雷公藤多苷对溃疡性结肠炎大鼠肠粘膜NO、SOD和MDA的影响
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)04-0494-03
Effect of tripterygium polyglycoside on NO，SOD and MDA in TNBS-induced colitis in rats
He Xiaofei，Li Junhua，Xu Ximing，et al.
Department of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Xianning Medical College，Xianning430071.
【Abstract】 Objective To observe the effects of tripterygium polyglycoside，(TⅡ)on lipid peroxidation in ulˉcerative colitis of rats.Methods Rat colitismodel was induced by2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)，The rats were randomly divided into4groups:normal group，model group，NS group and TⅡgroup，the activity of SOD and the levels of MDA and NO in all rats were detected respectively，the macroscopical and histological changes of the colon were evaluated also.Results In TⅡgroup，SOD activity was higher and NO，MDA levels was lower than that in model group，the inflammatory injury in TⅡgroup was slight in compare with model and NS group.There was significant difference between the TⅡgroup and the model group，NS group(P<0.01).Conclusion Tripterygium polyglycoside，TⅡhave protective effects on ulcerative colitis of rat by inhibiting lipid peroxidation.
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Key words ulcerative colitis tripterygium polyglycoside NO SOD MDA
溃疡性结肠炎(UC)发病近年在国内报道明显增多，但病因及发病机制迄今尚不明确。研究表明自由基及脂质过氧化反应代谢产物在UC发生、发展中起重要作用;雷公藤多苷(TⅡ)是从卫矛科植物雷公藤中提取的苷类制剂，具有较强的抗炎及免疫抑制作用，可能对UC具有一定的抗炎作用。本实验以三硝基苯磺酸(TNBS)诱导大鼠溃疡性结肠炎形成，观察雷公藤多苷对UC大鼠肠组织中的超氧化物歧化酶活性、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)及NO自由基含量的影响，探讨雷公藤多苷对UC的保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料 健康SD大鼠(由湖北省医学科学院实验动物中心提供)60只，雄性，体重150～200g，正常喂养;雷公藤多苷为福建中医药研究所产品，三硝基苯磺酸为Sigma公司产品，NO、SOD及MDA测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。
, 百拇医药
1.2 动物分组及模型制备 [3] 60只大鼠随机分为正常对照组、模型组、生理盐水(0.9%NS)组及雷公藤多苷(TⅡ)组等四组;正常对照组不作任何处理，模型组以三硝基苯磺酸灌肠，生理盐水组及TⅡ组分别以三硝基苯磺酸造模后给予生理盐水及雷公藤多苷灌胃。实验时SD大鼠术前禁食24h，自由饮水，乙醚麻醉，用一直径2.0cm长约12cm的硅胶管由肛门轻缓插入深约8c
m，实验组以含150mg/kg TNBS的等体积无水乙醇溶液缓慢推入结肠，让动物保持平躺自然清醒，0.9%NS组、TⅡ组造模后分别以生理盐水2ml/次，60mg/kg雷公藤多苷(溶解于2ml生理盐水中)灌胃，每日1次。3周后分别随机处死3只模型组及正常对照组大鼠，取结肠标本作病理检查，以确定造模成功。处死所有大鼠，取肛门至盲肠肠管(约8cm)，沿肠系膜纵轴剪开，用冷生理盐水冲洗干净后一部分以4.0%多聚甲醛固定，进行肉眼大体形态和组织学形态评分分级后将标本石蜡包埋切片，HE染色，结肠组织镜下评价炎症和溃疡;另一部分冲洗干净后-80℃冻存，用以肠组织氧化指标的检测。
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1.3 观察指标 冻存肠组织制成匀浆，以黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，硫代巴比妥酸比色法(TBA)测定MDA含量，NO含量测定采用酶标法;具体操作按试剂盒说明书(南京建成生物工程研究所提供)进行。
