当前位置: 首页 > 医学版 > 期刊论文 > 中华医药荟萃 > 中华中西医杂志 > 论著
编号:10396204
复方参七汤对人结肠癌细胞接种裸鼠肝转移作用的实验研究
http://www.100md.com 中华中西医杂志 2003年第4卷 第4期
     【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)04-0491-03

    Experimental study of the effect of compound Shenqitang on nude mice with liver metastases

    Lu Fei,Shen Hongxun,Qian Jingjing,et al.

    Department of General Surgery,Affiliated Hospital of Nantong Medical College,Nantong226001.

    【Abstract】 Objective To establish a colonic adenocarcinoma liver metastases model for experimental study of the effect of compound shenqitang on nude micewith liver metastases.Methods Liver metastases were established by intrasplenicinjection of coloinc adenocarcinoma cells(LS174t)with1×10 6 cells in0.1ml so
, http://www.100md.com
    lution in24BALB/c nude mice which were divided into two groups randomly.After five minutes,the spleen of the mice was resected.Granˉular forage with compound shenqitang was fed in experimental group and granular forage without compound shenqitang was fed in control group daily.After three weeks every mouse was weighted and killed,blood of the mice should be colˉlected.The weight,size and the number of the liver metastatic lesions were studied,every carcinoma node should be weighted,specimens were fixed by formalin and embedded by paraffin,all slices with a thickness of4nm were studied histologically.nm23H 1 -NDPK expression in 24nude mice with liver metastases from colon carcinoma was examined immunohistochemical(sp)by using antinm23.Results All mice inoculated with ls174t cell lines developed liver metastases,other organic metastases were’tobserved.The pathological results showed that tumour cells of liver metasˉtases accorded with poorly differentiated human colonic adenocarcinoma.In experimental group the growth weight(4.12±0.53g)was significantly higher than that(3.21±0.59g)in control group(P<0.05).In experimental group the number(2.42±0.99n)and the weight(63.67±21.29mg)of liver metastases were significantly lower than those(4.17±1.99n and94.32±37.86mg)in control group(P<0.05).In experimental group nm23H 1-NDPK positive expresˉsion rate(66.7%)significantly higher than that(16.7%)in control group(P<0.05).Conclusion Compound Shenqitang could effectively affect the development of liver metastasis carcinoma and increase the positive expression rate of nm23H 1 -NDPK significantly in experimental mice group.
, 百拇医药
    Key words colonic carcinoma liver metastases nude mice model nm23-H 1 compound shenqitang

    大肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤,其发病率在各种恶性肿瘤中占第二位,大肠癌根治术后,肝转移的发生率为40%~50%;而死于肝转移达60%~90%。为了研究防治结肠癌肝转移,本研究建立人结肠癌细胞接种裸鼠肝转移模型;观察复方参七汤对人结肠癌细胞接种裸鼠肝转移的作用。现报告如下。

    1 材料和方法

    1.1 瘤源 人结肠腺癌LS174t细胞株购于中科院上海细胞库。

    1.2 实验动物 24只(4~6周龄)裸小鼠购于中科院上海实验动物中心。

    1.3 LS174t细胞悬液的制备 LS174t细胞采用RPMI-1640完全培养基培养,完全培养基中含10%小牛血清,青霉素100mg/ml和链霉素0.1mg/ml。置于37℃含5%CO 2 培养箱内,取对数生长期的细胞,用0.25%胰蛋白酶(含0.01%EDTA)消化。制成细胞悬液浓度为0.1ml,含细胞数1×10 6 个,以台盼蓝测定细胞活力在95%以上。
, http://www.100md.com
    1.4 中药复方参七汤 沈洪薰教授的经验方,由当归、木香、陈皮、甘草、茯苓、人参、黄芪、参三七、半边莲、半枝莲、制川乌、制草乌、炒谷芽和炒麦芽组成。每帖中药煎成200ml,配制颗粒饲料。

