胃癌、癌旁组织中p73基因表达及杂合缺失研究
http://www.100md.com
中华中西医杂志 2003年4月 第4卷 第8期
【摘要】 目的 探讨p73基因转录表达及杂合缺失与胃癌发生、发展的关系。方法 采用反转录多聚酶链反应技术(RT-PCR)及多聚酶链反应单链长度多态性分析法，检测45例胃癌、癌旁及正常组织中p73mRNA的表达及杂合缺失。结果 正常胃粘膜组织中未见p73mRNA表达。癌旁肠化组织，异型增生及胃癌组织p73mRNA高表达率分别为38.5%(10/26)，20%(2/10)，55.6%(20/36)，杂合缺失率分别为14.8%(4/27)，11.1%(2/18)，26.7%(12/45)。胃癌、癌旁肠化生组织中p73mRNA表达显著高于正常组织(P<0.05)。而胃癌及癌旁肠化及异型增生间无显著差别。胃癌及癌旁组织中杂合缺失率无显著差别。p73mRNA高表达及杂合缺失与肿瘤组织学类型、分化程度、大小、部位、年龄及性别无关(P>0.05)。p73基因高表达与杂合缺失无关。结论 p73基因高表达及杂合缺失可能参与了胃癌的发生发展过程，p73基因高表达及基因的杂合缺失可能是该基因的两种不同失活方式。
关键词 p73 胃癌 基因表达 杂合缺失
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)08-1132-03
The study on the expression and loss of heterozygosity of
p73gene in human gastric cancer and paracarcinoma lesions
Li Wei，Wang Dongxu，Wang Jianwen，et al.
Department of Gastroenterology，PLA254Hospital，Tianjin300142.
【Abstract】 Objective To explore the relationship between the mRNA overexpression and loss of heterozygosiˉty(LOH)of p73gene and development or progress of human gastric cancer.Methods The mRNA expression and LOH of p73gene were detected in human gastric cancer tissues(GC)and matched paracarcinoma lesions(PL)by semiquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)and polymerase chain reaction-single strand length polymorphism(PCR-SSLP).Results None of p73mRNA expression was found in normal gastric muˉcosa，expression of p73gene was detected in10/26(38.5%)cases of intestinal metaplasia(IM)of PL
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and 2/10(20%)cases of dysplasia(Dys)of PL and20/36(55.6%)cases of GC.LOH at p73gene was observed in4/27(14.8%)cases of IM of PL and 2/18(11.1%)cases of Dys and12/45(26.7%)of GC respectively.The frequency of overexpression of p73in IM and GC was significantly higher than that in normal gastric mucosa(P<0.05，P<0.05)，but there was not significant difference between GC and IM and Dys(P>0.05).The rate of LOH at p73gene was not significant difference between GC and PL.Overexpression and LOH of p73gene were not correlated to histoˉlogical type，differentiation degree，tumor size，location，age and sex(P>0.05).Overexpressi on was not correlated to LOH of p73gene.Conclusion Overexpression and LOH of p73gene may contribute to oncogenesis and development of GC.Overexpression and LOH of p73gene may be two different type of inactive manner of this gene.
