人参皂苷对紫外线诱导PC12细胞损伤及凋亡的保护作用
【摘要】 目的 研究人参皂苷(GRS)对神经元分化细胞株(PC12)损伤及凋亡的影响。方法 采用神经细胞培养和流式细胞仪技术，以不同强度紫外线诱导PC12细胞损伤作用作为细胞模型，观察紫外线对PC12细胞的影响，以及不同剂量GRS对PC12损伤的保护作用。结果PC12照射后死亡方式之一是凋亡，吖啶橙和溴化锭(AO)染色荧光显微镜计数凋亡细胞百分率和DNA梯状带(DNA ladder)检测结果发现细胞凋亡有时间和剂量上的依赖性，GRS对紫外线诱导的细胞凋亡，也有一定的拮抗作用。结论 GRS能拮抗紫外线诱导的PC12细胞凋亡，对紫外线引起的细胞凋亡有一定的保护作用。
关键词 PC12 凋亡 人参皂苷 紫外线 流式细胞仪
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)09-0769-02
Study of ginsenoside on injury and apoptosis of
, http://www.100md.com
pheochromocytoma(PC12)cells induced by ultraviolet
Chu Yanhui
Mu Dan Jiang Medical University，Hilongjiang157011.
【Abstract】 Objective To study the effects of ginsenoside on injury and apoptosis of PC12cells induced by ultraviolet.Methods PC12cells induced by ultraviolet were used to observe the effects of GRS on the inhibition of apoptosis.A apoptotic cells were measured using cultured cells and flow cytometric assay.Results The predominant model of cell death in pc12after irradiation was apoptotic which is dependent on dose and time of irradiation.The time and dose dependent apoptosis measured by AO fluorescent staining for percentage and gel electrophoresisfor“DNA Iˉadder”of apoptosis cells.Conclusion UVB induced apoptosis in cultured PC12cell and GRS reduced apoptosis.
, 百拇医药
Key words pheochromocytoma(PC12)cell apoptosis ginsenoside ultravioletrays flow cytometry
人参皂苷(ginsenoside，GRS)是人参根提取物的主要成分之一，是人的血小板活化因子拮抗剂，其药理作用较为广泛 [1] ，其对中枢神经系统的保护作用近年来逐渐受到人们的重视，临床研究表明对老年性痴呆症(Alzheimer disease，AD)有一定的疗效，实验证据提示，细胞凋亡为衰老、Alzheimer病和Parkinson病等神经系统变性疾病神经元丧失的主要原因之一 [2] 。本实验采用紫外线诱导神经元分化株PC12细胞凋亡和损伤，并在此细胞模型观察人参皂苷对PC12细胞损伤及凋亡的保护作用
1 材料和方法
1.1 药品和试剂 人参皂苷(黄褐色粉末，纯度>99%)由白求恩医科大学有机化学实验室提供。小牛血清，DMEM培养基，胰蛋白酶均购自Gibco BRL公司。
, http://www.100md.com
1.2 仪器设备 CO2 培养箱德国产35060，FACSCan型流式细胞仪为BD公司产品，低温离心机北京四环公司生产，紫外透射仪(ModelUVGL—58Upland美国)。
1.3 细胞株 大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞株由北京大学医学部提供。
1.4 方法
