不同浓度细辛提取物体外免疫抑制作用的实验研究
【摘要】 目的 提取中药细辛的有效成份细辛脂素，探讨其抗心脏移植急性排斥反应的作用。方法 提取中药细辛的有效成份细辛脂素，分离成年Wistar大鼠的心肌细胞(2×106 /ml)和SD大鼠的脾细胞(1×10 7 /ml)，前者做刺激细胞，后者做反应细胞，于96孔板进行混合细胞培养，建立大鼠心脏移植后急性排斥反应体外模型，加入不同浓度含细辛脂素大鼠血清，108h后MTT法测定脾细胞的增殖程度。结果 含细辛脂素的动物血清可在体外抑制脾细胞的增殖，抑制率可达60%。结论 中药细辛提取物细辛脂素具有免疫抑制作用，可抑制心脏移植急性排斥反应。
关键词 细辛 心脏移植 急性排斥反应
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)04-0481-02
An experimental study on the different density extract of Herba Asari in immunosuppression activity in vitro
, 百拇医药
Department of Cardiology，Second Affiliated of Harbin Medical University，Harbin150086.
【Abstract】 Objective To test the extract of Herba Asari in model of acute rejection of cardiac transplantation of rats in vitro.Methods Cardiomyocytes of adult wistar rats and spleen cells of adult SD rats were separated，and0.1ml the cardiomyocytes(2×10 6 /ml)as stimulate cell and0.1ml spleen cells(1×10 7 /ml)as responsed cells were cultured in96culture plate.The model of acute rejection of cardiac transplantation of rats in vitro was set up.Different density of the exract of Herba Asari was given to culture plate，then the inhibition rate of lymphocyte transformation was investigated with MTT after108hour.Results The extract of Herba Asari can inhibit the lymphocyte transformaˉtion(inhibition rate60%)in vitro.Conclusion The extract of Herba Asari has immunosuppression effect and can inˉhibit acute rejection in heart transplantation.
, 百拇医药
Key words Herba Asari heart transplantation acute rejection
心脏移植是治疗终末期心脏病的有效方法，而现有的免疫抑制剂具有较强的毒副作用并且价格昂贵，所以国内外众多学者把研究开发新型免疫抑制剂的重点转向了资源丰富、价格低廉的中草药。细辛是一种比较常用的中药，具有免疫抑制作用，但目前其抗排斥作用还鲜有报道，如果能证明其具有抗排斥反应的作用则有重要的理论意义和实际意义。
1 材料与方法
1.1 中药提取 提取中药细辛中的细辛脂素并进行药物成份鉴定。
1.2 含药血清的制备
1.2.1 实验分组 Wistar大鼠24只(哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心)，体重200～300g。随机分为3组，A组灌服中药细辛提取物10mg·kg -1 ·d -1 ;B组灌服中药25mg·kg -1 ·d -1 ;C组50mg·kg -1 ·d -1 。重复给药7天。
, 百拇医药