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Key words p73 stomach neoplasm gene expression loss of heterozygosity
p53基因是人类肿瘤中发生变异频率最高的抑癌基因，在多种肿瘤的生物学行为中具有重要的作用 [1～6] 。p73基因 [1～4] 是近来发现的p53基因家族中新成员，其产物与p53蛋白具有非常相似的结构和功能，被认为是一个候选的抑癌基因。目前p73基因异常与胃癌发生发展的关系的研究正成为国外研究的新热点。本研究应用反转录多聚酶链反应技术(reverse transcriptase polymerase chain reaction)及单链长度多态性分析技术(SSLP)对胃癌、癌旁、正常组织标本中p73mRNA表达水平及p73基因杂合缺失(LOH)进行了分析，以探讨p73基因异常改变与胃癌发生、发展的关系。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 对象 收集1999年10月～2000年6月天津二五四医院和西南医院胃镜活检取材45例，均未经过放疗和化疗。每例包括原发癌肿，癌旁1cm粘膜和远离癌肿10cm以上的正常胃粘膜。经病理学检查证实肿瘤组织中癌细胞占80%以上，癌旁及正常组织无癌细胞。标本放入-80℃冰箱待检。
1.2 引物 参照国外文献 [4，5] 合成2对引物分别用于p73基因mRNA表达及LOH的分析。分析表达的引物扩增其第1～3外显子，扩增片段166bp，引物序列:5′-CGG GAC GGA CGC CGA TG-3′，5′-GAA GGT CGA AGT AGG TGC TGT CTG G-3′。内参照GAPDH引物序列为:5′-CCA CCC ATG GCA AAT TCC ATG GCA-3′;5′-TCT AGA CGG CAG GTC AGGTCC AC-3′，扩增片段598bp。LOH引物扩增其第9内含子微卫星位点，引物序列:5′-CCT CTT CCT CCC CTA CCA AC-3′，5′-TAG GCG ACA GAG CAA GAC G3′。扩增产物片段为110bp。引物均由上海生物工程技术公司合成。
, 百拇医药
1.3 组织RNA及DNA的提取 采用Tripure试剂盒抽提RNA。采用酚-氯仿常规抽提DNA。用紫外分光光度计定量，计算检测RNA及DNA的纯度和浓度。
1.4 RT-PCR及PCR-SSLP分析 应用promega RT-PCR试剂盒检测p73mRNA表达，按以下参数在PCR仪(GE公司2400型)上进行。反应体系25μl，5×buffer5μl、Mg 2+ 1mmol/L、dNTP0.2mmol/L、AMV2.5U、Taq酶2.5U、引物0.4μmol/L、RNA1μl。逆转录48℃45min、94℃2min。PCR条件为94℃30s、55℃40s、68℃1min，35个循环。68℃延伸7min。5μl PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳(含0.5μg/L溴化乙锭)紫外灯下观察结果，照相。以PCR-Marker(复华公司)为标准，在166bp位置出现条带为p73表达阳性。PCR-SSLP反应体系10μl，10×buffer1μl、Mg 2+ 1.5mmol/L、dNTP2mmol/L、Taq7.5U、DNA0.6μl、引物0.3μmol/L、α-P 32 1微居里。PCR反应条件94℃1min，94℃40s、56℃30s、72℃1min，35个循环。72℃延伸10min。取PCR产物5μl95℃变性8min。经19∶1丙烯酰胺凝胶电泳，45W3h。-80℃冰箱24～48h放射自显影，判断杂合缺失。
, 百拇医药
1.5 结果判断 参照GAPDH扩增情况，比较正常、癌旁与癌的差别，判断mRNA表达结果。比较胃癌、癌旁组织放射自显影微卫星电泳条带与正常组织差别，判断杂合缺失。
1.6 统计学处理 采用χ 2 检验，当P<0.05时认为差异有显著性。
2 结果
2.1 正常、癌旁及胃癌组织中p73mRNA表达及杂合缺失 见表1、图1、图2。
表1 正常、癌旁及胃癌组织中p73mRNA表达及杂合缺失 (略)
2.2 p73mRNA高表达及杂合缺失与临床病理参数的关系 根据肿瘤组织学类型、分化程度、大小、部位、年龄及性别进行分组(见表2)，各组间p73mRNA高表达及杂合缺失差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