    1.5 动物实验 实验组和对照组裸鼠各12只。裸鼠经腹腔注射1%戊巴比妥钠,0.15~0.2ml(40mg/kg)麻醉成功后,固定在实验台上,无菌条件下于左肋缘下0.5cm处切开皮肤,打开腹腔,显露脾脏。用4号针将0.1ml细胞悬液缓慢注入脾脏下极的包膜下,拔出针头,于注射点用75%酒精棉球压迫出血点,并起杀死外渗的肿瘤细胞作用,5min后将脾脏切除,腹壁全层缝合,置于SPF动物房中继续喂养。实验组每天喂以含0.6ml/20g体重复方参七汤颗粒饲料,对照组裸鼠喂以普通颗粒饲料。

    1.6 观察指标

    1.6.1 大体观察 密切观察裸鼠的生长变化,每天记录裸鼠体重、摄食量及活动。喂养3周后处死,处死前抽取各组裸鼠心脏血,检查肝转移癌结节数目,挖出各个癌结节并称癌重(分析天平精确1/10000g)。
, 百拇医药
    1.6.2 组织学检查 标本经10%福尔马林固定,石蜡包埋切片,HE染色,光镜观察癌组织形态。

    1.6.3 免疫组化(S-P法)检测肿瘤转移抑制基因 nm23H 1 -NDPK(福州迈新试剂盒)将结肠癌肝转移组织石蜡切片经脱蜡水化,H 2 O 2 阻断,血清封闭,加nm23抗体,4℃水箱孵育过夜,生物素标记二抗,链菌素亲生物蛋白一过氧化物酶溶液,DAB显色,阴性对照用TBS替代一抗。肿瘤细胞阳性表达以细胞浆内出现明显的棕色颗粒沉淀为标准,切片中超过20%肿瘤细胞阳性表达,则定为肿瘤转移抑制基因nm23H 1 -NDPK反应阳性。

    1.7 统计学处理 t检验或确切概率法(P<0.05)。

    2 结果

    2.1 复方参七汤对裸鼠的体重和形态的影响 实验组裸鼠无1只死亡,接种初期活跃如常,体形无改变,2周后,大部分生长良好,未发现恶液质,实验前后体重增长值为(4.12±0.53)g。对照组裸鼠无1只死亡,接种初期活跃如常,体形无改变,但2周后,大部分出现消瘦,精神差,摄食减少,实验前后体重增长值为(3.21±0.59)g。实验组较对照组的体重增加显著(P<0.05),见表1。
, http://www.100md.com
    表1 复方参七汤对裸鼠实验前后的体重变化(g,ˉx±s) (表略)

    2.2 复方参七汤对裸鼠肝转移数目的影响 两组裸鼠肝表面均发现有大小不等(0.2~0.7cm)的灰白色的肝转移癌结节,肝转移率均为100%。实验组转移数目为2.42±0.99,对照组转移数目为4.17±1.99,实验组的癌结节数明显少于对照组(P<0.05),见表2。

    表2 复方参七汤对裸鼠肝转移癌数目的影响 (ˉx±s)组 (表略)

    2.3 复方参七汤对裸鼠肝转移癌重及癌重/肝重的影响 两组裸鼠分别称取肝重及其所分离的癌结节重量作比较,实验组与对照组裸鼠肝重分别为(714.75±22.30)mg和(718.83±21.54)mg(P>0.05);实验组裸鼠的癌结节重(63.67±21.29)mg明显小于对照组(94.32±37.86)mg(P<0.05);实验组的癌重/肝重为(8.9±3.1)%明显小于对照组(13.21±5.3)%,(P<0.05)。见表3。
, http://www.100md.com
    表3 复方参七汤对裸鼠肝转移癌灶重及癌重/肝重的影响 (mg,ˉx±s)(表略)

    2.4 病理组织学变化

    实验组肝转移癌组织有凝固性坏死,组织结构不清,伴有炎细胞浸润,部分癌结节边缘存留少量癌组织,小片状癌巢等,见图1。对照组的肝转移癌细胞呈团块状分布,细胞体积较大,核大不规则,核仁明显,间有小腔样结构,癌组织无坏死性改变,见图2。两组均呈人结肠癌低分化腺癌表现,其它脏器未发现转移病灶。

