RCA家族SCRs多重序列比较及DAF 同源限制作用机制的初步探讨
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中华中西医杂志 2003年5月 第4卷 第9期
【摘要】 目的 探讨RCA家族SCR结构与功能的关系。方法 采用Vector NT1软件包提供的序列对比软件分别对RCA家族具有抑制补体活化的SCR以及不同种属DAF的SCRs序列进行多重序列比较。结果 有三个位点变异程度较高。位点Ⅰ所示区域变异程度最高，Ⅱ、Ⅲ次之。上述三个位点的同源区域中，猪和人DAF在位点Ⅰ、Ⅲ变化较大，而在位点Ⅱ较为保守。结论位点Ⅰ、Ⅲ可能与DAF的同源限制作用有关，并且可能与SCR和C3b/C4b的结合有关。
关键词 同源重复序列 衰变加速因子 多重序列比较 同源限制
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)09-1281-02
Multiple sequence comparison of RCA family and primary
exploration of the mechanism of homologous restriction of DAF
, http://www.100md.com
Guo Bo，Zheng Ping，Zou Qiang，et al.
Institute of Immunology，Third Military Medical University，Chongqing400038.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between structure and function of RCA family.Methods Multiple sequence comparison of RCA family and DAF SCRs across species were analyzed by using VectorNT1softˉware.Results Variations were found in three domains to different degrees.Variation degree in domianⅡandⅢwas secondary to that in domainⅠ.There were great variations in both DomainⅠandⅢbetween pig and human，while amino acids were relatively conservativein domainⅡ.Conclusion DomainⅠandⅢmay related to the homologous restriction effect of DAF across species and the binding of SCR to C3b/C4b.
, 百拇医药
Key words SCR DAF multiple sequence comparison homologous restriction
表达人DAF(Decay acceleration factor)的转基因猪用于防治异种器官移植超急性排斥反应的实验已获得初步成功 [1] 。DAF属于补体激活调节因子(Regulators of complement activation，RCA)家族成员 [2] 。已知该家族成员均通过SCRs(short consensus repeats)与C3b、C4b作用来调节补体前端反应中C3/C5转化酶的活性。目前不同RCA分子中抑制补体活化的SCR已基本清楚，因而通过对RCA家族不同成员所具有的抑制补体活化的SCR进行多重序列比较，可帮助了解SCR结构与功能的关系。此外，DAF是重要的同源限制因子 [3] ，通过对不同种属DAF的SCRs多重序列比较，有可能对同源限制的机制有初步的认识。获得的结果可为选择合适的突变位点对DAF进行体外进化提供参考。本文分别从以上两方面对SCRs多重序列进行了比较。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 蛋白质序列 人DAF、CR1、H因子、MCP、C4bq序列检索自瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics，SIB)提供的Swiss-Prot蛋白质数据库(http://expasy.hcuge.ch/sprot/index.htm)，索取号分别为P08174、P17927、P08603、P15529、P04003。检索自该数据库的动物DAF序列有非洲类人猿(Pongo，P49457)、小鼠(mouse，Q61475)、豚鼠(guinea pig，Q60401)。其它动物的DAF序列检索自NCBI核酸数据库(national Center for biotechnology information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，包括狒狒(baboon，AF149762)、非洲的小人猿(chimpanzee，AF149760)、大猩猩(gorilla，AF149759)、红卷尾赤猴(Erythrocebus patas，AF149767)、恒河猴(rhesus，AF149763)、猪(Pig AF228061)、大鼠(Rat AB026900)。
, 百拇医药
1.2 处理方法 多重序列比较采用Vector NT1Version6.0AlignX○ R 软件包。
1.3 蛋白质的二级结构数据及预测 HFH中SCR5、SCR15、SCR16及VCP中SCR3、SCR4的二级结构数据检索自美国Brookhaven(Brookhaven National Laboratory)提供的PDB蛋白质结构数据库(http://www.pdb.bnl.gov)。预测方案见参考文献 [6] 。