2.3 p73mRNA表达与杂合缺失的关系 20例p73mRNA高表达的胃癌标本中共检出杂合缺失4例，占20%(4/20)。16例p73mRNA阴性表达标本中检出杂合缺失4例，占25%(4/16)。经配对技术资料χ 2 检验p73mRNA高表达与杂合缺失无显著相关性(P>0.05)。12例p73mRNA高表达癌旁组织中检出标本中共检出杂合缺失2例，占16.7%(2/12)，24例p73mRNA阴性表达标本中检出杂合缺失3例，占12.5%(3/24)，经配对技术资料χ 2 检验p73mRNA高 表达与杂合缺失无显著相关性(P>0.05)。
表2 p73mRNA表达及杂合缺失与临床病理参数关系 (略)
图1 肠化生及胃癌组织中p73基因mRNA高表达(RT-PCR法)(略)
图2 癌旁肠化生及癌组织中p73基因杂合缺失(PCR-SSLP法)(略)
, 百拇医药
3 讨论
p73基因是近年来发现的新的肿瘤相关基因，定位于1p36.33，此区域是神经母细胞瘤、黑色素瘤等癌肿中的染色体片段缺失热点区，且其基因、蛋白结构及功能与p53具有相似性，被认为是p53基因家族新成员，是一个候选抑癌基因 [1～5] 。
目前，p73在一些肿瘤转录表达已有报道 [1～4，7，8] ，本研究发现，胃癌、癌旁组织中p73基因既存在着mRNA表达升高也存在着杂合缺失现象，超过1/4胃癌中及少数癌旁组织中存在p73基因微卫星位点的杂合缺失，半数以上的胃癌及1/3癌旁组织中呈现p73基因异常高表达状态，提示p73基因可能以多种变异方式参与了胃癌的发生与发展。分析p73基因异常及杂合缺失与临床病理参数的关系发现不同年龄、性别、部位其变异频率并无显著差别，其改变与组织学类型、分化程度及肿瘤大小无关，提示p73基因改变可能是随机分布，并无选择性，可能是胃癌的热点基因变化。胃肠两型胃癌中p73基因的改变并无显著差别，提示p73基因可能以多种方式参与了两型胃癌的发生发展。其第9内含子杂合缺失既存在于p73基因高表达胃癌及癌旁 组织中，也存在于p73基因未表达的胃癌及癌旁组织中，且两种改变无显著相关性，提示mRNA的高表达与杂合缺失是p73基因两个独立的异常改变方式。
, 百拇医药
国外一些学者也发现在肺癌、肝癌、以及胃癌中 [3，7，8] p73mRNA或蛋白呈现高表达，并且未发现突变，Mai [3] 等发现在肺癌中p73基因沉默的等位基因被激活表达，Kang等研究发现胃癌癌旁正常粘膜p73为单等位基因表达，而癌组织为双基因表达。提示转录激活静寂基因可能是p73高表达原因，本研究在癌旁组织尤其是癌肠化生组织中发现了p73基因的高表达改变，进一步提示p73基因以高表达形式参与了胃癌发生，p73基因可能参与胃癌尤其是肠型胃癌发生的基因靶点，是胃癌发生过程中的始动基因改变而不是如Kang等 [8] 认为的是继发基因变化。
p73基因的高表达改变显然与经典的抑癌基因失活致癌理论相矛盾，因此有研究者对p73基因是否为抑癌基因提出疑问 [3，8] 。本研究同时发现在癌旁及胃癌组织中存在该基因的杂合缺失改变，这为p73基因的研究又提供了新的线索。这或许提示该基因可能不是传统意义上的抑癌基因，而是以独特的基因改变方式参与了细胞突变的新的抑癌基因。有关p73是不是一种抑癌基因、p73在肿瘤中为什么很少突变、它的活化调节机制以及与p53的关系等都有待进一步研究。
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参考文献
1 Corn PG，Kuerbitz SJ，Noesel MM，et al.Transcriptional silencing of the p73gene in acute lymphoblastic leukemia and Burkitt’s lymphoma is asˉsociated with5’CpG island methylation.Cancer Res，1999，59(14):3352-3356.
2 Schwab M，Praml C，Amler LC.Genomic instability in1p and human malignancies.Genes Chromosomes&Cancer，1996，16(4):211-229.
3 Mai M，Yokomizo A，Qian C，et al.Activation of p73silent allele in lung cancer.Cancer Res，1998，58(11):2347-2349.
, 百拇医药
4 Takahashi H，Ichimiya S，Yoshinori Nimura，et al.Mutation，allelotypˉing，and transcription analyses of the p73gene in prostatic carcinoma.Cancer Res，1998，58(10):2076-2077.
