还原型谷胱甘肽合抗震止痉胶囊保护性治疗帕金森病的实验研究
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中华中西医杂志 2003年5月 第4卷 第9期
【摘要】 目的 观察还原型谷胱甘肽(GSH)合抗震止痉胶囊对帕金森病(PD)大鼠模型的异常行为、黑质抗氧化系统、线粒体呼吸链功能、神经递质及其代谢的影响，并探讨其作用机制。方法 应用6-羟基多巴胺立体定向注射制作PD大鼠模型。将24只大鼠随机分为4组(每组6只):模型组，GSH合抗震止痉胶囊组，左旋多巴组，假手术组，分别给予相应处理，共45天，给药前后均进行行为学测试，并测定各组大鼠黑质区GSH-Px、MDA、活性氧及线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ水平，测定尾状核DA、HVA及MAO-B水平。结果 (1)GSH合抗震止痉胶囊组和左旋多巴组均可部分改善大鼠旋转行为(P<0.05)。(2)GSH合抗震止痉胶囊能减轻黑质区氧化应激损伤，而左旋多巴的作用则相反。(3)GSH合抗震止痉胶囊能增强黑质呼吸链酶复合体Ⅰ活性，而左旋多巴的作用则相反。(4)GSH合抗震止痉胶囊组能降低MAO-B活性，增加DA含量及DA/HVA比值，而左旋多巴组则MAO-B活性增强，DA、HVA含量及DA/HVA比值均明显升高。结论 GSH合抗震止痉胶囊能部分改善大鼠旋转行为，减轻PD模型大鼠黑质区氧化应激损伤，保护线粒体呼吸链，降低MAO-B活性，调节纹状体DA的含量及其代谢，提示对帕金森病具有一定的保护性治疗作用。
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关键词 还原型谷胱甘肽合抗震止痉胶囊 帕金森病 左旋多巴 氧化应激 线粒体呼吸链
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)09-1293-05
The experimental study on cyto-protection treatment function of
glutathione combined with kang-zhen zhijing capsule on Parkinson disease
Lu Jianming，Zhou Houguang，Bao Yuancheng，et al.
The Department of Neurology，The Affiliated Changshu Hospital of Yangzhou
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University Medical College，Changshu215500.
【Abstract】 Objective To observe the effects of glutathione combined with Kang-zhen Zhijing Capsule on the abnormal behavior，nigral antioxidation system，mitochondrial respiration-chain function，neurotransmitter supersˉession of model rat for PD and study its mechanism.Methods The model rats for PD were established through stereˉtoxic microinjection of6-hydroxydompamine(6-OHDA).The24rats after behavior test were randomly divided into4groups:model group(MG)，glutathione combined with kang-zhen Zhijing Capsule group(GKG)，levodopa group(LG)and sham-operated group(SG).Every group was given relevant treatment for45days.All rats behavior were tested before and after giving medicine.The activity of GSH-Px，content of MDA，ROS and mitochondrionase complex I of nigra and the content of DA，HVA and activity ofMAO-B were assayed.Results (1)GKG and LG all had obviˉous effect on its rotation behavior.(2)GKG could decrease the nigral oxidative stress of PD model rats，but LG’s effect was opposite.(3)GKG could exert some protective effect on mitochondrial respirtion-chain，but LG’s effect wasopˉposite.(4)The MAO-B activity of GKG decreased，DA and DA/HVA increased.MAO-B activity，DA，HVA content and DA/HVA ratio increased in the LG.Conclusion GSH combined with Kang-zhen Zhijing Capsule could amelioˉrate partially PD model rats rotation behavior，decrease the nigral oxidative stress of PD model rats，protect mitochonˉdrial respirtion-chain，reduced MAO-B activity，regulate DA content and its supression，which indicated that GSH combined with Kang-zhen ZhijingCapsule could protectively treat PD.