    2.5 复方参七汤对裸鼠肝转移组织中肿瘤转移抑制基因nm23H 1 的影响 见图3、4。实验组裸鼠肝转移癌组织中nm23H 1 -NDPK阳性表达率为66.7%(8/12)明显高于对照组nm23H 1 -NDPK阳性表达为16.7%(2/12),P<0.05。见表4。

    表4 复方参七汤对裸鼠肝转移组织中nm23-H 1 的影响 (表略)
, 百拇医药
    3 讨论

    3.1 建立人结肠癌细胞株裸鼠肝转移模型实验性结肠癌肝转移模型按动物种类分为裸大鼠、裸小鼠、大鼠和小鼠等;按细胞来源分为人癌细胞株和动物癌细胞株;按接种瘤细胞株途径分为脾内、门静脉内、回结肠静脉、盲肠壁内、肝脏注入等;脾脏接种瘤细胞株后是否保留脾脏,可分为脾切除和脾保留法。本研究经脾脏注入LS174t细胞株,5min后脾切除,成功地建立人结肠癌细胞株裸鼠肝转移模型。肝转移率达100%。无论在对照组或实验组裸鼠肝表面均发现有大小不等(0.2~0.7cm)的灰白色肝转移癌结节,病理组织学显示裸鼠肝转移癌灶有结肠癌(低分化癌)表现(图1,2)(图略)。

    3.2 nm23H 1 -NDPK可作为人结肠癌裸鼠肝转移预测基因 nm23基因是肿瘤转移抑制基因,由Steeg-PS等从K1735鼠黑色素瘤细胞株分离出来的。nm23基因的等位基因缺失、突变和低表达与多种人类肿瘤转移相关。nm23基因定位人染色体17q21-23区域,nm23基因包括nm23H 1和nm23H 2 两亚型。nm23H 1 mRNA水平与肿瘤转移更为密切,其编码产物二磷核苷激酶(NDPK)。关于nm23基因在结直肠癌肝转移发生的作用和重要性尚有争论。Sarris M;Lee CS认为nm23基因在肿瘤转移发生的作用和重要性是令人怀疑的;而Berney C R,Fisher RJ,Yang J认为nm23可作为结直肠癌肝转移的预测因子,研究发现结直肠癌患者肝转移发生的危险性与nm23NDPK表达有关。nm23的价值仅对结直肠癌根治性切除患者有意义,特别是Dukes’B期患者,可确定肝转移发生危险性增加,这些患者应考虑辅助化疗影响结直肠癌预后或有人染色体17q21-23基因组的变化或有nm23NDPK表达的变化。Yamaguchi A研究“结直肠癌肝转移基因变化和它们的临床应用”一文中指出nm23可能对抑制肝转移起作用。本实验研究证实nm23H 1 -NDPK可作为人结肠癌细胞株接种裸鼠肝转移的预测基因。其一,本实验研究建立了人结肠癌细胞株接种裸鼠肝转移模型,对照组12只裸鼠均有肝转移癌灶,其病理组织学显示有人结肠癌(低分化癌)表现,具备了实验研究的条件;其二,对照组裸鼠肝转移nm23H 1 -NDPK低表达率为83.4%(10/12),阳性表达率仅为16.6%(2/12),这符合肿瘤转移抑制基因nm23H 1 -NDPK多呈低表达表现;其三,实验组裸鼠肝转移nm23H 1 -NDPK阳性表达率为66.7%(8/12)明显高于对照组16.6%(2/12),提示复方参七汤具有促进裸鼠肝转移nm23H 1 -NDPK阳性表达的作用。
, 百拇医药
    3.3 复方参七汤能抑制人结肠癌细胞株裸鼠肝转移 外科手术治疗大肠癌仍然是主要的治疗方法,但仅适用于早期和部分中期患者,有其一定的适应证,且无法避免手术后的复发和转移,术后采用综合治疗可提高疗效。外科手术配合中医中药治疗有三:(1)手术前应用中医中药作为术前准备,改善患者某些脏器功能;(2)术后短期应用中医中药,改善或减轻患者术后的某些不良反应以恢复体质;(3)手术恢复后长期应用中医中药,除改善患者体质外,还可避免或减少复发、转移,提高远期效果。复方参七汤是由参三七、人参、黄芪、当归、陈皮、木香、川草乌、半枝莲、半边莲、甘草、谷麦芽等组成。方中三七性味甘微苦、温。《本草求真》云:“入肝、胃,兼入心、大肠经”,具有止血、散瘀、消肿定痛功效,三七与人参同用,补气养血,活血消积,祛邪不伤正气,补气不恋邪,共为君药。制川乌有毒,性味热,辛、苦。归心、肝、肾、脾经,具有祛风除湿,温经止痛功效。制草乌辛、热、有大毒,入肝、脾经。祛风湿,散寒止痛消肿。川草乌同用,能增强三七散瘀,通经络,开顽痰,消肿结定痛之效。黄芪性味甘,微湿,归肺、脾经,具有补益中气功效。当 归性味甘,辛温,具有补血和血,调经止痛,润肠通便功效,与黄芪相伍益气生血,木香、陈皮、谷麦芽行气和胃,能助生化之源,增加三七、人参益气养血,活血化瘀散结之力,同时与制川草乌相伍,又能祛邪而不伤正气,共为臣药。半枝莲性味苦寒,具有清热解毒,散瘀止血、定痛功效。半边莲性味甘、淡、平,具有利水、解毒,消肿功效。半枝莲、半边莲与其它解毒散结活血药同用,可增强其消散肿结之力,同时可制川草乌大辛大热之性。缓解其毒性,共为佐药,甘草为使药,不仅健脾益气,解毒,还能调和诸药,以奏行气活血、解毒散结、益气养血之功效。在临床上,我们治疗大肠癌术后气血虚弱,或气滞血瘀或肿结之痛。长期服用,除改善病人体质外,还可能避免或减少复发转移,提高远期效果。本研究证实复方参七汤对人结肠癌LS174t细胞株接种裸鼠肝转移模型有抑制作用,表现为:(1)实验组裸鼠实验前后体重增长为(4.12±0.53)g,明显高于对照组(3.21±0.53)g,P=0.0006;(2)实验组裸鼠肝转移癌结节的数目为2.42±0.99个,明显低于对照组4.17±1.99个,P=0.0125;(3)实验组裸鼠肝转移癌重(63.67±21.29)mg明显低于对照组(94.32±37.86)mg,P=0.0238;(4)实验组裸鼠肝转移癌重/肝重(8.9±3.1)%明显低于对照组(13.2±5.3)%,P=0.0241;(5)实验组裸鼠肝转移癌组织中肿瘤转移抑制基因nm23-H 1 阳性表达率为66.7%明显高于对照组16
, 百拇医药
    .7%,P=0.036。