1.4 结肠组织损伤大体形态和组织学形态评分方法大体形态损伤评分指标包括粘连、局部充血、溃疡及炎症。粘连及充血按有无及轻重分别计0、1、2分，出现炎症、溃疡数目增加1个、溃疡面积>2cm时范围每增加1cm计分均加1。组织学指标包括溃疡、炎症、肉芽肿、纤维化及病变深度，按有无及轻重分别计0、1、2分，病变深度达粘膜下层、肌层、浆膜层分别计1、2、3分，各项相加得总分。
1.5 统计学处理 实验数据以ˉx±s表示，采用单因素方差分析，组间差异采用q检验，以P<0.01为有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠一般情况改变 造模鼠在TNBS灌肠12h后均出现腹泻，为黄色稀便和(或)肛周体毛被稀便粘染，第6～7d开始体重明显下降，毛色失去光泽，精神倦怠，活动及进食明显减少，模型组有2只大鼠死亡。雷公藤多苷灌胃后大鼠一般状况及消化道症状逐渐好转，用药1周后大便基本成形，无大鼠死亡，一般情况明显优于模型组及生理盐水组。
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2.2 雷公藤多苷对大鼠溃疡性结肠炎大体形态及组织学损伤的影响 模型组大鼠结肠标本表现为粘膜充血水肿、 溃疡形成，结肠组织与周围组织粘连，可见近端肠腔扩张。溃疡呈线状和灶状，周围可见粘膜增厚，肠腔狭窄。炎症及溃疡位于盲肠与肛门之间，病变从肛门端向上连续性发展，但逐渐减轻，以直肠、乙状结肠最为明显。光镜下可见溃疡及炎性渗出物，可见上皮细胞坏死、脱落，有淋巴组织增生，大量中性粒细胞浸润，可见数量不等的单个核细胞和嗜酸性粒细胞，也可见增生的纤维母细胞;雷公藤多苷组粘膜水肿少见，无溃疡和炎性渗出物，光镜下腺体排列整齐，仅见少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润，损伤指数明显低于模型组及生理盐水组(P<0.01)，见表1。
2.3 NO、SOD及MDA含量变化 与正常大鼠比较，UC大鼠的结肠粘膜组织中SOD活性显著下降(P<0.01)，NO和MDA含量显著上升(P<0.01)，雷公藤多苷组SOD明显高于模型组和生理盐水组，NO、MDA含量较模型组和生理盐水组明显下降(P<0.01)，见表2。
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表1 各组大鼠结肠大体形态和组织学损伤评分比较 (ˉx±s)(表略)
表2 各组大鼠结肠组织SOD活性及NO、MDA含量比较 (ˉx±s)(表略)
3 讨论
溃疡性结肠炎是肠道炎性疾病，肠道局部炎性损伤是其重要病理改变，而三硝基苯磺酸(TNBS)结肠炎仍是研究炎性肠道疾病(IBD)最常用的模型，TNBS诱导的溃疡性结肠炎具有类似人类IBD大体病理及组织学改变，并由免疫系统所介导;此外，该模型体现了急性炎症向慢性转化的动态过程，有利于评价药物疗效。
雷公藤多苷具有的较强抗炎作用及细胞和体液免疫抑制作用，已广泛用于类风湿关节炎、器官移植排斥反应、肾脏疾病及支气管哮喘等疾病的临床治疗，但雷公藤多苷对UC作用的报道较少，本实验在建立大鼠模型的同时用雷公藤多苷灌胃进行保护，发现雷公藤多苷组大鼠一般情况、肠粘膜组织大体形态及组织学损伤评分指数明显低于生理盐水组和模型组，表明雷公藤多苷对大鼠溃疡性结肠炎具有很好的保护作用。我们同时观察了大鼠肠组织中NO、MDA含量和SOD活性，探讨雷公藤多苷对UC的作用机制。
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NO是一种广泛存在于机体的生物活性物质，在体内参与诸多的病理生理过程。NO在UC的发病机制中的作用并未完全被确定。但可以肯定一氧化氮在UC炎症过程中的作用是双重的，在UC早期，NO可维持微循环的完整性，抑制血小板、白细胞在内皮细胞表面的粘附，积聚，防止血栓形成和内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞的相互作用，这一保护作用是通过增加靶细胞内5-环磷酸鸟苷(5-cGMP)浓度及抑制P-选择素基因表达完成的。而在UC中晚期，随着NO产生增多和积聚，它很容易在O 2 ·- 存在时转变为氧化能力更强的氧化亚硝酸，后者进一步分解为OH - 和NO，通过自由基链式反应导致含巯基蛋白和脂质过氧化，从而促进组织细胞损伤。
研究证明，机体在抗氧化系统削弱或OFR形成过量时，OFR除可直接损伤组织外，还通过触发细胞膜上的多链不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的链式反应并产生MDA等脂质过氧化物，引起细胞膜结构受损、炎症介质大量释放。SOD是存在于生物体内的重要的抗氧化酶系，能有效地清除氧自由基，催化超氧化自由基分解成H 2 O 2 ，进而在过氧化氢酶的作用下分解成H 2 O和氧分子，从而抑制肠组织中的脂质过氧化反应。许多学者认为UC体内，特别是肠粘膜组织局部SOD活性降低，清除OFR能力降低是导致OFR堆积造成肠粘膜损伤的重要机制之一，因此NO、MDA水平及SOD活性可间接反映机体的脂质过氧化反应和抗脂质过氧化反应的能力。本实验中大鼠肠组织大体形态和病理组织学变化表明造模成功，且结肠粘膜组织的SOD活性显著低于正常大鼠，同时NO、MDA水平显著高于正常大鼠，也支持了溃疡性结肠炎中自由基损伤的观点。
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实验结果同时表明，与生理盐水组和模型组相比，雷公藤多苷组大鼠肠组织中SOD含量明显上升，NO、MDA水平明显降低，说明雷公藤多苷有明显的抗氧化和抗脂质过氧化的作用，其对大鼠溃疡性结肠炎的保护作用可能与其抗氧化应激有关，本实验结果为雷公藤多苷临床用于治疗或辅助治疗溃疡性结肠炎提供了理论依据。