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Key words gultathione combined with Kang-zhen Zhijing Capsule Parkinson’s disease levodopa oxidaˉtive stress mitochondrial respiration-chain
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种以黑质多巴胺能神经元(nigral dopaminergic neuron，NDN)特征性缺失为主要病理改变的神经系统变性性疾病，临床上以静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势调节障碍为主要特征，其发病率(每年每10万人口新增加病例数)可随年龄的增加而提高。50岁以上为500人/10(万·年)，60岁以上则达1000人/10(万·年)，患病率约为1%，全国患者总数约为110万～150万。其患病率之高，使之成为仅次于脑血管病的神经系统常见病。
L-dopa制剂目前仍被认为是治疗PD的金标准，可明显改善PD症状，但50%～80%的PD患者最终将出现运动方面的并发症，从开始服药至出现并发症平均为4.1年(0.3～18年) [1] 。多巴制剂除了在自身代谢过程中可引起诸多副反应外，有报道认为其代谢过程中产生的代谢产物本身就可诱发神经元凋亡 [2，3] ，从而破坏尚未受损的NDN及其通路，加速病程进展。因此，探索有效的神经保护性治疗方案已成为目前PD研究的新热点，我们已在临床上应用还原型谷胱甘肽合复方中药制剂抗震止痉胶囊进行了有益的探索，取得了一定效果，并对其作用机制进行了实验研究。现报告如下。
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1 材料与方法
1.1 材料 SD大鼠100只，2～3月龄，雄性，由河南省实验动物中心提供。还原型谷胱甘肽(GSH，商品名古拉定)，600mg/支，香港积华药业有限公司。抗震止痉胶囊(由首乌、枸杞、肉苁蓉、当归、黄芪、白芍、鸡血藤、地龙、天麻、木瓜、白术、丹参、全蝎、钩藤等14味中药组成)，0.5g/粒，相当于生药2g，安徽中医学院一附院制剂中心。左旋多巴注射液(L-dopa)，50mg/支(20ml)，上海福达制药有限公司。6-羟基多巴胺(6-OHDA)，美国sigma公司;阿朴吗啡(apoˉmorphine，APO)，美国sigma公司;还原型辅酶Ⅰ(NADH)，sigˉma公司;活性氧试剂盒，MDA试剂盒，GSH-Px试剂盒，MAO-B试剂盒，南京建成生物工程公司;其余相关检测试剂均为国产分析纯。SR-6N型大鼠脑立体定向仪，日本Narishige公司;T 2 -16R型高速冷冻离心机，上海离心机研究所;MDF-382E超低温冰箱，日本SANYO电子。
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1.2 方法
1.2.1 微量注射 [4] 将100只大鼠随机分为两组，实验组90只，假手术组6只，经反复行为检测确认其无旋转行为后进行实验:(1)实验组:1%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉后，将大鼠固定于脑立体定向仪上，常规消毒剪开头皮剥离骨膜，参照大鼠脑立体定向图谱，确定左侧黑质致密部(SNC)和中脑腹侧背盖黑质纹状体通路(VTA)二坐标，分别位于前囟后(5.0±0.2)mm，(4.6±0.1)mm;矢状缝左侧(1.7±0.1)mm，(0.9±0.1)mm;颅骨表面下(7.6±0.1)mm，(7.5±0.1)mm，向两点各注射6-OHDA8μg(溶于4μl含质量分数为0.2%抗坏血酸的生理盐水中)，术后经连续4周(每周1次)腹腔注射阿朴吗啡(0.5mg/kg
体重)进行检测，共筛选出PD模型64只(旋转圈数均>210r/30min)，随机选取18只分为3组:模型组(6只)，治疗组(还原型谷胱甘肽合抗震止痉胶囊组，6只)，对照组(左旋多巴组，6只)。(2)假手术组:用上述同样方法向两坐标靶点注射4μl生理盐水(仅含0.2%质量分数的抗坏血酸)。
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1.2.2 给药方法 GSH注射剂用生理盐水配制成25mg/ml 的溶液(现配现用，剩余溶液不再使用)。抗震止痉胶囊内药物颗粒研成细末，并加入适量羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，将其混溶于适量生理盐水中，配成56mg/ml溶液(注意每次灌胃前将其摇匀)。左旋多巴注射剂可直接使用。模型组:予生理盐水10ml·kg -1 ·d -1 分别行腹腔注射和灌胃。 假手术组:予生理盐水10ml·kg -1 ·d -1 分别行腹腔注射和灌胃。治疗组:予GSH125ml·kg -1 ·d -1 腹腔注射，抗震止痉胶囊1.12g·kg -1 ·d -1 灌胃，注意二者给药时间需间隔2h以上。对照组:予L-dopa25ml·kg -1 ·d -1 腹腔注射，以上各组均分2次给药，共45天。
1.2.3 给药期间和给药后行为测试 注意观察各组给药期间的异常行为变化，并进行记录。给药结束次日再行旋转行为测试，同时进行录像保存。
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1.2.4 指标检测 将两组大鼠在1%戊巴比妥麻醉下，迅速断头处死，冰浴中快速剥离大脑，参照大鼠脑立体定向图谱，准确切取中脑黑质和尾状核头部脑组织，置于匀浆介质中，-60℃冰箱内保存待测，检测中脑黑质细胞的活性氧、MDA、GSH-Px及线粒体呼吸链复合体Ⅰ水平，检测尾状核头部DA、HVA及MAO-B水平，活性氧、MDA、GSH-Px及MAO-B水平均采用南京建成生物工程公司提供的试剂盒进行检测，线粒体呼吸链复合体Ⅰ参照报道的方法进行检测 [5] ，DA、HVA采用荧光分光光度法测定 [6] 。
