FIX:C、FX:C、FXI:C位于正常值范围内。与正常人相比，三个患者的PT均延长;FⅦ:C降低，家系A先证者的FⅦ:Ag、FⅦa均显著下降。家系其它成员的PT延长或正常，FⅦ:C降低或正常。
2.2 测序检测患者及其家庭成员的FⅦ基因突变 以美国NCBI基因库(gene bank)所公布的GI180333和J02933序列为标准，通过对FⅦ外显子及侧翼的测序发现:先证者AⅢ-2在外显子8中11514C→T导致氨基酸359位Thr(ACG)被Met(ATG)替换，为突变纯合子;先证者的祖母AⅠ-1、外祖母AⅠ-2、母亲AⅡ-2、父亲AⅡ-3、叔叔AⅡ-1、阿姨AⅡ-4、大舅舅AⅡ-5及儿子AⅣ-1均为11514C→T突变杂合子;家系的其他成员均为正常野生性型基因(图1)。
在家系B的先证者BⅡ-1的FⅦ基因的外显子3中发现了碱基6390位有杂合子T→G的置换(图2c)，它导致氨基酸40位Phe(TTC)被Cys(TGC)替换;在外显子8的11496位为杂合子G→A(图2b)，相应的氨基酸353位有Arg转换为Gln。先证者母亲BⅠ-1的FⅦ基因中，也发现了外显子8的为杂合子G→A导致的Arg353Gln。
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在家系C的先证者CⅠ-1中发现了外显子8中11482T→G导致氨基酸348位His(CAT)被Gln(CAG)替换、11514C→T导致氨基酸359位Thr(ACG)被Met(ATG)替换(图2)。在其儿子CⅡ-1的FⅦ基因中发现了杂合子基因改变Met359Thr，在其女儿CⅡ-2的FⅦ基因中发现了杂合子基因改变His348Gln。
对149例正常对照的基因进行测序检测，发现在359位均为Thr(ACG)，同样发现正常人在氨基酸348位均为His(CAT)，在氨基酸40均为Phe(TTC);而11496位G→A导致的杂合子Arg353Gln在149例正常人中发现13例;在BⅡ-1的FⅦ基因中发现3个内含子部分的基因改变出现在所有的正常中国人中。
2.3 等位基因特异的PCR反应 用等位基因特异性引物C11514和8b下游引物配对在正常人和家系C四个成员的模板中均扩增出232bp的片段，用针对突变体的特异性引物11514T和8b下游引物在先证者CⅠ-1和其儿子CⅡ-1中扩增出232bp的片段，但在正常人、先证者配偶CⅠ-2、先证者女儿CⅡ-2中未扩增出产物(图3)。说明先证者和其儿子为C11514T突变杂合子，其配偶和女儿在11514位为正常基因型。
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2.4 NspI酶切分析鉴定11482T→G 先利用引物8b扩增外显子8第2部分498bp片段，正常序列可被NspI切成65、185、248bp三个片段;当11482T→G时，此处的NspI酶切位点消失，纯合子突变基因可被切成185和313bp两段;若患者为杂合子，则包含一条正常的等位基因和一条突变基因，498bp的片段可被切成65、185、248和313bp四种片段。利用这一特征鉴定分析了C家系4个成员的基因，发现先证者和其女儿的PCR产物均可被切成65、185、248和313bp四种片段，而其配偶和儿子只出现了正常基因呈现的64、185、248bp三个片段。说明患者及其女儿均为11482T→G杂合子，先证者的配偶和儿子均正常(图4)。
2.5 MspI酶切分析鉴定11496G→A 结果判断与上述NspI酶切分析类似，发现家系B母子俩均可被切为代表杂合子的片段类型。
图1 11514C→T导致家系A中Thr359Met的测序结果图(略)
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图2 发现基因突变的2个家系的部分测序图(略)
图3 ASPCR鉴定C家系11514C→T基因改变的结果 (略)
图4 NspI酶切分析家系C中T11482G的电泳结果(略)
2.6 基因突变对蛋白质功能影响的推测 分子模型结果发现，Thr359Met导致活性中心催化三元体附近的空间构型改变，可能影响了FⅦ的活性;蛋白质空间构型的改变还使本来处于分子内部的疏水区转移到分子表面，可能会影响FⅦ蛋白从细胞内的分泌;同时它还可能影响了FⅦ与TF的结合。
3 讨论