5 王东旭，房殿春，刘为纹.胃粘膜肠上皮化生癌变的分子机制研究.重庆医学，1998，27(6):428-429.
6 王东旭，房殿春，罗元辉，等.胃癌组织中增殖细胞核抗原、及p53、K-ras及bcl-2蛋白的表达.解放军医学杂志，1998，23(3):172-174.
7 Tannapfel A，Wasner M，Krause K，et al.Expression of p73and its relaˉtionto histopathology and prognosis in hepatocelluar carcinoma.J.of the National Cancer Institute，1999，91(13):1154-1158.
8 KangMJ，Park J，Byun DS，et al.Loss of imprinting and elevated expresˉsion of wild-type p73in human gastric adenocarcinoma.Clin Cancer Res，2000，6(5):1767-1771.
作者单位:1300142天津解放军第254医院消化科 2400038重庆西南医院消化科
(编辑 于少伟), http://www.100md.com(李伟 王东旭 王建文 房殿春)
关键词 p73 胃癌 基因表达 杂合缺失
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【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)08-1132-03
The study on the expression and loss of heterozygosity of
p73gene in human gastric cancer and paracarcinoma lesions
Li Wei，Wang Dongxu，Wang Jianwen，et al.
Department of Gastroenterology，PLA254Hospital，Tianjin300142.
【Abstract】 Objective To explore the relationship between the mRNA overexpression and loss of heterozygosiˉty(LOH)of p73gene and development or progress of human gastric cancer.Methods The mRNA expression and LOH of p73gene were detected in human gastric cancer tissues(GC)and matched paracarcinoma lesions(PL)by semiquantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction(RT-PCR)and polymerase chain reaction-single strand length polymorphism(PCR-SSLP).Results None of p73mRNA expression was found in normal gastric muˉcosa，expression of p73gene was detected in10/26(38.5%)cases of intestinal metaplasia(IM)of PL
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and 2/10(20%)cases of dysplasia(Dys)of PL and20/36(55.6%)cases of GC.LOH at p73gene was observed in4/27(14.8%)cases of IM of PL and 2/18(11.1%)cases of Dys and12/45(26.7%)of GC respectively.The frequency of overexpression of p73in IM and GC was significantly higher than that in normal gastric mucosa(P<0.05，P<0.05)，but there was not significant difference between GC and IM and Dys(P>0.05).The rate of LOH at p73gene was not significant difference between GC and PL.Overexpression and LOH of p73gene were not correlated to histoˉlogical type，differentiation degree，tumor size，location，age and sex(P>0.05).Overexpressi on was not correlated to LOH of p73gene.Conclusion Overexpression and LOH of p73gene may contribute to oncogenesis and development of GC.Overexpression and LOH of p73gene may be two different type of inactive manner of this gene.