1.2.5 统计学处理 数据均采用ˉx±s表示，计量资料治疗前后比较用t检验，采用SPSS(10.0版)统计软件进行统计，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 行为学观测 多数大鼠经APO诱导后于术后2～3周出现旋转行为，经连续6周检测，实验组90只大鼠中有64只恒定转向右侧且旋转速度>210r/30min，模型制作成功率71.1%。各组给药45天后次日行APO诱导，观测其旋转行为变化，并与给药前进行比较。结果见表1。
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表1 各组大鼠治疗前后旋转行为的比较 (略)
2.2 相关抗氧化指标检测结果 模型组GSH-Px和复合体Ⅰ含量均明显低于假手术组(P<0.05)，对照组的上述指标又明显低于模型组(P<0.05)，而治疗组的上述指标则明显高于对照组(P<0.05)。模型组活性氧和MDA水平明显高于假手术组(P<0.05)，对照组的上述指标又明显高于模型组(P<0.05)，而治疗组GSH-Px和复合体Ⅰ则明显高于对照组(P<0.05)，活性氧和MDA明显低于对照组(P<0.05)。结果见表2。
2.3 相关神经递质及其代谢指标检测结果 模型组DA、HVA及DA/HVA水平均明显低于假手术组，而MAO-B活性则明显高于假手术组，对照组的上述指标均明显高于模型组，治疗组的DA、HVA水平虽低于对照组，且MAO-B活性亦低于对照组，而DA/HVA则明显高于对照组(以上P均<0.05)。结果见表3。
表2 各组黑质区GSH-Px、复合体Ⅰ、活性氧及MDA含量的比较 (略)
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表3 各组尾状核头部MAO-B、DA、HVA及DA/HVA水平的比较 (略)
3 讨论
3.1 GSH合抗震止痉胶囊对PD模型大鼠旋转行为、神经递质及其代谢的影响 GSH广泛存在于哺乳动物体内，是细胞内最主要的巯基和含量丰富的小分子三肽化合物，它参与细胞许多功能活动，如拮抗外源性毒物、细胞内许多化合物代谢、半胱氨酸的储存与运输、拮抗氧自由基损伤、调节机体免疫功能及抑制细胞凋亡等，并在细胞循环调节和温度耐受等方面发挥重要作用。GSH是机体内自由基防御系统中的一个重要物质，它能有效清除生物氧化产生的自由基，维持细胞内环境的稳定 [7] ，并在使暴露于氧化环境的组织免受自由基损害方面起重要作用 [8] 。此外，GSH在对抗氧自由基过氧化并抑制由此引发的细胞凋亡、坏死及自稳态改变等方面亦发挥重要作用 [9] 。有研究发现，PD病人黑质区和苍白球内GSH含量有明显降低，而在多系统萎缩(MSA)或进行性核上性麻痹(PSP)病人黑质中GSH含量则无明显改变，这表明PD黑质GSH含量降低具有疾病和部位选择性，说明GSH在PD病理变化中起重要作用 [10] 。由于PD患者GSH耗竭程度与神经元脱失程度之间存在正相关，故我们认为，PD很可能是一种多原因促诱发的神经变性性疾病，在其病程中氧化反应异常与自由基生成增多可能是其不可逆性进展的唯一解释。
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有研究发现，首乌、肉苁蓉、黄芪、白术均可通过抑制脑MAO-B活性以延缓脑功能的衰老[11～14] 。实验表明，丹参酮Ⅱ A 磺酸钠对肌张力可产生明显抑制作用 [15] 。天麻可显著提高动物尾状核和脑干内DA含量，影响中枢不同脑区Ach水平 [16] 。实验观察到钩藤碱能使培养的大鼠脑片DA释放增加 [17] 。
6-OHDA毁损的模型多无PD病人特有的静止性震颤等典型表现，而主要表现为其本身特有的行为学改变，即旋转行为。对于旋转行为的发生，一般认为6-OHDA选择性的损毁注射区NDN，DA含量减少。并且使注射同侧尾、壳核内DA能神经纤维末梢溃变，同侧黑质-纹状体通路被破坏，纹状体内神经元失去DA能神经支配，其DA受体则代偿性大量增加，且敏感性增加。当给予外源性DA受体激动剂如阿朴吗啡后，则可以与损伤侧尾、壳核内大量增加 的DA受体结合，出现受体超敏现象，导致动物行为的不对称，动物损伤侧反应强于健侧而无法保持平衡，使其向对侧(健侧)旋转，旋转的频率大致与NDN受损程度一致。
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在给药45天后，左旋多巴组大鼠旋转行为显著改善，无疑与其直接增加毁损区DA含量有关，同时发现GSH合抗震止痉胶囊亦可使大鼠旋转行为明显改善(P<0.05)，可能与首乌、肉苁蓉、黄芪、地龙等能明显降低MAO-B活性，提高DA等单胺类神经递质含量，增加大鼠纹状体DA/HVA的比值等有关。亦有报道 [18，19] 发现GSH能促进多巴胺的合成底物进入黑质纹状体系统多巴胺能神经元，促进神经营养因子作用于NDN，提高NDN活性。在黑质-纹状体多巴胺能神经通路突触前膜上分布有NMDA受体，GSH对NMDA受体具有调节作用，GSH可能通过这一途径而改善黑质-纹状体系统功能 [20] 。
3.2 GSH合抗震止痉胶囊对PD模型大鼠黑质ROS、MDA及GSH-Px的影响 ROS既包括各种氧自由基如·OH和O 2 ·- 等，同时也包括与各种自由基行为密切相关的非自由基成分，如H 2 O2 、 1 O 2 及次氯酸等。它可引发多不饱合脂肪酸(PUFA)产生脂质氧化反应，对蛋白质、DNA、RNA及多糖高分子物质等产生氧化、交联、变性和降解，影响细胞的功能，甚至导致细胞死亡。MDA是过氧化脂质(LPO)的降解产物，MDA含量可以反映LPO的水平。LPO可对膜的结构产生严重损害，影响膜的功能。GSH-Px主要位于线粒体内，特异性地催化GSH对H 2 O 2的还原反应，从而起到保护细胞结构和功能完整的作用，虽然GSH-Px不能直接清除自由基，但可清除H 2 O 2 和LPO，减少自由基的生成。GSH和GSH-Px是脑内最重要的自由基清除系统。