    参考文献

    1 Ekberg H,Andersbern R,Trambreg KG,et al.Pattern of recurrence in liverresection for colorectal secondaries.World J Surg,1987,11(4):541-547.

    2 Bengstsson G,Carlsson G,Hafstrom I,et al.Nature history of patient withuntreated liver metastases from colorectal cancer.J Ann Surg,1981,141(5):586-589.

    3 沈洪薰,陈莉,周树军,等.复方参七汤治疗胃癌的临床与实验研究.华人消化杂志,1998,6(10):837-840.
, 百拇医药
    4 沈洪薰,王志伟,周树军,等.复方参七汤抑制胃癌的研究.中华新医学,2001,2(6):484-486.

    5 葛海燕,左国华,高明发. 131 I标记抗CEA单抗预防人结肠癌肝转移的实验研究.第三军医大学学报,2000,5,22(5):430-432.

    6 Sarris M,Lee C S.nm23protein expression in colorectal carcinoma metastasis in regional lymph nodes and the liver.EurJ Surg Oncol,2001,27(2):170-174.

    7 Berney C R,Fisher R J,Yang J,et al.Genomic alterations(LOHMI)on chromosome17q21-23and prognosis of sporadic colorectal cancer.Int J Cancer,2000,89(1):1-7.

    8 Yamaguchi A.Genetic changes in liver metastasis of colorectal cancer and their clinical application.Nippon Geka Gakkai Zasshi,2001,102(5):370-375.

    (编辑 秋实), 百拇医药(陆飞)