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Key words p73 stomach neoplasm gene expression loss of heterozygosity
p53基因是人类肿瘤中发生变异频率最高的抑癌基因，在多种肿瘤的生物学行为中具有重要的作用 [1～6] 。p73基因 [1～4] 是近来发现的p53基因家族中新成员，其产物与p53蛋白具有非常相似的结构和功能，被认为是一个候选的抑癌基因。目前p73基因异常与胃癌发生发展的关系的研究正成为国外研究的新热点。本研究应用反转录多聚酶链反应技术(reverse transcriptase polymerase chain reaction)及单链长度多态性分析技术(SSLP)对胃癌、癌旁、正常组织标本中p73mRNA表达水平及p73基因杂合缺失(LOH)进行了分析，以探讨p73基因异常改变与胃癌发生、发展的关系。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 对象 收集1999年10月～2000年6月天津二五四医院和西南医院胃镜活检取材45例，均未经过放疗和化疗。每例包括原发癌肿，癌旁1cm粘膜和远离癌肿10cm以上的正常胃粘膜。经病理学检查证实肿瘤组织中癌细胞占80%以上，癌旁及正常组织无癌细胞。标本放入-80℃冰箱待检。
1.2 引物 参照国外文献 [4，5] 合成2对引物分别用于p73基因mRNA表达及LOH的分析。分析表达的引物扩增其第1～3外显子，扩增片段166bp，引物序列:5′-CGG GAC GGA CGC CGA TG-3′，5′-GAA GGT CGA AGT AGG TGC TGT CTG G-3′。内参照GAPDH引物序列为:5′-CCA CCC ATG GCA AAT TCC ATG GCA-3′;5′-TCT AGA CGG CAG GTC AGGTCC AC-3′，扩增片段598bp。LOH引物扩增其第9内含子微卫星位点，引物序列:5′-CCT CTT CCT CCC CTA CCA AC-3′，5′-TAG GCG ACA GAG CAA GAC G3′。扩增产物片段为110bp。引物均由上海生物工程技术公司合成。
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1.3 组织RNA及DNA的提取 采用Tripure试剂盒抽提RNA。采用酚-氯仿常规抽提DNA。用紫外分光光度计定量，计算检测RNA及DNA的纯度和浓度。
1.4 RT-PCR及PCR-SSLP分析 应用promega RT-PCR试剂盒检测p73mRNA表达，按以下参数在PCR仪(GE公司2400型)上进行。反应体系25μl，5×buffer5μl、Mg 2+ 1mmol/L、dNTP0.2mmol/L、AMV2.5U、Taq酶2.5U、引物0.4μmol/L、RNA1μl。逆转录48℃45min、94℃2min。PCR条件为94℃30s、55℃40s、68℃1min，35个循环。68℃延伸7min。5μl PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳(含0.5μg/L溴化乙锭)紫外灯下观察结果，照相。以PCR-Marker(复华公司)为标准，在166bp位置出现条带为p73表达阳性。PCR-SSLP反应体系10μl，10×buffer1μl、Mg 2+ 1.5mmol/L、dNTP2mmol/L、Taq7.5U、DNA0.6μl、引物0.3μmol/L、α-P 32 1微居里。PCR反应条件94℃1min，94℃40s、56℃30s、72℃1min，35个循环。72℃延伸10min。取PCR产物5μl95℃变性8min。经19∶1丙烯酰胺凝胶电泳，45W3h。-80℃冰箱24～48h放射自显影，判断杂合缺失。
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1.5 结果判断 参照GAPDH扩增情况，比较正常、癌旁与癌的差别，判断mRNA表达结果。比较胃癌、癌旁组织放射自显影微卫星电泳条带与正常组织差别，判断杂合缺失。
1.6 统计学处理 采用χ 2 检验，当P<0.05时认为差异有显著性。
2 结果
2.1 正常、癌旁及胃癌组织中p73mRNA表达及杂合缺失 见表1、图1、图2。
表1 正常、癌旁及胃癌组织中p73mRNA表达及杂合缺失 (略)
2.2 p73mRNA高表达及杂合缺失与临床病理参数的关系 根据肿瘤组织学类型、分化程度、大小、部位、年龄及性别进行分组(见表2)，各组间p73mRNA高表达及杂合缺失差异无显著性(P>0.05)。
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2.3 p73mRNA表达与杂合缺失的关系 20例p73mRNA高表达的胃癌标本中共检出杂合缺失4例，占20%(4/20)。16例p73mRNA阴性表达标本中检出杂合缺失4例，占25%(4/16)。经配对技术资料χ 2 检验p73mRNA高表达与杂合缺失无显著相关性(P>0.05)。12例p73mRNA高表达癌旁组织中检出标本中共检出杂合缺失2例，占16.7%(2/12)，24例p73mRNA阴性表达标本中检出杂合缺失3例，占12.5%(3/24)，经配对技术资料χ 2 检验p73mRNA高 表达与杂合缺失无显著相关性(P>0.05)。