凝血因子Ⅶ是血液凝固的启动因子，其基因改变将影响FⅦ结构和功能，从而导致FⅦ缺陷症 [4] 。令众人感到奇怪的是:FⅦ缺乏症的临床出血程度和FⅦ的凝血活性并不相关，这使得对于FⅦ结构与功能关系的研究显得尤为必要。而天然存在于遗传性FⅧ缺陷症患者体内的缺陷型FⅦ基因对于研究FⅦ的精细功能无疑提供了极佳的模型 [5] 。
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国外已有几家中心对FⅦ的分子缺陷进行了研究 [6～11] ，发现了70种FⅦ的基因改变，70%为错义突变;多为突变纯合子或存在两个杂合子突变，也有少数为单一杂合子突变。
我们在家系A中发现了发生在外显子8中的单碱基置换11514C→T，导致纯合子Thr359Met。基因型和FⅦ表型的检测结果发现，先证者为Thr359Met突变纯合子，其FⅦ:C约为2%，FⅦ:Ag为12.2ng/ml，FⅦa为0.55ng/ml，与正常人相比均很低。因为此突变发生在催化区域，故FⅦ活性 和抗原性均极度下降，Thr359Met导致的FⅦ缺陷为CRM - 型缺陷。家系中凡是突变杂合子的个体，其FⅦ:Ag和FⅦa均在50%左右，而无此突变的家系成员的所有检测指标均正常，说明家系成员FⅦ功能的下降是由于Thr359Met突变造成。先证者的父母为表兄妹，均为杂合子Thr359Met，故先证者的两条突变基因分别来源于其近亲结婚的父母，充分显示了近亲结婚的危害性。
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在家系的B先证者中发现了3种基因改变:内含子7中11044G→A、外显子3中6390T→G导致Phe40Cys、外显子8中11496G→A导致Arg353Gln;在其母FⅦ内发现11044G→A和11496G→A两种基因突变，先证者的这两种突变可能来源于母亲。先证者的FⅦ:C为1%，有中度出血，而其母亲的FⅦ:C为44%，无出血症状。故外显子3中Phe40Cys可能是导致FⅦ缺乏症的重要原因，其机制尚有待于进一步研究。据文献报道，Arg353Gln具有多态性，在西方人群中的发生频率约为3%。根据我实验室对149例无出凝血疾病的正常对照的基因进行测序检测，发现11496位G→A导致的杂合子Arg353Gln在149例正常人中有13例，进一步证实Arg353Gln是一种多态性，而不是突变。但353Gln可能抑制FⅦ蛋白从细胞内分泌 [4] ，Arg/Gln基因型个体的FⅦ:C约为Arg/Arg的75% [5] ，这就解释了先证者母亲FⅦ:C下降的原因。同时FⅦ缺乏症患者若同时为353Gln个体，其临床出血症状可能会更严重。正如先证者是Phe40Cys杂合子，FⅦ:C却仅为1%，可能与其353位为Arg/Gln有关。
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在家系C中发现外显子8中两个单碱基被置换，即11482T→G和11514C→A，分别导致His348Gln和Thr359Met。Thr359Met可能导致FⅦ蛋白内部的疏水区翻转至表面，疏水区与GRP78/BiP的结合导致FⅦ蛋白不转移到高尔基体，因此抑制了变异蛋白在细胞中的正常分泌 [6，7] 。His348Gln可能也是由于分泌受抑而导致FⅦ水平下降 [8] 。在此家系中，先证者本人有His348Gln、Thr359Met两个位点的杂合子突变，他分别将His348Gln遗传给女儿、将Thr359Met遗传给儿子，说明这两种突变分别位于先证者的两条染色体上。先证者的两个子女FⅦ:C分别为58.3%和53.8%，而先证者的FⅦ:C仅为3.4%，可以推测:His348Gln和Thr359Met这两个杂合子突变对FⅦ的功能分别造成影响，但单一杂合子尚不至于造成临床出血倾向;在先证者基因中，它们分别位于不同的染色体上，导致两条FⅦ基因均存在缺陷，从而造成了严重的FⅦ活性下降。
通过对149例无出凝血疾病的正常对照的基因进行测序检测，均不存在Thr359Met、Phe40Cys、His348Gln3种突变，说明其均不是多态性，而是三种突变。
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对于上述几种基因突变导致FⅦ功能异常的详细机制，尚需要我们进一步进行研究探讨。
参考文献
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2 Smbrook J，Fritsch EF，Manicatis F.金冬雁，黎孟枫，译.分子克隆实验指南.北京:北京科技出版社，1996，332-333.