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目前国内外有关脑内GSH的来源及GSH透过血脑屏障的可能途径等方面的研究报道较少。Kannan等 [21] 采用颈动脉注射技术，发现大鼠脑组织，能够稳定的吸收 35 S标记的GSH，而且其吸收指数与是否应用不可逆的γ-谷氨酰转肽酶抑制剂阿西维辛无明显关系，被吸收的放射性主要以GSH的形成存在(>83%)，表明GSH是将一种可溶性的特殊机制通过血脑屏障的。Sechi等 [22] 在临床研究中发现，将GSH(600mg×2/d，共30天，静脉注射)应用于9例早期未经治疗的PD病人，所有病人临床症状均明显改善，运动不能症状下降42%，停药后其临床疗效可维持2～4个月。我们已在以往临床研究中发现GSH合抗震止痉胶囊对常规治疗疗效明显衰减的PD患者具有一定的疗效，并能减轻机体的氧化应激损伤，提示对PD具有一定的神经保护性治疗作用 [22] 。
首乌可增强SOD的活力，明显地抑制脑组织的脂质过氧化 [23] 。肉苁蓉可提高机体的应激能力，直接或间接清除自由基对机体的损害，提高机体组织的抗氧化能力 [24] 。枸杞子可明显抑制血清LPO生成，使血中GSH-Px和红细胞SOD活力增高 [25] 。黄芪所含的黄芪总黄酮可对抗·OH所致的损伤，升高SOD活性，降低LPO，维持细胞的正常代谢 [26] 。白术可显著提高红细胞SOD活性，明显抑制脑MAO-B活性，并可直接清除自由基 [27] 。同样，当归亦有减少自由基产生或加速自由基清除作用 [28] 。丹参素具有清除O 2 ·- 和·OH的作用，并对大鼠脑缺血和再灌注损伤的线粒体具良好的保护效应，提高SOD、GSH-Px活性，具有很强的抗氧化作用 [29] 。天麻可提高SOD和GSH-Px活性，抑制脂质过氧化，并能促进机体DNA和蛋白质合成[30] 。
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本实验发现L-dopa在一定程度上降低了黑质的抗氧化能力，促进自由基的生成，使GSH-Px活性降低(P<0.05)，ROS、MDA水平升高(P均<0.05)。提示长期应用L-dopa能增加黑质区的氧化应激损伤，并可能在一定程度上加速NDN的进行性缺失。GSH合抗震止痉胶囊可显著降低ROS和MDA水平(P均<0.05)，增强GSH-Px活性(P<0.05)，从而增强机体的抗氧化能力，对NDN具有保护作用。
3.3 GSH合抗震止痉胶囊对PD模型大鼠黑质区线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ的影响 线粒体呼吸链是体内氧自由基产生的主要部位，呼吸链中任何部位受到抑制都会使自由基产生增多，复合体Ⅰ缺陷会导致自由基生成增多，使线粒体膜脂质过氧化，损伤mtDNA，从而加重线粒体功能障碍，形成毒性循环，同时增多的自由基可漏出线粒体，损伤细胞的蛋白质、脂肪及核基因，导致细胞死亡。有人通过免疫组化方法分析发现PD患者黑质呼吸链酶复合体Ⅰ染色明显减弱，而且主要位于含有神经黑色素的神经元 [31] 。以后的研究也支持PD患者黑质中存在酶复合体Ⅰ的缺陷，并主要位于黑质致密部，网状部正常，而且酶复合体Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及乌头酸酶活性正常，不同脑区的标本研究表明在大脑皮层、小脑、顶盖区、尾状核和苍白球等部位酶复合体Ⅰ及其他呼吸活性正常，不同脑区的标本研究表明在大脑皮层、小脑、顶盖区、尾状核和苍白球等部位酶复合体Ⅰ及其他呼吸链酶活性与正常对照组相比差异无统计学意义，提示PD患者黑质呼吸链酶复合体Ⅰ缺陷有高度解剖选择性 [32] 。
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本实验发现，模型组酶复合体Ⅰ含量明显低于假手术组(P<0.05)，与报道的结果基本一致。而L-dopa的应用则可进一步加重酶复合体Ⅰ的功能缺陷(与模型组比P<0.05)。其机制可能在于L-dopa长期应用过程中使活性氧大量生成，进一步加重了线粒体膜和DNA的损伤，导致电子传递链严重缺陷，活性氧产生增多，从而形成恶性循环，最终可能加速NDN的进行性缺失。GSH合抗震止痉胶囊能显著增加酶复合体Ⅰ含量(与模型组相比P<0.05)，因为GSH、首乌、肉苁蓉、黄芪、当归等均可直接或间接清除 自由基对机体的损害，提高机体组织的抗氧化能力和应激能力。而且全蝎还可最直接降低大鼠脑细胞线粒体的呼吸调节比(RCR)，二磷酸腺苷与氧之比(ADP/O)、氧商(QO 2 )及细胞色素氧化酶活性，增加膜脂质的流动性 [33] 。上述作用可协同拮抗自由基生成链的恶性循环。
综上所述，长期应用左旋多巴对帕金森病模型大鼠具有一定毒性作用，GSH合抗震止痉胶囊不仅能明显改善大鼠旋转行为，还可有效拮抗黑质区氧化应激损伤，保护线粒体呼吸链功能，推测可能在一定程度上延缓NDN进行性变性进程，其具体神经生物学机制仍有待进一步深入系统研究。
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基金项目:安徽省自然科学基金资助项目(编号:98JL086)
作者单位:1 215500扬州大学医学院附属常熟医院神经内科
2 230031安徽中医学院一附院神经内科
(编辑 秋实), 百拇医药
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University Medical College，Changshu215500.