1.2.2 制备血清 第7次给药前(0h)及给药后(0.5，1，2，4h)采血无菌分离血清。将A、B、C三组各8只大鼠相同时间点(0，0.5，1，2，4h)的含药血清分别混匀，56℃，30min，于-40℃保存备用。
1.3 大鼠心脏移植急性排斥反应体外模型的建立及应用1.3.1 实验动物 供体大鼠:雄性Wistar系大鼠，体重200～250g。受体大鼠:雄性SD大鼠，体重250～300g。由哈医大二院实验动物中心提供。
1.3.2 主要试剂 胶原酶、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、DMEM培养液、平衡盐溶液等，以上试剂均由美国Sigma公司提供。
1.3.3 模型建立 采用灌流法分离成年Wistar大鼠的心肌细胞(2×10 6 )，胶原酶Ⅱ消化;SD大鼠的脾细胞(1×10 7 )，前者做刺激细胞，后者做反应细胞，各0.1ml分别加入96孔板进行混合细胞培养，建立大鼠心脏移植后急性排斥反应体外模型。
, 百拇医药
1.3.4 模型应用 (1)分别加入A、B、C组各个时间点含药血清0.1ml;培养108h后离心取上清MTT比色法检测脾细胞增殖程度。
2 结果
与给药前相比给药后各个时间点的含药血清均对脾细胞增殖产生抑制作用，见表1;3组都是给药后1h含药血清对脾细胞增殖的抑制率较高，见图1。
表1 脾细胞增殖程度比较 (表略)
图1 三种浓度含药血清对脾细胞增殖抑制率比较多于(图略)
3 讨论
Ansari在1991年世界心脏移植年会上报道，应用成人心肌细胞与同种异体的单个核细胞共同培养后出现明显的增殖反应，并分化、产生细胞毒T细胞(CTL)，破坏心肌细胞，故认为这种体外模型是研究抗原识别，淋巴细胞致敏的分子生物学基础和研究心脏移植后急性排异反应的调控及机制的较好模型，同年Suitters也报道了应用人心肌细胞与同种异体外周血单个核细胞共同培养，表现出明显的淋巴细胞增殖现象，并观察到心肌细胞由杆状变为圆形的破 坏现象，因此认为这是研究急性排异反应对心肌细胞破坏机制的较好模型。本实验与其相似，采用SD大鼠脾细胞作为反应细胞，脾脏可分离出大量的单个核细胞，分离纯化的Wistar大鼠单个心肌细胞作为刺激细胞，两者共同孵育，由于二者主要组织相容性抗原(MHC)不一致，心肌细胞表面的MHC抗原刺激异体淋巴细胞增殖、分化，产生CTL和效应T淋巴细胞，表现为对心肌细胞的杀伤和淋巴细胞的大量增殖，模拟了体内急性排异反应过程，可供较多药效的研究使用，尤其是大规模从中草药中筛选免疫抑制剂的研究中有较广阔的应用前景。
, 百拇医药
血清药理学问世至今已有十余年的历史，在中药及复方的体外药理实验中得到了越来越多的应用。由于中药复方成分复杂，直接用于体外药理实验时，它的杂质成分、各种电解质或鞣质成分以及本身的酸碱度都影响体外细胞的生存环境，造成一些假阴性或假阳性结果出现。本实验将中药制剂口服给动物取其血清进行体外实验，比较接近药物体内环境中产生药理效应的真实过程，其原有成分或在体内转化为活性成分或代谢后失活，或本身无作用但经代谢后产生作用，或通过第二信使而间接起作用都可通过血清药理学反映出来，理论上更具备科学性、真实性。不同剂量的细辛提取物细辛脂素给大鼠灌胃后在不同的时间点采血分离血清进行实验能较系统地反映药物的作用效果，结果证明含药血清能明显抑制脾细胞的增殖反应，各组脾细胞增殖程度较给药前均有明显差别(P<0.01)，而且表明在给药后1h采血所获得的血清作用效果较好。
为了更好地研究细辛脂素的给药剂量问题，实验中设计了三种不同的较大剂量，以使其在血清中含有足够的药物浓度，结果证明，25mg/kg和50mg/kg的给药剂量作用效果相同(P>0.05)，所以在药物达到一定剂量后再增加剂量不能增加血清中药物浓度。因此本实验初步证明了中药细辛提取物细辛脂素有抗心脏移植排斥反应的作用，也说明该药具有广阔的开发前景。
, 百拇医药
参考文献
1 章育正，余上才，赵慧娟，等.苍耳子和细辛的免疫抑制作用.上海免疫学杂志，1993，13(6):334-336.
2 杨云，冯卫生.中药化学成分提取分离手册.北京:中国中医药出版社，1998，189-192.
3 许秀芳，李温斌，陈宝田，等.成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察.首都医科大学学报，2000，21(2):104-107.
4 马绪娴，刘乐欣，夏穗生.供移植用同种脾细胞活力的检测方法.中华器官移植杂志，1990，11(4):146-147.