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10 Mariani G，Lo CL，Bernardi F，et al.Molecular and clinical aspects of factorⅦdeficiency.Blood Coagul Fibrinolysis，1998，9(suppl1):83-88.
11 Kario K，Miyata T，Sakata T，et al.Fluorogenic assay of activated factorⅦ.PlasmaⅦa levels in relation to arterial cardiovascular diseases in Japanese.Arteriscler Thromb，1994，14:265-274.
基金项目:本课题受上海血液学研究所胡应洲基金部分资助
作者单位:200025上海第二医科大学附属瑞金医院检验科
(编辑 于少伟), 百拇医药(璩斌 储海燕 王鸿利 王学锋 郭雪梅 康文英 段宝华 尹俊)
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关键词 遗传性FⅦ缺乏症 基因突变 分子模型
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)08-1121-05
Molecular genetic analysis for three pedigrees of
the inherited coagulation factor VII deficiency
Qu Bin，Chu Haiyan，Wang Hongli，et al
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【Abstract】 Objective To investigate the molecular mechanism of three inherited coagulation factorsⅦ(FⅦ)deficiency pedigrees.Methods The diagnosis was validate by coagulant and haemostatic parameters.FⅦgene mutaˉtions were screened in the propositus and their family members by DNA direct sequencing，analysed the pathology of the biological structure using the protein molecular model to the mutation FⅦ.Results APTT，Fg，FV:C，FⅦ:C，FIX:C，FX:C were in normal range，the PT were much long and FⅦ:C，FⅦ:Ag，FⅦa were reduced in probands.The change of FⅦ:C，FⅦ:Ag，FⅦwere in aproportion.The three kinds of double heterozygous of Trp40Cys/Arg353Gln and His348Gln/Thr359Met and homozygous Thr359Met were identified.Conclusion The double hetˉerozygous Trp40Cys/Arg353Gln and His348Gln/Thr359Met and homozygous Thr359Met mutations in factorⅦgene were identified in three probands with CRM - .The FⅦproteins were abnormal to secrete due to the changing of the space structures of the proteins.