【Abstract】 Objective To observe the effects of glutathione combined with Kang-zhen Zhijing Capsule on the abnormal behavior，nigral antioxidation system，mitochondrial respiration-chain function，neurotransmitter supersˉession of model rat for PD and study its mechanism.Methods The model rats for PD were established through stereˉtoxic microinjection of6-hydroxydompamine(6-OHDA).The24rats after behavior test were randomly divided into4groups:model group(MG)，glutathione combined with kang-zhen Zhijing Capsule group(GKG)，levodopa group(LG)and sham-operated group(SG).Every group was given relevant treatment for45days.All rats behavior were tested before and after giving medicine.The activity of GSH-Px，content of MDA，ROS and mitochondrionase complex I of nigra and the content of DA，HVA and activity ofMAO-B were assayed.Results (1)GKG and LG all had obviˉous effect on its rotation behavior.(2)GKG could decrease the nigral oxidative stress of PD model rats，but LG’s effect was opposite.(3)GKG could exert some protective effect on mitochondrial respirtion-chain，but LG’s effect wasopˉposite.(4)The MAO-B activity of GKG decreased，DA and DA/HVA increased.MAO-B activity，DA，HVA content and DA/HVA ratio increased in the LG.Conclusion GSH combined with Kang-zhen Zhijing Capsule could amelioˉrate partially PD model rats rotation behavior，decrease the nigral oxidative stress of PD model rats，protect mitochonˉdrial respirtion-chain，reduced MAO-B activity，regulate DA content and its supression，which indicated that GSH combined with Kang-zhen ZhijingCapsule could protectively treat PD.
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Key words gultathione combined with Kang-zhen Zhijing Capsule Parkinson’s disease levodopa oxidaˉtive stress mitochondrial respiration-chain
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种以黑质多巴胺能神经元(nigral dopaminergic neuron，NDN)特征性缺失为主要病理改变的神经系统变性性疾病，临床上以静止性震颤、肌僵直、运动迟缓和姿势调节障碍为主要特征，其发病率(每年每10万人口新增加病例数)可随年龄的增加而提高。50岁以上为500人/10(万·年)，60岁以上则达1000人/10(万·年)，患病率约为1%，全国患者总数约为110万～150万。其患病率之高，使之成为仅次于脑血管病的神经系统常见病。
L-dopa制剂目前仍被认为是治疗PD的金标准，可明显改善PD症状，但50%～80%的PD患者最终将出现运动方面的并发症，从开始服药至出现并发症平均为4.1年(0.3～18年) [1] 。多巴制剂除了在自身代谢过程中可引起诸多副反应外，有报道认为其代谢过程中产生的代谢产物本身就可诱发神经元凋亡 [2，3] ，从而破坏尚未受损的NDN及其通路，加速病程进展。因此，探索有效的神经保护性治疗方案已成为目前PD研究的新热点，我们已在临床上应用还原型谷胱甘肽合复方中药制剂抗震止痉胶囊进行了有益的探索，取得了一定效果，并对其作用机制进行了实验研究。现报告如下。