2 结果
2.1 人RCA家族SCRs多重序列比较 DAF属于补体激活调节因子(RCA)家族成员，该家族的成员还有MCR、H因子、C4bp、CR1和CR2。RCA家族成员中，除了CR2不通过与C3b或/和C4b作用而发挥补体调控作用外，其它5个成员是以这两个补体分子为配体 [2] 。研究发现，它们通常需要3个SCRs才能发挥较好的补体调控作用。因而我们选择这5个分子中具有活性的3个连续的同源SCR的序列进行同源性比较。比较结果如图1所示。位点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ为人CR1中已经证实的与活性有关的重要氨基酸所在区域。
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2.2 不同种属DAF的SCRs多重序列比较 DAF是同源限制因子，猪的DAF不能有效控制人补体的活化，从而发生超急性排斥反应。这是异种移植中研制表达人DAF的转基因猪的原因。灵长类动物之间的亲缘关系较近，同源限制作用相对较弱。这也是选用灵长类动物作为异种移植实验动物的原因。灵长类动物与非灵长类动物之间的同源限制作用相对却较强。这种差异可能与DAF的差异有关。我们对已经知道序列的不同种属DAF的SCR的氨基酸序列进行比较。结果如图2所示。
由于异种移植中通常选用猪作为器官的供体，我们单独对它们SCR2-3的序列进行比较，以期了解与CR1活性位点同源区域的氨基酸变化情况。比较结果见图3。
2.3 不同SCR二级结构的比较 见图4。
3 讨论
3.1 人RCA家族SCRs多重序列比较 RCA家族成员通常需要3个SCRs才能发挥较好的补体调控作用，因而我们选择这些RCA分子中具有活性的连续的3个SCR进行同源性比较。结果发现，不同RCA分子相对应的SCR中，多数位置上氨基酸序列是保守的，保守氨基酸所占的比例达50%以上。目前，人CR1的关键性氨基酸组成已经研究得比较清楚 [4，5] 。CR1的SCR1-3被认为只有衰变加速活性，对C3b、C4b的亲和力较强。而SCR8-10却相反。在三个相连的SCR中存在三个位点，分别命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，如果将SCR1-3的氨基酸突变为SCR8-10相同位置的氨基酸，可以提高其与C3b、C4b的亲和力。比较发现，位点Ⅰ所示区域变异程度最高，Ⅱ、Ⅲ次之。
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3.2 不同种属DAF的SCRs多重序列比较 对序列已知的不同种属DAF的SCR氨基酸序列进行比较。结果发现，灵长类动物之间的同源性相当高，部分达98%以上，如人和大猩猩、黑猩猩的DAF。而非灵长类之间及非灵长类与灵长类之间的DAF分子同源性就显著降低。在上述三个位点的同源区域中，猪和人DAF在位点Ⅰ、Ⅲ变化较大，而在位点Ⅱ较为保守，提示位点Ⅱ与DAF的同源限制作用无关。其中最突出的特征是，除了保守性氨基酸，在位点Ⅰ，人DAF为不带电核的氨基酸(QPYIT)，而在猪的DAF中有两个为带正电荷的氨基酸(KSYSK)。位点Ⅲ中，人DAF同样为不带电的氨基酸(SSVQ)，而在猪的DAF中有两个为带负电荷的氨基酸(NDVE)。提示它们可能与DAF的同源限 制作用无关，但进一步的证据仍需来自实验的证实。
3.3 不同SCR二级结构的比较 为进一步了解保守氨基酸和非保守氨基酸在SCR的二级结构中所处的位置，依据二级结构已经清楚的分子的资料，以及本室前期对DAF二级结构的预测结果 [6] ，我们在对猪SCR3、人CR1的SCR2、SCR9的一级结构比较的基础上，与以上分子进行序列对准。结果发现大部分保守性氨基酸残基分布于β片层之中。而前面提到的位点Ⅰ、Ⅲ分别位于第2和第6个袢中(β片层与β片层之间的序列)，通常认为二级结构中β片层与分子基本结构的形成有关，而袢与其他分子的接触有关，所以上述结果提示这两个位点可能对SCR与C3b/C4b的结合有关。
, 百拇医药
综上所述，位点Ⅰ、Ⅲ的结果可为选择合适的突变位点对DAF进行体外进化提供参考。(本文图文略)
参考文献
1 Loss M M，Przemeck J，Schmidtko H A，et al.Long-term survival of cynomolgus monkeys following pig-to-primate kidney xenotransplanˉtation using h-DAF transgenic donor organs.Transplant.Proc，2000，32(5):1095-1096.
2 Liszewski M K，Farries T C，Lublin D M，et al.Control of the compleˉment system.Adv.Immunol，1996，6:1201-1283.
, http://www.100md.com
3 Yamamoto H，Blaas P，Nicholson W A，et al.Homologous species reˉstriction of the complement-mediated killing of nucleated cells.Imˉmunology，1990，70(4):422-426.
4 Krych G M，Hauhart R E，Subramanian V B，et al.Decay accelerating activity of complement receptor type1(CD35).Two active sites are reˉquired for dissociating C5convertases.J Biol Chem，1999，274(44):31160-31168.