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凝血因子Ⅶ(coagulation factorⅦ，FⅦ)是血液凝固的起始因子，它的缺陷将造成血液循环系统的一系列失衡，引起多种临床症状 [1] 。遗传性FⅦ缺乏症为一种罕见的常染色体隐性遗传性疾病，其临床表现为异常出血。为了解FⅦ缺陷症患者基因突变情况，我们对3个无关的FⅦ缺乏症家系共20名成员进行了血浆表型和分子缺陷的初步探讨。
1 资料与方法
1.1 研究对象 家系A来自江苏，先证者是一中年女性，有自发出血史，其父母为近亲结婚，共调查了4代共14个成员，家系其它成员无出血症状;家系B来自浙江，先证者为15岁男性(BⅡ-1)，因轻微外伤导致巨大血肿，经久不消而入院治疗，偶有自发出血症状，其母(BⅠ-1)无出血症状;家系C来自上海，共两代4人，先证者为68岁男性(CⅠ-1)，因手术后渗血不止而发现，其配偶(CⅠ-2)、儿子(CⅡ-1)及女儿(CⅡ-2)均无出血症状。
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1.2 血标本的采集、处理和DNA制备 外周静脉采血，注入预置1/10体积0.129mol/L枸橼酸钠抗凝剂的塑料试管中，于4℃2，000g离心15min分离乏血小板血浆，分装后-80℃保存;用淋巴细胞分离液从全血中分离白细胞，按常规方法 [2] 抽提DNA，-80℃保存待用。
1.3 血浆凝血功能的检测 PT、APTT、Fg、FⅡ:C、FV:C、FⅦ:C、FIX:C、FX:C检测采用一期法，在Stago自动血凝仪上进行;FⅦa及FⅦ:Ag为美国ADI公司试剂盒，FⅦ:Ag检测采用抗FⅦ的单抗夹心法，在FⅦa的检测中采用无活化功能的可溶性组织因子(STF2-219)作为FⅦ的辅因子，以避免FⅦ的非体内活化。
1.4 引物设计 共设计了9对引物以覆盖FⅦ基因的外显子全部区域及外显子/内含子侧翼部分(见表1)。引物合成在391DNA合成仪(Applied Biosystems，USA)上进行。
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1.5 PCR扩增50μl的PCR反应体系包括 1×PCR缓冲液，1.5mM MgCl 2 ，0.2mM dNTP，0.2μM5′端和3′端PCR引物，500ng DNA模板，2U Taq DNA聚合酶(PCR反应试剂均为Takara公司产品)。PCR反应在DNA热循环仪(Perkin-ElmerGetus，USA)上进行，反应条件见表1。PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳鉴定。
1.6 PCR产物的纯化和测序分析 PCR产物进行割胶纯化以制备测序模板(MO Bio Labs.Ins试剂盒)，采用双脱氧链终止法在ABI377测序仪上进行测序，用GCG分析进行序列分析，测序结果应用Autoassembler软件与正常序列的比较。
1.7 限制性内切酶分析 取纯化的PCR产物10μl，加入MspI或NspI5U，10×缓冲液2μl，100×BSA0.2μl，加水补足至20μl，37℃水浴酶切2h，2%琼脂糖凝胶电泳分析结果。
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1.8 等位基因特异的PCR反应 [3] 等位基因特异的PCR反应(ASPCR)可用于分析不能被限制性内切酶识别的基因改变。为了鉴定C11514T是否存在于家系B的其它成员 中，设计出针对突变体11514T的特异性引物(5′GGGCACGTGGTACCTGAT3′)，让突变碱基T位于引物的3′末端。同时合成同样位置的正常序列引物11514C(5′GGGCACGTGGTACCTGAC3′)。用其分别和表1所述8b下游引物配合进行PCR反应，反应体系和反应条件均与前述PCR反应相似。
1.9 蛋白质空间构型计算机模拟分析 采用Swiss-Pdb-Viewer软件对11514C→T(Thr359Met)突变的生物结构病理学进行变异蛋白质三维结构的模拟，并与正常FⅦ蛋白相比较，推测基因突变影响蛋白质功能的可能机制。
表1 引物序列及PCR反应条件(略)
2 结果
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2.1 血浆表型的检测 被检的所有成员的APTT、Fg、FⅡ:C、FV:C、FⅧ:C、FIX:C、FX:C、FXI:C位于正常值范围内。与正常人相比，三个患者的PT均延长;FⅦ:C降低，家系A先证者的FⅦ:Ag、FⅦa均显著下降。家系其它成员的PT延长或正常，FⅦ:C降低或正常。