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1 材料与方法
1.1 材料 SD大鼠100只，2～3月龄，雄性，由河南省实验动物中心提供。还原型谷胱甘肽(GSH，商品名古拉定)，600mg/支，香港积华药业有限公司。抗震止痉胶囊(由首乌、枸杞、肉苁蓉、当归、黄芪、白芍、鸡血藤、地龙、天麻、木瓜、白术、丹参、全蝎、钩藤等14味中药组成)，0.5g/粒，相当于生药2g，安徽中医学院一附院制剂中心。左旋多巴注射液(L-dopa)，50mg/支(20ml)，上海福达制药有限公司。6-羟基多巴胺(6-OHDA)，美国sigma公司;阿朴吗啡(apoˉmorphine，APO)，美国sigma公司;还原型辅酶Ⅰ(NADH)，sigˉma公司;活性氧试剂盒，MDA试剂盒，GSH-Px试剂盒，MAO-B试剂盒，南京建成生物工程公司;其余相关检测试剂均为国产分析纯。SR-6N型大鼠脑立体定向仪，日本Narishige公司;T 2 -16R型高速冷冻离心机，上海离心机研究所;MDF-382E超低温冰箱，日本SANYO电子。
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1.2 方法
1.2.1 微量注射 [4] 将100只大鼠随机分为两组，实验组90只，假手术组6只，经反复行为检测确认其无旋转行为后进行实验:(1)实验组:1%戊巴比妥钠30mg/kg腹腔注射麻醉后，将大鼠固定于脑立体定向仪上，常规消毒剪开头皮剥离骨膜，参照大鼠脑立体定向图谱，确定左侧黑质致密部(SNC)和中脑腹侧背盖黑质纹状体通路(VTA)二坐标，分别位于前囟后(5.0±0.2)mm，(4.6±0.1)mm;矢状缝左侧(1.7±0.1)mm，(0.9±0.1)mm;颅骨表面下(7.6±0.1)mm，(7.5±0.1)mm，向两点各注射6-OHDA8μg(溶于4μl含质量分数为0.2%抗坏血酸的生理盐水中)，术后经连续4周(每周1次)腹腔注射阿朴吗啡(0.5mg/kg
体重)进行检测，共筛选出PD模型64只(旋转圈数均>210r/30min)，随机选取18只分为3组:模型组(6只)，治疗组(还原型谷胱甘肽合抗震止痉胶囊组，6只)，对照组(左旋多巴组，6只)。(2)假手术组:用上述同样方法向两坐标靶点注射4μl生理盐水(仅含0.2%质量分数的抗坏血酸)。
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1.2.2 给药方法 GSH注射剂用生理盐水配制成25mg/ml 的溶液(现配现用，剩余溶液不再使用)。抗震止痉胶囊内药物颗粒研成细末，并加入适量羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，将其混溶于适量生理盐水中，配成56mg/ml溶液(注意每次灌胃前将其摇匀)。左旋多巴注射剂可直接使用。模型组:予生理盐水10ml·kg -1 ·d -1 分别行腹腔注射和灌胃。 假手术组:予生理盐水10ml·kg -1 ·d -1 分别行腹腔注射和灌胃。治疗组:予GSH125ml·kg -1 ·d -1 腹腔注射，抗震止痉胶囊1.12g·kg -1 ·d -1 灌胃，注意二者给药时间需间隔2h以上。对照组:予L-dopa25ml·kg -1 ·d -1 腹腔注射，以上各组均分2次给药，共45天。
1.2.3 给药期间和给药后行为测试 注意观察各组给药期间的异常行为变化，并进行记录。给药结束次日再行旋转行为测试，同时进行录像保存。
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1.2.4 指标检测 将两组大鼠在1%戊巴比妥麻醉下，迅速断头处死，冰浴中快速剥离大脑，参照大鼠脑立体定向图谱，准确切取中脑黑质和尾状核头部脑组织，置于匀浆介质中，-60℃冰箱内保存待测，检测中脑黑质细胞的活性氧、MDA、GSH-Px及线粒体呼吸链复合体Ⅰ水平，检测尾状核头部DA、HVA及MAO-B水平，活性氧、MDA、GSH-Px及MAO-B水平均采用南京建成生物工程公司提供的试剂盒进行检测，线粒体呼吸链复合体Ⅰ参照报道的方法进行检测 [5] ，DA、HVA采用荧光分光光度法测定 [6] 。
1.2.5 统计学处理 数据均采用ˉx±s表示，计量资料治疗前后比较用t检验，采用SPSS(10.0版)统计软件进行统计，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 行为学观测 多数大鼠经APO诱导后于术后2～3周出现旋转行为，经连续6周检测，实验组90只大鼠中有64只恒定转向右侧且旋转速度>210r/30min，模型制作成功率71.1%。各组给药45天后次日行APO诱导，观测其旋转行为变化，并与给药前进行比较。结果见表1。
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表1 各组大鼠治疗前后旋转行为的比较 (略)