参考文献
1 Babbs CF.Oxygen radicals in ulcerative colitis.Free Radic Biol Med，1992，13(2):169-181.
2 Niero N，Torres MI，Fernandez MI，et al.Experimental ulcerative colitis impairs antioxidant defense system in rat intestine.Dig Dis Sci，2000，45(9):1820-1827.
, 百拇医药
3 Morris GP，Beck PL，Herridge MS，et al.Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon.Gastroenterology，1989，96(3):795-803.
4 Butzner JD，Parmar R，Bell CJ，et al.Butyrate enema therapy stimulates mucosal repair in experimental colitis in the rat.Gut，1996，38:568-573.
5 Dieleman LA，PalmenMJ，Akol H，et al.Chronic experimental colitis inˉduced by dextran sulphate sodium(DSS)is characterized by Th1andTh2cytokines.Clin Exp Immunol，1998，114:385-391.
, 百拇医药
6 王皓，欧阳钦，胡仁玮.三硝基苯磺酸结肠炎动物模型的建立.胃肠病学，2001，6(1):7-10.
7 黄玲.雷公藤药理作用研究进展.江西中医药，2000，31(2):45-46.
8 Boughton-smith NK，Evans SM，Hawkey CJ，et al.Nitric oxide sythase activity in ulcerative colitis and Crohon’s disease.Lancet，1993，342(8866):338-344.
9 陈吉，邓小英，吕玉敏，等.一氧化氮与溃疡性结肠炎.国外医学·内科学分册，1996，23(8):324-325.
10 Stark ME，Szurszewski JH.Role of nitric oxide in gastrointestinal and hepatic function and disease.Gastroenterology，1992，103(6):1928-1949.
, 百拇医药
11 朱炳喜，吕愈敏.氧自由基在溃疡性结肠炎发病机制中的研究.中华消化内镜杂志，1997，14(2):111-112.
12 Mulden YPJ，Verspaget HW，Janssens AR，et al.Decrease in two inˉtestinalcopper/zinc containing proteins with antioxidant function in inˉflammatory bowel disease.Gut，1991，32(10):1146-1150.
13 Lih-Brody L，Powell SR，Collier KP，et al.Increased oxidative stress and decreased antioxidant defenses in mucosa of imflammatory bowel disease.Dig Dis Sci，1996，41(10):2078-2086.
(编辑 小川), 百拇医药(何小飞)
Effect of tripterygium polyglycoside on NO，SOD and MDA in TNBS-induced colitis in rats
He Xiaofei，Li Junhua，Xu Ximing，et al.
Department of Gastroenterology，the Affiliated Hospital of Xianning Medical College，Xianning430071.
【Abstract】 Objective To observe the effects of tripterygium polyglycoside，(TⅡ)on lipid peroxidation in ulˉcerative colitis of rats.Methods Rat colitismodel was induced by2，4，6-trinitrobenzene sulfonic acid(TNBS)，The rats were randomly divided into4groups:normal group，model group，NS group and TⅡgroup，the activity of SOD and the levels of MDA and NO in all rats were detected respectively，the macroscopical and histological changes of the colon were evaluated also.Results In TⅡgroup，SOD activity was higher and NO，MDA levels was lower than that in model group，the inflammatory injury in TⅡgroup was slight in compare with model and NS group.There was significant difference between the TⅡgroup and the model group，NS group(P<0.01).Conclusion Tripterygium polyglycoside，TⅡhave protective effects on ulcerative colitis of rat by inhibiting lipid peroxidation.