1.4.1 紫外线照射PC12细胞和处理 PC12细胞接种在培养皿24h后吸去培养液，加入3ml无酚红Hank’s液，分为三组:对照组(紫外照射)、测定组(紫外照射+人参皂苷)、空白组。首先用不同的照射剂量0、50、100、200、400J/m 2 照射后细胞置于37℃5%CO 2 培养箱中培养24h收取待检，和加入不同剂量的人参皂苷组培养24h收取待检。
1.4.2 凋亡细胞的检测 [3] 收集部分细胞悬液95μl用5μl吖啶橙染色(10mg吖啶橙溶于100ml0.01mol/L PBS中)，制片后用荧光显微镜观察，照相，剩余部分细胞用酚—氯仿法抽提总DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
, 百拇医药
1.4.3 流式细胞仪分析 对数生长期的PC12细胞经100J/m 2 照射10min分别在0、12、24h收集细胞，用碘化丙锭(PI)单染色法，实验室避光30min，流式细胞仪进行检测。
2 结果
2.1 PC12细胞经不同剂量紫外线照射(50～400J/m 2 )后10min培养24h用吖啶橙染色阳性的凋亡细胞高于对照组的凋亡细胞，说明随着照射剂量增大，细胞凋亡数明显增高(见表1)。
表1 不同剂量UVB照射后PC12培养细胞率和电泳检测结果( 略)
2.2 PC12细胞不同培养时间凋亡的影响用100J/m 2 和200J/m 2 UVB照射6h，生理凋亡细胞分别为9.2±2.5%，12.8±4.3%，培养24h后凋亡细胞分别达到38.7±3.0%和42.6±5.2%，结果表明同一剂量随着培养时间延长凋亡细胞总趋势渐增(见表2)。
, http://www.100md.com
表2 100J/m 2 和200J/m 2 剂量UVB照射PC12 细胞培养不同时间的凋亡细胞百分率( 略)
2.3 PC12细胞经UVB照射检测DNA ladder结果表明PC12细胞经100J/m 2 紫外线照射对照组出现DNA ladder，而加入人参皂苷组出现DNA ladder不明显，即人参皂苷减少PC12损伤和凋亡(见图1)。
2.4 流式细胞仪检测结果标明经紫外线照射10min的PC12细胞，于12h和24h时在G1峰前各出现一个二倍体峰，即凋亡之峰(见图2)
3 讨论
紫外线是一种高能光量子，一定剂量照射机体将会产生一系列化学反应及生物学效应。UVB照射后诱导PC12细胞凋亡，经过人参皂苷处理后对紫外线照射引起的细胞凋亡受到了明显的抑制作用，说明人参皂苷对UVB诱导PC12细胞凋亡有很好的保护作用。
, http://www.100md.com
关于人参皂苷对神经元保护机制，目前研究较少，但最近研究表明人参皂苷可提高大鼠脑皮质神经细胞膜的流动性，并减少大鼠大脑皮层NO的含量和降低NOS的活性 [4] ，同时可选择性降低大鼠神经细胞内的钙浓度 [5] 。总之，人 参皂苷有一定的稳定细胞膜作用，又可参与细胞内钙水平的调节。
细胞凋亡是一种程序性死亡，Bcl-2和Box分别是细胞凋亡调节因子之一，他们间的相对比例决定了细胞存亡 [6] 。本实验用UVB诱导PC12细胞凋亡过程中随着UVB照射剂量不同，可能使Bcl-2蛋白的表达率逐渐下降而Box蛋白的表达率上升，可能是决定PC12细胞凋亡的关键。本实验结果提示，人参皂苷可能有助Alzheimer病和帕金森氏症等神经退性疾病过程中PC12凋亡的减少，发挥延缓衰老的作用，但人参皂苷抗细胞凋亡的机制及作用环节有待于深入研究。
(本文图片略)
, http://www.100md.com
参考文献
1 张均田.人参研究的回顾和展望.药学学报，1995，30:321.
2 Enokido Y，halanaka H.Neuronal cell death and apoptosis.Gan To kaˉgaka Ryoho，1994，21:615.
3 DarzynkieewicZ，Brino S，Bion GD，et al.Feature of apoptotic cells meaˉtured by flow cytometry.Science，1992，13:795.
4 Li JQ，Duan ZK，Zhang JT.Effect of age and ginsenoside Rg1on nitric oxide content and nitric oxide synthase activity of cerebral contex in rats.Acta Pharm Sin(in chinese)，1992，32(4):251-254.