2.2 相关抗氧化指标检测结果 模型组GSH-Px和复合体Ⅰ含量均明显低于假手术组(P<0.05)，对照组的上述指标又明显低于模型组(P<0.05)，而治疗组的上述指标则明显高于对照组(P<0.05)。模型组活性氧和MDA水平明显高于假手术组(P<0.05)，对照组的上述指标又明显高于模型组(P<0.05)，而治疗组GSH-Px和复合体Ⅰ则明显高于对照组(P<0.05)，活性氧和MDA明显低于对照组(P<0.05)。结果见表2。
2.3 相关神经递质及其代谢指标检测结果 模型组DA、HVA及DA/HVA水平均明显低于假手术组，而MAO-B活性则明显高于假手术组，对照组的上述指标均明显高于模型组，治疗组的DA、HVA水平虽低于对照组，且MAO-B活性亦低于对照组，而DA/HVA则明显高于对照组(以上P均<0.05)。结果见表3。
表2 各组黑质区GSH-Px、复合体Ⅰ、活性氧及MDA含量的比较 (略)
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表3 各组尾状核头部MAO-B、DA、HVA及DA/HVA水平的比较 (略)
3 讨论
3.1 GSH合抗震止痉胶囊对PD模型大鼠旋转行为、神经递质及其代谢的影响 GSH广泛存在于哺乳动物体内，是细胞内最主要的巯基和含量丰富的小分子三肽化合物，它参与细胞许多功能活动，如拮抗外源性毒物、细胞内许多化合物代谢、半胱氨酸的储存与运输、拮抗氧自由基损伤、调节机体免疫功能及抑制细胞凋亡等，并在细胞循环调节和温度耐受等方面发挥重要作用。GSH是机体内自由基防御系统中的一个重要物质，它能有效清除生物氧化产生的自由基，维持细胞内环境的稳定 [7] ，并在使暴露于氧化环境的组织免受自由基损害方面起重要作用 [8] 。此外，GSH在对抗氧自由基过氧化并抑制由此引发的细胞凋亡、坏死及自稳态改变等方面亦发挥重要作用 [9] 。有研究发现，PD病人黑质区和苍白球内GSH含量有明显降低，而在多系统萎缩(MSA)或进行性核上性麻痹(PSP)病人黑质中GSH含量则无明显改变，这表明PD黑质GSH含量降低具有疾病和部位选择性，说明GSH在PD病理变化中起重要作用 [10] 。由于PD患者GSH耗竭程度与神经元脱失程度之间存在正相关，故我们认为，PD很可能是一种多原因促诱发的神经变性性疾病，在其病程中氧化反应异常与自由基生成增多可能是其不可逆性进展的唯一解释。
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有研究发现，首乌、肉苁蓉、黄芪、白术均可通过抑制脑MAO-B活性以延缓脑功能的衰老[11～14] 。实验表明，丹参酮Ⅱ A 磺酸钠对肌张力可产生明显抑制作用 [15] 。天麻可显著提高动物尾状核和脑干内DA含量，影响中枢不同脑区Ach水平 [16] 。实验观察到钩藤碱能使培养的大鼠脑片DA释放增加 [17] 。
6-OHDA毁损的模型多无PD病人特有的静止性震颤等典型表现，而主要表现为其本身特有的行为学改变，即旋转行为。对于旋转行为的发生，一般认为6-OHDA选择性的损毁注射区NDN，DA含量减少。并且使注射同侧尾、壳核内DA能神经纤维末梢溃变，同侧黑质-纹状体通路被破坏，纹状体内神经元失去DA能神经支配，其DA受体则代偿性大量增加，且敏感性增加。当给予外源性DA受体激动剂如阿朴吗啡后，则可以与损伤侧尾、壳核内大量增加 的DA受体结合，出现受体超敏现象，导致动物行为的不对称，动物损伤侧反应强于健侧而无法保持平衡，使其向对侧(健侧)旋转，旋转的频率大致与NDN受损程度一致。
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在给药45天后，左旋多巴组大鼠旋转行为显著改善，无疑与其直接增加毁损区DA含量有关，同时发现GSH合抗震止痉胶囊亦可使大鼠旋转行为明显改善(P<0.05)，可能与首乌、肉苁蓉、黄芪、地龙等能明显降低MAO-B活性，提高DA等单胺类神经递质含量，增加大鼠纹状体DA/HVA的比值等有关。亦有报道 [18，19] 发现GSH能促进多巴胺的合成底物进入黑质纹状体系统多巴胺能神经元，促进神经营养因子作用于NDN，提高NDN活性。在黑质-纹状体多巴胺能神经通路突触前膜上分布有NMDA受体，GSH对NMDA受体具有调节作用，GSH可能通过这一途径而改善黑质-纹状体系统功能 [20] 。
3.2 GSH合抗震止痉胶囊对PD模型大鼠黑质ROS、MDA及GSH-Px的影响 ROS既包括各种氧自由基如·OH和O 2 ·- 等，同时也包括与各种自由基行为密切相关的非自由基成分，如H 2 O2 、 1 O 2 及次氯酸等。它可引发多不饱合脂肪酸(PUFA)产生脂质氧化反应，对蛋白质、DNA、RNA及多糖高分子物质等产生氧化、交联、变性和降解，影响细胞的功能，甚至导致细胞死亡。MDA是过氧化脂质(LPO)的降解产物，MDA含量可以反映LPO的水平。LPO可对膜的结构产生严重损害，影响膜的功能。GSH-Px主要位于线粒体内，特异性地催化GSH对H 2 O 2的还原反应，从而起到保护细胞结构和功能完整的作用，虽然GSH-Px不能直接清除自由基，但可清除H 2 O 2 和LPO，减少自由基的生成。GSH和GSH-Px是脑内最重要的自由基清除系统。