5 Ansari A A，Suitters A J.Indirect presentation of donor MHC antigens contributes to the allogeneic response to cardiac tissue post transplantaˉtion.J Hesrt Lung Trans，1991，10(1):72.
6 Sutters A J，Ansari A A.Use of isolated human cardiocytes as a model of damages to transplanted heart during rejection.J Heart Lung Trans，1991，10(1):172. (编辑 于少伟), 百拇医药(张丽丽)
关键词 细辛 心脏移植 急性排斥反应
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)04-0481-02
An experimental study on the different density extract of Herba Asari in immunosuppression activity in vitro
, 百拇医药
Department of Cardiology，Second Affiliated of Harbin Medical University，Harbin150086.
【Abstract】 Objective To test the extract of Herba Asari in model of acute rejection of cardiac transplantation of rats in vitro.Methods Cardiomyocytes of adult wistar rats and spleen cells of adult SD rats were separated，and0.1ml the cardiomyocytes(2×10 6 /ml)as stimulate cell and0.1ml spleen cells(1×10 7 /ml)as responsed cells were cultured in96culture plate.The model of acute rejection of cardiac transplantation of rats in vitro was set up.Different density of the exract of Herba Asari was given to culture plate，then the inhibition rate of lymphocyte transformation was investigated with MTT after108hour.Results The extract of Herba Asari can inhibit the lymphocyte transformaˉtion(inhibition rate60%)in vitro.Conclusion The extract of Herba Asari has immunosuppression effect and can inˉhibit acute rejection in heart transplantation.
, 百拇医药
Key words Herba Asari heart transplantation acute rejection
心脏移植是治疗终末期心脏病的有效方法，而现有的免疫抑制剂具有较强的毒副作用并且价格昂贵，所以国内外众多学者把研究开发新型免疫抑制剂的重点转向了资源丰富、价格低廉的中草药。细辛是一种比较常用的中药，具有免疫抑制作用，但目前其抗排斥作用还鲜有报道，如果能证明其具有抗排斥反应的作用则有重要的理论意义和实际意义。
1 材料与方法
1.1 中药提取 提取中药细辛中的细辛脂素并进行药物成份鉴定。
1.2 含药血清的制备
1.2.1 实验分组 Wistar大鼠24只(哈尔滨医科大学附属第二医院实验动物中心)，体重200～300g。随机分为3组，A组灌服中药细辛提取物10mg·kg -1 ·d -1 ;B组灌服中药25mg·kg -1 ·d -1 ;C组50mg·kg -1 ·d -1 。重复给药7天。
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1.2.2 制备血清 第7次给药前(0h)及给药后(0.5，1，2，4h)采血无菌分离血清。将A、B、C三组各8只大鼠相同时间点(0，0.5，1，2，4h)的含药血清分别混匀，56℃，30min，于-40℃保存备用。