2.2 测序检测患者及其家庭成员的FⅦ基因突变 以美国NCBI基因库(gene bank)所公布的GI180333和J02933序列为标准，通过对FⅦ外显子及侧翼的测序发现:先证者AⅢ-2在外显子8中11514C→T导致氨基酸359位Thr(ACG)被Met(ATG)替换，为突变纯合子;先证者的祖母AⅠ-1、外祖母AⅠ-2、母亲AⅡ-2、父亲AⅡ-3、叔叔AⅡ-1、阿姨AⅡ-4、大舅舅AⅡ-5及儿子AⅣ-1均为11514C→T突变杂合子;家系的其他成员均为正常野生性型基因(图1)。
在家系B的先证者BⅡ-1的FⅦ基因的外显子3中发现了碱基6390位有杂合子T→G的置换(图2c)，它导致氨基酸40位Phe(TTC)被Cys(TGC)替换;在外显子8的11496位为杂合子G→A(图2b)，相应的氨基酸353位有Arg转换为Gln。先证者母亲BⅠ-1的FⅦ基因中，也发现了外显子8的为杂合子G→A导致的Arg353Gln。
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在家系C的先证者CⅠ-1中发现了外显子8中11482T→G导致氨基酸348位His(CAT)被Gln(CAG)替换、11514C→T导致氨基酸359位Thr(ACG)被Met(ATG)替换(图2)。在其儿子CⅡ-1的FⅦ基因中发现了杂合子基因改变Met359Thr，在其女儿CⅡ-2的FⅦ基因中发现了杂合子基因改变His348Gln。
对149例正常对照的基因进行测序检测，发现在359位均为Thr(ACG)，同样发现正常人在氨基酸348位均为His(CAT)，在氨基酸40均为Phe(TTC);而11496位G→A导致的杂合子Arg353Gln在149例正常人中发现13例;在BⅡ-1的FⅦ基因中发现3个内含子部分的基因改变出现在所有的正常中国人中。
2.3 等位基因特异的PCR反应 用等位基因特异性引物C11514和8b下游引物配对在正常人和家系C四个成员的模板中均扩增出232bp的片段，用针对突变体的特异性引物11514T和8b下游引物在先证者CⅠ-1和其儿子CⅡ-1中扩增出232bp的片段，但在正常人、先证者配偶CⅠ-2、先证者女儿CⅡ-2中未扩增出产物(图3)。说明先证者和其儿子为C11514T突变杂合子，其配偶和女儿在11514位为正常基因型。
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2.4 NspI酶切分析鉴定11482T→G 先利用引物8b扩增外显子8第2部分498bp片段，正常序列可被NspI切成65、185、248bp三个片段;当11482T→G时，此处的NspI酶切位点消失，纯合子突变基因可被切成185和313bp两段;若患者为杂合子，则包含一条正常的等位基因和一条突变基因，498bp的片段可被切成65、185、248和313bp四种片段。利用这一特征鉴定分析了C家系4个成员的基因，发现先证者和其女儿的PCR产物均可被切成65、185、248和313bp四种片段，而其配偶和儿子只出现了正常基因呈现的64、185、248bp三个片段。说明患者及其女儿均为11482T→G杂合子，先证者的配偶和儿子均正常(图4)。
2.5 MspI酶切分析鉴定11496G→A 结果判断与上述NspI酶切分析类似，发现家系B母子俩均可被切为代表杂合子的片段类型。
图1 11514C→T导致家系A中Thr359Met的测序结果图(略)
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图2 发现基因突变的2个家系的部分测序图(略)
图3 ASPCR鉴定C家系11514C→T基因改变的结果 (略)
图4 NspI酶切分析家系C中T11482G的电泳结果(略)
2.6 基因突变对蛋白质功能影响的推测 分子模型结果发现，Thr359Met导致活性中心催化三元体附近的空间构型改变，可能影响了FⅦ的活性;蛋白质空间构型的改变还使本来处于分子内部的疏水区转移到分子表面，可能会影响FⅦ蛋白从细胞内的分泌;同时它还可能影响了FⅦ与TF的结合。
3 讨论
凝血因子Ⅶ是血液凝固的启动因子，其基因改变将影响FⅦ结构和功能，从而导致FⅦ缺陷症 [4] 。令众人感到奇怪的是:FⅦ缺乏症的临床出血程度和FⅦ的凝血活性并不相关，这使得对于FⅦ结构与功能关系的研究显得尤为必要。而天然存在于遗传性FⅧ缺陷症患者体内的缺陷型FⅦ基因对于研究FⅦ的精细功能无疑提供了极佳的模型 [5] 。