5 Krych M R，Hauhar Athinson J P.Structure-function analysis of the active sites of complement receptor type1.J.Biol Chem，1998，273(15):8623-8629.
6 邹强，谢佩蓉，李华，等.人衰变加速因子的二级结构与B细胞表位预测.中国免疫学杂志，2001，17(7):388-392.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30080032，30128019)
作者单位:400038重庆第三军医大学全军免疫学研究所
(编辑 曲全), 百拇医药(郭波)
关键词 同源重复序列 衰变加速因子 多重序列比较 同源限制
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)09-1281-02
Multiple sequence comparison of RCA family and primary
exploration of the mechanism of homologous restriction of DAF
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Guo Bo，Zheng Ping，Zou Qiang，et al.
Institute of Immunology，Third Military Medical University，Chongqing400038.
【Abstract】 Objective To investigate the relationship between structure and function of RCA family.Methods Multiple sequence comparison of RCA family and DAF SCRs across species were analyzed by using VectorNT1softˉware.Results Variations were found in three domains to different degrees.Variation degree in domianⅡandⅢwas secondary to that in domainⅠ.There were great variations in both DomainⅠandⅢbetween pig and human，while amino acids were relatively conservativein domainⅡ.Conclusion DomainⅠandⅢmay related to the homologous restriction effect of DAF across species and the binding of SCR to C3b/C4b.
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Key words SCR DAF multiple sequence comparison homologous restriction
表达人DAF(Decay acceleration factor)的转基因猪用于防治异种器官移植超急性排斥反应的实验已获得初步成功 [1] 。DAF属于补体激活调节因子(Regulators of complement activation，RCA)家族成员 [2] 。已知该家族成员均通过SCRs(short consensus repeats)与C3b、C4b作用来调节补体前端反应中C3/C5转化酶的活性。目前不同RCA分子中抑制补体活化的SCR已基本清楚，因而通过对RCA家族不同成员所具有的抑制补体活化的SCR进行多重序列比较，可帮助了解SCR结构与功能的关系。此外，DAF是重要的同源限制因子 [3] ，通过对不同种属DAF的SCRs多重序列比较，有可能对同源限制的机制有初步的认识。获得的结果可为选择合适的突变位点对DAF进行体外进化提供参考。本文分别从以上两方面对SCRs多重序列进行了比较。
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1 材料与方法
1.1 蛋白质序列 人DAF、CR1、H因子、MCP、C4bq序列检索自瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics，SIB)提供的Swiss-Prot蛋白质数据库(http://expasy.hcuge.ch/sprot/index.htm)，索取号分别为P08174、P17927、P08603、P15529、P04003。检索自该数据库的动物DAF序列有非洲类人猿(Pongo，P49457)、小鼠(mouse，Q61475)、豚鼠(guinea pig，Q60401)。其它动物的DAF序列检索自NCBI核酸数据库(national Center for biotechnology information，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，包括狒狒(baboon，AF149762)、非洲的小人猿(chimpanzee，AF149760)、大猩猩(gorilla，AF149759)、红卷尾赤猴(Erythrocebus patas，AF149767)、恒河猴(rhesus，AF149763)、猪(Pig AF228061)、大鼠(Rat AB026900)。
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1.2 处理方法 多重序列比较采用Vector NT1Version6.0AlignX○ R 软件包。
1.3 蛋白质的二级结构数据及预测 HFH中SCR5、SCR15、SCR16及VCP中SCR3、SCR4的二级结构数据检索自美国Brookhaven(Brookhaven National Laboratory)提供的PDB蛋白质结构数据库(http://www.pdb.bnl.gov)。预测方案见参考文献 [6] 。
2 结果