表2 p73mRNA表达及杂合缺失与临床病理参数关系 (略)
图1 肠化生及胃癌组织中p73基因mRNA高表达(RT-PCR法)(略)
图2 癌旁肠化生及癌组织中p73基因杂合缺失(PCR-SSLP法)(略)
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3 讨论
p73基因是近年来发现的新的肿瘤相关基因，定位于1p36.33，此区域是神经母细胞瘤、黑色素瘤等癌肿中的染色体片段缺失热点区，且其基因、蛋白结构及功能与p53具有相似性，被认为是p53基因家族新成员，是一个候选抑癌基因 [1～5] 。
目前，p73在一些肿瘤转录表达已有报道 [1～4，7，8] ，本研究发现，胃癌、癌旁组织中p73基因既存在着mRNA表达升高也存在着杂合缺失现象，超过1/4胃癌中及少数癌旁组织中存在p73基因微卫星位点的杂合缺失，半数以上的胃癌及1/3癌旁组织中呈现p73基因异常高表达状态，提示p73基因可能以多种变异方式参与了胃癌的发生与发展。分析p73基因异常及杂合缺失与临床病理参数的关系发现不同年龄、性别、部位其变异频率并无显著差别，其改变与组织学类型、分化程度及肿瘤大小无关，提示p73基因改变可能是随机分布，并无选择性，可能是胃癌的热点基因变化。胃肠两型胃癌中p73基因的改变并无显著差别，提示p73基因可能以多种方式参与了两型胃癌的发生发展。其第9内含子杂合缺失既存在于p73基因高表达胃癌及癌旁 组织中，也存在于p73基因未表达的胃癌及癌旁组织中，且两种改变无显著相关性，提示mRNA的高表达与杂合缺失是p73基因两个独立的异常改变方式。
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p73基因的高表达改变显然与经典的抑癌基因失活致癌理论相矛盾，因此有研究者对p73基因是否为抑癌基因提出疑问 [3，8] 。本研究同时发现在癌旁及胃癌组织中存在该基因的杂合缺失改变，这为p73基因的研究又提供了新的线索。这或许提示该基因可能不是传统意义上的抑癌基因，而是以独特的基因改变方式参与了细胞突变的新的抑癌基因。有关p73是不是一种抑癌基因、p73在肿瘤中为什么很少突变、它的活化调节机制以及与p53的关系等都有待进一步研究。
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参考文献
1 Corn PG，Kuerbitz SJ，Noesel MM，et al.Transcriptional silencing of the p73gene in acute lymphoblastic leukemia and Burkitt’s lymphoma is asˉsociated with5’CpG island methylation.Cancer Res，1999，59(14):3352-3356.
2 Schwab M，Praml C，Amler LC.Genomic instability in1p and human malignancies.Genes Chromosomes&Cancer，1996，16(4):211-229.
3 Mai M，Yokomizo A，Qian C，et al.Activation of p73silent allele in lung cancer.Cancer Res，1998，58(11):2347-2349.
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4 Takahashi H，Ichimiya S，Yoshinori Nimura，et al.Mutation，allelotypˉing，and transcription analyses of the p73gene in prostatic carcinoma.Cancer Res，1998，58(10):2076-2077.
5 王东旭，房殿春，刘为纹.胃粘膜肠上皮化生癌变的分子机制研究.重庆医学，1998，27(6):428-429.
6 王东旭，房殿春，罗元辉，等.胃癌组织中增殖细胞核抗原、及p53、K-ras及bcl-2蛋白的表达.解放军医学杂志，1998，23(3):172-174.
7 Tannapfel A，Wasner M，Krause K，et al.Expression of p73and its relaˉtionto histopathology and prognosis in hepatocelluar carcinoma.J.of the National Cancer Institute，1999，91(13):1154-1158.
8 KangMJ，Park J，Byun DS，et al.Loss of imprinting and elevated expresˉsion of wild-type p73in human gastric adenocarcinoma.Clin Cancer Res，2000，6(5):1767-1771.
作者单位:1300142天津解放军第254医院消化科 2400038重庆西南医院消化科
(编辑 于少伟), http://www.100md.com(李伟 王东旭 王建文 房殿春)