1.3 大鼠心脏移植急性排斥反应体外模型的建立及应用1.3.1 实验动物 供体大鼠:雄性Wistar系大鼠，体重200～250g。受体大鼠:雄性SD大鼠，体重250～300g。由哈医大二院实验动物中心提供。
1.3.2 主要试剂 胶原酶、胰蛋白酶、牛血清白蛋白、DMEM培养液、平衡盐溶液等，以上试剂均由美国Sigma公司提供。
1.3.3 模型建立 采用灌流法分离成年Wistar大鼠的心肌细胞(2×10 6 )，胶原酶Ⅱ消化;SD大鼠的脾细胞(1×10 7 )，前者做刺激细胞，后者做反应细胞，各0.1ml分别加入96孔板进行混合细胞培养，建立大鼠心脏移植后急性排斥反应体外模型。
, 百拇医药
1.3.4 模型应用 (1)分别加入A、B、C组各个时间点含药血清0.1ml;培养108h后离心取上清MTT比色法检测脾细胞增殖程度。
2 结果
与给药前相比给药后各个时间点的含药血清均对脾细胞增殖产生抑制作用，见表1;3组都是给药后1h含药血清对脾细胞增殖的抑制率较高，见图1。
表1 脾细胞增殖程度比较 (表略)
图1 三种浓度含药血清对脾细胞增殖抑制率比较多于(图略)
3 讨论
Ansari在1991年世界心脏移植年会上报道，应用成人心肌细胞与同种异体的单个核细胞共同培养后出现明显的增殖反应，并分化、产生细胞毒T细胞(CTL)，破坏心肌细胞，故认为这种体外模型是研究抗原识别，淋巴细胞致敏的分子生物学基础和研究心脏移植后急性排异反应的调控及机制的较好模型，同年Suitters也报道了应用人心肌细胞与同种异体外周血单个核细胞共同培养，表现出明显的淋巴细胞增殖现象，并观察到心肌细胞由杆状变为圆形的破 坏现象，因此认为这是研究急性排异反应对心肌细胞破坏机制的较好模型。本实验与其相似，采用SD大鼠脾细胞作为反应细胞，脾脏可分离出大量的单个核细胞，分离纯化的Wistar大鼠单个心肌细胞作为刺激细胞，两者共同孵育，由于二者主要组织相容性抗原(MHC)不一致，心肌细胞表面的MHC抗原刺激异体淋巴细胞增殖、分化，产生CTL和效应T淋巴细胞，表现为对心肌细胞的杀伤和淋巴细胞的大量增殖，模拟了体内急性排异反应过程，可供较多药效的研究使用，尤其是大规模从中草药中筛选免疫抑制剂的研究中有较广阔的应用前景。
, 百拇医药
血清药理学问世至今已有十余年的历史，在中药及复方的体外药理实验中得到了越来越多的应用。由于中药复方成分复杂，直接用于体外药理实验时，它的杂质成分、各种电解质或鞣质成分以及本身的酸碱度都影响体外细胞的生存环境，造成一些假阴性或假阳性结果出现。本实验将中药制剂口服给动物取其血清进行体外实验，比较接近药物体内环境中产生药理效应的真实过程，其原有成分或在体内转化为活性成分或代谢后失活，或本身无作用但经代谢后产生作用，或通过第二信使而间接起作用都可通过血清药理学反映出来，理论上更具备科学性、真实性。不同剂量的细辛提取物细辛脂素给大鼠灌胃后在不同的时间点采血分离血清进行实验能较系统地反映药物的作用效果，结果证明含药血清能明显抑制脾细胞的增殖反应，各组脾细胞增殖程度较给药前均有明显差别(P<0.01)，而且表明在给药后1h采血所获得的血清作用效果较好。
为了更好地研究细辛脂素的给药剂量问题，实验中设计了三种不同的较大剂量，以使其在血清中含有足够的药物浓度，结果证明，25mg/kg和50mg/kg的给药剂量作用效果相同(P>0.05)，所以在药物达到一定剂量后再增加剂量不能增加血清中药物浓度。因此本实验初步证明了中药细辛提取物细辛脂素有抗心脏移植排斥反应的作用，也说明该药具有广阔的开发前景。
, 百拇医药
参考文献
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2 杨云，冯卫生.中药化学成分提取分离手册.北京:中国中医药出版社，1998，189-192.
3 许秀芳，李温斌，陈宝田，等.成年大鼠心肌细胞培养方法的建立和形态学观察.首都医科大学学报，2000，21(2):104-107.
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5 Ansari A A，Suitters A J.Indirect presentation of donor MHC antigens contributes to the allogeneic response to cardiac tissue post transplantaˉtion.J Hesrt Lung Trans，1991，10(1):72.
6 Sutters A J，Ansari A A.Use of isolated human cardiocytes as a model of damages to transplanted heart during rejection.J Heart Lung Trans，1991，10(1):172. (编辑 于少伟), 百拇医药(张丽丽)