, 百拇医药
5 Liu M，Zhang JT.Protective effects of ginsenoside Rbi and Rg1on culˉturedhippocampos.Chin Med J，1995，108(6):544-547.
6 Chen EH，Kisch DG，Clem RT，et al.conversion of bcl-2to box-like death factor by caspases.Science，1997，278(12):1966-1968.
作者单位:157011黑龙江省牡丹江医学院
(收稿日期:2003-07-08)
(编辑 晓亮), http://www.100md.com(初彦辉)
关键词 PC12 凋亡 人参皂苷 紫外线 流式细胞仪
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)09-0769-02
Study of ginsenoside on injury and apoptosis of
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pheochromocytoma(PC12)cells induced by ultraviolet
Chu Yanhui
Mu Dan Jiang Medical University，Hilongjiang157011.
【Abstract】 Objective To study the effects of ginsenoside on injury and apoptosis of PC12cells induced by ultraviolet.Methods PC12cells induced by ultraviolet were used to observe the effects of GRS on the inhibition of apoptosis.A apoptotic cells were measured using cultured cells and flow cytometric assay.Results The predominant model of cell death in pc12after irradiation was apoptotic which is dependent on dose and time of irradiation.The time and dose dependent apoptosis measured by AO fluorescent staining for percentage and gel electrophoresisfor“DNA Iˉadder”of apoptosis cells.Conclusion UVB induced apoptosis in cultured PC12cell and GRS reduced apoptosis.
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Key words pheochromocytoma(PC12)cell apoptosis ginsenoside ultravioletrays flow cytometry
人参皂苷(ginsenoside，GRS)是人参根提取物的主要成分之一，是人的血小板活化因子拮抗剂，其药理作用较为广泛 [1] ，其对中枢神经系统的保护作用近年来逐渐受到人们的重视，临床研究表明对老年性痴呆症(Alzheimer disease，AD)有一定的疗效，实验证据提示，细胞凋亡为衰老、Alzheimer病和Parkinson病等神经系统变性疾病神经元丧失的主要原因之一 [2] 。本实验采用紫外线诱导神经元分化株PC12细胞凋亡和损伤，并在此细胞模型观察人参皂苷对PC12细胞损伤及凋亡的保护作用
1 材料和方法
1.1 药品和试剂 人参皂苷(黄褐色粉末，纯度>99%)由白求恩医科大学有机化学实验室提供。小牛血清，DMEM培养基，胰蛋白酶均购自Gibco BRL公司。
, http://www.100md.com
1.2 仪器设备 CO2 培养箱德国产35060，FACSCan型流式细胞仪为BD公司产品，低温离心机北京四环公司生产，紫外透射仪(ModelUVGL—58Upland美国)。
1.3 细胞株 大鼠肾上腺嗜铬瘤PC12细胞株由北京大学医学部提供。
1.4 方法
1.4.1 紫外线照射PC12细胞和处理 PC12细胞接种在培养皿24h后吸去培养液，加入3ml无酚红Hank’s液，分为三组:对照组(紫外照射)、测定组(紫外照射+人参皂苷)、空白组。首先用不同的照射剂量0、50、100、200、400J/m 2 照射后细胞置于37℃5%CO 2 培养箱中培养24h收取待检，和加入不同剂量的人参皂苷组培养24h收取待检。