2.1 人RCA家族SCRs多重序列比较 DAF属于补体激活调节因子(RCA)家族成员，该家族的成员还有MCR、H因子、C4bp、CR1和CR2。RCA家族成员中，除了CR2不通过与C3b或/和C4b作用而发挥补体调控作用外，其它5个成员是以这两个补体分子为配体 [2] 。研究发现，它们通常需要3个SCRs才能发挥较好的补体调控作用。因而我们选择这5个分子中具有活性的3个连续的同源SCR的序列进行同源性比较。比较结果如图1所示。位点Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ为人CR1中已经证实的与活性有关的重要氨基酸所在区域。
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2.2 不同种属DAF的SCRs多重序列比较 DAF是同源限制因子，猪的DAF不能有效控制人补体的活化，从而发生超急性排斥反应。这是异种移植中研制表达人DAF的转基因猪的原因。灵长类动物之间的亲缘关系较近，同源限制作用相对较弱。这也是选用灵长类动物作为异种移植实验动物的原因。灵长类动物与非灵长类动物之间的同源限制作用相对却较强。这种差异可能与DAF的差异有关。我们对已经知道序列的不同种属DAF的SCR的氨基酸序列进行比较。结果如图2所示。
由于异种移植中通常选用猪作为器官的供体，我们单独对它们SCR2-3的序列进行比较，以期了解与CR1活性位点同源区域的氨基酸变化情况。比较结果见图3。
2.3 不同SCR二级结构的比较 见图4。
3 讨论
3.1 人RCA家族SCRs多重序列比较 RCA家族成员通常需要3个SCRs才能发挥较好的补体调控作用，因而我们选择这些RCA分子中具有活性的连续的3个SCR进行同源性比较。结果发现，不同RCA分子相对应的SCR中，多数位置上氨基酸序列是保守的，保守氨基酸所占的比例达50%以上。目前，人CR1的关键性氨基酸组成已经研究得比较清楚 [4，5] 。CR1的SCR1-3被认为只有衰变加速活性，对C3b、C4b的亲和力较强。而SCR8-10却相反。在三个相连的SCR中存在三个位点，分别命名为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，如果将SCR1-3的氨基酸突变为SCR8-10相同位置的氨基酸，可以提高其与C3b、C4b的亲和力。比较发现，位点Ⅰ所示区域变异程度最高，Ⅱ、Ⅲ次之。
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3.2 不同种属DAF的SCRs多重序列比较 对序列已知的不同种属DAF的SCR氨基酸序列进行比较。结果发现，灵长类动物之间的同源性相当高，部分达98%以上，如人和大猩猩、黑猩猩的DAF。而非灵长类之间及非灵长类与灵长类之间的DAF分子同源性就显著降低。在上述三个位点的同源区域中，猪和人DAF在位点Ⅰ、Ⅲ变化较大，而在位点Ⅱ较为保守，提示位点Ⅱ与DAF的同源限制作用无关。其中最突出的特征是，除了保守性氨基酸，在位点Ⅰ，人DAF为不带电核的氨基酸(QPYIT)，而在猪的DAF中有两个为带正电荷的氨基酸(KSYSK)。位点Ⅲ中，人DAF同样为不带电的氨基酸(SSVQ)，而在猪的DAF中有两个为带负电荷的氨基酸(NDVE)。提示它们可能与DAF的同源限 制作用无关，但进一步的证据仍需来自实验的证实。
3.3 不同SCR二级结构的比较 为进一步了解保守氨基酸和非保守氨基酸在SCR的二级结构中所处的位置，依据二级结构已经清楚的分子的资料，以及本室前期对DAF二级结构的预测结果 [6] ，我们在对猪SCR3、人CR1的SCR2、SCR9的一级结构比较的基础上，与以上分子进行序列对准。结果发现大部分保守性氨基酸残基分布于β片层之中。而前面提到的位点Ⅰ、Ⅲ分别位于第2和第6个袢中(β片层与β片层之间的序列)，通常认为二级结构中β片层与分子基本结构的形成有关，而袢与其他分子的接触有关，所以上述结果提示这两个位点可能对SCR与C3b/C4b的结合有关。
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综上所述，位点Ⅰ、Ⅲ的结果可为选择合适的突变位点对DAF进行体外进化提供参考。(本文图文略)
参考文献
1 Loss M M，Przemeck J，Schmidtko H A，et al.Long-term survival of cynomolgus monkeys following pig-to-primate kidney xenotransplanˉtation using h-DAF transgenic donor organs.Transplant.Proc，2000，32(5):1095-1096.
2 Liszewski M K，Farries T C，Lublin D M，et al.Control of the compleˉment system.Adv.Immunol，1996，6:1201-1283.
, http://www.100md.com
3 Yamamoto H，Blaas P，Nicholson W A，et al.Homologous species reˉstriction of the complement-mediated killing of nucleated cells.Imˉmunology，1990，70(4):422-426.
4 Krych G M，Hauhart R E，Subramanian V B，et al.Decay accelerating activity of complement receptor type1(CD35).Two active sites are reˉquired for dissociating C5convertases.J Biol Chem，1999，274(44):31160-31168.
5 Krych M R，Hauhar Athinson J P.Structure-function analysis of the active sites of complement receptor type1.J.Biol Chem，1998，273(15):8623-8629.
6 邹强，谢佩蓉，李华，等.人衰变加速因子的二级结构与B细胞表位预测.中国免疫学杂志，2001，17(7):388-392.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30080032，30128019)
作者单位:400038重庆第三军医大学全军免疫学研究所
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