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目前国内外有关脑内GSH的来源及GSH透过血脑屏障的可能途径等方面的研究报道较少。Kannan等 [21] 采用颈动脉注射技术，发现大鼠脑组织，能够稳定的吸收 35 S标记的GSH，而且其吸收指数与是否应用不可逆的γ-谷氨酰转肽酶抑制剂阿西维辛无明显关系，被吸收的放射性主要以GSH的形成存在(>83%)，表明GSH是将一种可溶性的特殊机制通过血脑屏障的。Sechi等 [22] 在临床研究中发现，将GSH(600mg×2/d，共30天，静脉注射)应用于9例早期未经治疗的PD病人，所有病人临床症状均明显改善，运动不能症状下降42%，停药后其临床疗效可维持2～4个月。我们已在以往临床研究中发现GSH合抗震止痉胶囊对常规治疗疗效明显衰减的PD患者具有一定的疗效，并能减轻机体的氧化应激损伤，提示对PD具有一定的神经保护性治疗作用 [22] 。
首乌可增强SOD的活力，明显地抑制脑组织的脂质过氧化 [23] 。肉苁蓉可提高机体的应激能力，直接或间接清除自由基对机体的损害，提高机体组织的抗氧化能力 [24] 。枸杞子可明显抑制血清LPO生成，使血中GSH-Px和红细胞SOD活力增高 [25] 。黄芪所含的黄芪总黄酮可对抗·OH所致的损伤，升高SOD活性，降低LPO，维持细胞的正常代谢 [26] 。白术可显著提高红细胞SOD活性，明显抑制脑MAO-B活性，并可直接清除自由基 [27] 。同样，当归亦有减少自由基产生或加速自由基清除作用 [28] 。丹参素具有清除O 2 ·- 和·OH的作用，并对大鼠脑缺血和再灌注损伤的线粒体具良好的保护效应，提高SOD、GSH-Px活性，具有很强的抗氧化作用 [29] 。天麻可提高SOD和GSH-Px活性，抑制脂质过氧化，并能促进机体DNA和蛋白质合成[30] 。
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本实验发现L-dopa在一定程度上降低了黑质的抗氧化能力，促进自由基的生成，使GSH-Px活性降低(P<0.05)，ROS、MDA水平升高(P均<0.05)。提示长期应用L-dopa能增加黑质区的氧化应激损伤，并可能在一定程度上加速NDN的进行性缺失。GSH合抗震止痉胶囊可显著降低ROS和MDA水平(P均<0.05)，增强GSH-Px活性(P<0.05)，从而增强机体的抗氧化能力，对NDN具有保护作用。
3.3 GSH合抗震止痉胶囊对PD模型大鼠黑质区线粒体呼吸链酶复合体Ⅰ的影响 线粒体呼吸链是体内氧自由基产生的主要部位，呼吸链中任何部位受到抑制都会使自由基产生增多，复合体Ⅰ缺陷会导致自由基生成增多，使线粒体膜脂质过氧化，损伤mtDNA，从而加重线粒体功能障碍，形成毒性循环，同时增多的自由基可漏出线粒体，损伤细胞的蛋白质、脂肪及核基因，导致细胞死亡。有人通过免疫组化方法分析发现PD患者黑质呼吸链酶复合体Ⅰ染色明显减弱，而且主要位于含有神经黑色素的神经元 [31] 。以后的研究也支持PD患者黑质中存在酶复合体Ⅰ的缺陷，并主要位于黑质致密部，网状部正常，而且酶复合体Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ及乌头酸酶活性正常，不同脑区的标本研究表明在大脑皮层、小脑、顶盖区、尾状核和苍白球等部位酶复合体Ⅰ及其他呼吸活性正常，不同脑区的标本研究表明在大脑皮层、小脑、顶盖区、尾状核和苍白球等部位酶复合体Ⅰ及其他呼吸链酶活性与正常对照组相比差异无统计学意义，提示PD患者黑质呼吸链酶复合体Ⅰ缺陷有高度解剖选择性 [32] 。
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本实验发现，模型组酶复合体Ⅰ含量明显低于假手术组(P<0.05)，与报道的结果基本一致。而L-dopa的应用则可进一步加重酶复合体Ⅰ的功能缺陷(与模型组比P<0.05)。其机制可能在于L-dopa长期应用过程中使活性氧大量生成，进一步加重了线粒体膜和DNA的损伤，导致电子传递链严重缺陷，活性氧产生增多，从而形成恶性循环，最终可能加速NDN的进行性缺失。GSH合抗震止痉胶囊能显著增加酶复合体Ⅰ含量(与模型组相比P<0.05)，因为GSH、首乌、肉苁蓉、黄芪、当归等均可直接或间接清除 自由基对机体的损害，提高机体组织的抗氧化能力和应激能力。而且全蝎还可最直接降低大鼠脑细胞线粒体的呼吸调节比(RCR)，二磷酸腺苷与氧之比(ADP/O)、氧商(QO 2 )及细胞色素氧化酶活性，增加膜脂质的流动性 [33] 。上述作用可协同拮抗自由基生成链的恶性循环。
综上所述，长期应用左旋多巴对帕金森病模型大鼠具有一定毒性作用，GSH合抗震止痉胶囊不仅能明显改善大鼠旋转行为，还可有效拮抗黑质区氧化应激损伤，保护线粒体呼吸链功能，推测可能在一定程度上延缓NDN进行性变性进程，其具体神经生物学机制仍有待进一步深入系统研究。
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基金项目:安徽省自然科学基金资助项目(编号:98JL086)
作者单位:1 215500扬州大学医学院附属常熟医院神经内科
2 230031安徽中医学院一附院神经内科
(编辑 秋实), 百拇医药