1.4.2 凋亡细胞的检测 [3] 收集部分细胞悬液95μl用5μl吖啶橙染色(10mg吖啶橙溶于100ml0.01mol/L PBS中)，制片后用荧光显微镜观察，照相，剩余部分细胞用酚—氯仿法抽提总DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测。
, 百拇医药
1.4.3 流式细胞仪分析 对数生长期的PC12细胞经100J/m 2 照射10min分别在0、12、24h收集细胞，用碘化丙锭(PI)单染色法，实验室避光30min，流式细胞仪进行检测。
2 结果
2.1 PC12细胞经不同剂量紫外线照射(50～400J/m 2 )后10min培养24h用吖啶橙染色阳性的凋亡细胞高于对照组的凋亡细胞，说明随着照射剂量增大，细胞凋亡数明显增高(见表1)。
表1 不同剂量UVB照射后PC12培养细胞率和电泳检测结果( 略)
2.2 PC12细胞不同培养时间凋亡的影响用100J/m 2 和200J/m 2 UVB照射6h，生理凋亡细胞分别为9.2±2.5%，12.8±4.3%，培养24h后凋亡细胞分别达到38.7±3.0%和42.6±5.2%，结果表明同一剂量随着培养时间延长凋亡细胞总趋势渐增(见表2)。
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表2 100J/m 2 和200J/m 2 剂量UVB照射PC12 细胞培养不同时间的凋亡细胞百分率( 略)
2.3 PC12细胞经UVB照射检测DNA ladder结果表明PC12细胞经100J/m 2 紫外线照射对照组出现DNA ladder，而加入人参皂苷组出现DNA ladder不明显，即人参皂苷减少PC12损伤和凋亡(见图1)。
2.4 流式细胞仪检测结果标明经紫外线照射10min的PC12细胞，于12h和24h时在G1峰前各出现一个二倍体峰，即凋亡之峰(见图2)
3 讨论
紫外线是一种高能光量子，一定剂量照射机体将会产生一系列化学反应及生物学效应。UVB照射后诱导PC12细胞凋亡，经过人参皂苷处理后对紫外线照射引起的细胞凋亡受到了明显的抑制作用，说明人参皂苷对UVB诱导PC12细胞凋亡有很好的保护作用。
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关于人参皂苷对神经元保护机制，目前研究较少，但最近研究表明人参皂苷可提高大鼠脑皮质神经细胞膜的流动性，并减少大鼠大脑皮层NO的含量和降低NOS的活性 [4] ，同时可选择性降低大鼠神经细胞内的钙浓度 [5] 。总之，人 参皂苷有一定的稳定细胞膜作用，又可参与细胞内钙水平的调节。
细胞凋亡是一种程序性死亡，Bcl-2和Box分别是细胞凋亡调节因子之一，他们间的相对比例决定了细胞存亡 [6] 。本实验用UVB诱导PC12细胞凋亡过程中随着UVB照射剂量不同，可能使Bcl-2蛋白的表达率逐渐下降而Box蛋白的表达率上升，可能是决定PC12细胞凋亡的关键。本实验结果提示，人参皂苷可能有助Alzheimer病和帕金森氏症等神经退性疾病过程中PC12凋亡的减少，发挥延缓衰老的作用，但人参皂苷抗细胞凋亡的机制及作用环节有待于深入研究。
(本文图片略)
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参考文献
1 张均田.人参研究的回顾和展望.药学学报，1995，30:321.
2 Enokido Y，halanaka H.Neuronal cell death and apoptosis.Gan To kaˉgaka Ryoho，1994，21:615.
3 DarzynkieewicZ，Brino S，Bion GD，et al.Feature of apoptotic cells meaˉtured by flow cytometry.Science，1992，13:795.
4 Li JQ，Duan ZK，Zhang JT.Effect of age and ginsenoside Rg1on nitric oxide content and nitric oxide synthase activity of cerebral contex in rats.Acta Pharm Sin(in chinese)，1992，32(4):251-254.
, 百拇医药
5 Liu M，Zhang JT.Protective effects of ginsenoside Rbi and Rg1on culˉturedhippocampos.Chin Med J，1995，108(6):544-547.
6 Chen EH，Kisch DG，Clem RT，et al.conversion of bcl-2to box-like death factor by caspases.Science，1997，278(12):1966-1968.
作者单位:157011黑龙江省牡丹江医学院
(收稿日期:2003-07-08)
(编辑 晓亮), http://www.100md.com(初彦辉)