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国外已有几家中心对FⅦ的分子缺陷进行了研究 [6～11] ，发现了70种FⅦ的基因改变，70%为错义突变;多为突变纯合子或存在两个杂合子突变，也有少数为单一杂合子突变。
我们在家系A中发现了发生在外显子8中的单碱基置换11514C→T，导致纯合子Thr359Met。基因型和FⅦ表型的检测结果发现，先证者为Thr359Met突变纯合子，其FⅦ:C约为2%，FⅦ:Ag为12.2ng/ml，FⅦa为0.55ng/ml，与正常人相比均很低。因为此突变发生在催化区域，故FⅦ活性 和抗原性均极度下降，Thr359Met导致的FⅦ缺陷为CRM - 型缺陷。家系中凡是突变杂合子的个体，其FⅦ:Ag和FⅦa均在50%左右，而无此突变的家系成员的所有检测指标均正常，说明家系成员FⅦ功能的下降是由于Thr359Met突变造成。先证者的父母为表兄妹，均为杂合子Thr359Met，故先证者的两条突变基因分别来源于其近亲结婚的父母，充分显示了近亲结婚的危害性。
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在家系的B先证者中发现了3种基因改变:内含子7中11044G→A、外显子3中6390T→G导致Phe40Cys、外显子8中11496G→A导致Arg353Gln;在其母FⅦ内发现11044G→A和11496G→A两种基因突变，先证者的这两种突变可能来源于母亲。先证者的FⅦ:C为1%，有中度出血，而其母亲的FⅦ:C为44%，无出血症状。故外显子3中Phe40Cys可能是导致FⅦ缺乏症的重要原因，其机制尚有待于进一步研究。据文献报道，Arg353Gln具有多态性，在西方人群中的发生频率约为3%。根据我实验室对149例无出凝血疾病的正常对照的基因进行测序检测，发现11496位G→A导致的杂合子Arg353Gln在149例正常人中有13例，进一步证实Arg353Gln是一种多态性，而不是突变。但353Gln可能抑制FⅦ蛋白从细胞内分泌 [4] ，Arg/Gln基因型个体的FⅦ:C约为Arg/Arg的75% [5] ，这就解释了先证者母亲FⅦ:C下降的原因。同时FⅦ缺乏症患者若同时为353Gln个体，其临床出血症状可能会更严重。正如先证者是Phe40Cys杂合子，FⅦ:C却仅为1%，可能与其353位为Arg/Gln有关。
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在家系C中发现外显子8中两个单碱基被置换，即11482T→G和11514C→A，分别导致His348Gln和Thr359Met。Thr359Met可能导致FⅦ蛋白内部的疏水区翻转至表面，疏水区与GRP78/BiP的结合导致FⅦ蛋白不转移到高尔基体，因此抑制了变异蛋白在细胞中的正常分泌 [6，7] 。His348Gln可能也是由于分泌受抑而导致FⅦ水平下降 [8] 。在此家系中，先证者本人有His348Gln、Thr359Met两个位点的杂合子突变，他分别将His348Gln遗传给女儿、将Thr359Met遗传给儿子，说明这两种突变分别位于先证者的两条染色体上。先证者的两个子女FⅦ:C分别为58.3%和53.8%，而先证者的FⅦ:C仅为3.4%，可以推测:His348Gln和Thr359Met这两个杂合子突变对FⅦ的功能分别造成影响，但单一杂合子尚不至于造成临床出血倾向;在先证者基因中，它们分别位于不同的染色体上，导致两条FⅦ基因均存在缺陷，从而造成了严重的FⅦ活性下降。
通过对149例无出凝血疾病的正常对照的基因进行测序检测，均不存在Thr359Met、Phe40Cys、His348Gln3种突变，说明其均不是多态性，而是三种突变。
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对于上述几种基因突变导致FⅦ功能异常的详细机制，尚需要我们进一步进行研究探讨。
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基金项目:本课题受上海血液学研究所胡应洲基金部分资助
作者单位:200025上海第二医科大学附属瑞金医院检验科
(编辑 于少伟), 百拇医药(璩斌 储海燕 王鸿利 王学锋 郭雪梅 康文英 段宝华 尹俊)