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Key words ulcerative colitis tripterygium polyglycoside NO SOD MDA
溃疡性结肠炎(UC)发病近年在国内报道明显增多，但病因及发病机制迄今尚不明确。研究表明自由基及脂质过氧化反应代谢产物在UC发生、发展中起重要作用;雷公藤多苷(TⅡ)是从卫矛科植物雷公藤中提取的苷类制剂，具有较强的抗炎及免疫抑制作用，可能对UC具有一定的抗炎作用。本实验以三硝基苯磺酸(TNBS)诱导大鼠溃疡性结肠炎形成，观察雷公藤多苷对UC大鼠肠组织中的超氧化物歧化酶活性、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)及NO自由基含量的影响，探讨雷公藤多苷对UC的保护作用。
1 材料与方法
1.1 材料 健康SD大鼠(由湖北省医学科学院实验动物中心提供)60只，雄性，体重150～200g，正常喂养;雷公藤多苷为福建中医药研究所产品，三硝基苯磺酸为Sigma公司产品，NO、SOD及MDA测定试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品。
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1.2 动物分组及模型制备 [3] 60只大鼠随机分为正常对照组、模型组、生理盐水(0.9%NS)组及雷公藤多苷(TⅡ)组等四组;正常对照组不作任何处理，模型组以三硝基苯磺酸灌肠，生理盐水组及TⅡ组分别以三硝基苯磺酸造模后给予生理盐水及雷公藤多苷灌胃。实验时SD大鼠术前禁食24h，自由饮水，乙醚麻醉，用一直径2.0cm长约12cm的硅胶管由肛门轻缓插入深约8c
m，实验组以含150mg/kg TNBS的等体积无水乙醇溶液缓慢推入结肠，让动物保持平躺自然清醒，0.9%NS组、TⅡ组造模后分别以生理盐水2ml/次，60mg/kg雷公藤多苷(溶解于2ml生理盐水中)灌胃，每日1次。3周后分别随机处死3只模型组及正常对照组大鼠，取结肠标本作病理检查，以确定造模成功。处死所有大鼠，取肛门至盲肠肠管(约8cm)，沿肠系膜纵轴剪开，用冷生理盐水冲洗干净后一部分以4.0%多聚甲醛固定，进行肉眼大体形态和组织学形态评分分级后将标本石蜡包埋切片，HE染色，结肠组织镜下评价炎症和溃疡;另一部分冲洗干净后-80℃冻存，用以肠组织氧化指标的检测。
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1.3 观察指标 冻存肠组织制成匀浆，以黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，硫代巴比妥酸比色法(TBA)测定MDA含量，NO含量测定采用酶标法;具体操作按试剂盒说明书(南京建成生物工程研究所提供)进行。
1.4 结肠组织损伤大体形态和组织学形态评分方法大体形态损伤评分指标包括粘连、局部充血、溃疡及炎症。粘连及充血按有无及轻重分别计0、1、2分，出现炎症、溃疡数目增加1个、溃疡面积>2cm时范围每增加1cm计分均加1。组织学指标包括溃疡、炎症、肉芽肿、纤维化及病变深度，按有无及轻重分别计0、1、2分，病变深度达粘膜下层、肌层、浆膜层分别计1、2、3分，各项相加得总分。
1.5 统计学处理 实验数据以ˉx±s表示，采用单因素方差分析，组间差异采用q检验，以P<0.01为有统计学意义。
2 结果
2.1 大鼠一般情况改变 造模鼠在TNBS灌肠12h后均出现腹泻，为黄色稀便和(或)肛周体毛被稀便粘染，第6～7d开始体重明显下降，毛色失去光泽，精神倦怠，活动及进食明显减少，模型组有2只大鼠死亡。雷公藤多苷灌胃后大鼠一般状况及消化道症状逐渐好转，用药1周后大便基本成形，无大鼠死亡，一般情况明显优于模型组及生理盐水组。
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2.2 雷公藤多苷对大鼠溃疡性结肠炎大体形态及组织学损伤的影响 模型组大鼠结肠标本表现为粘膜充血水肿、 溃疡形成，结肠组织与周围组织粘连，可见近端肠腔扩张。溃疡呈线状和灶状，周围可见粘膜增厚，肠腔狭窄。炎症及溃疡位于盲肠与肛门之间，病变从肛门端向上连续性发展，但逐渐减轻，以直肠、乙状结肠最为明显。光镜下可见溃疡及炎性渗出物，可见上皮细胞坏死、脱落，有淋巴组织增生，大量中性粒细胞浸润，可见数量不等的单个核细胞和嗜酸性粒细胞，也可见增生的纤维母细胞;雷公藤多苷组粘膜水肿少见，无溃疡和炎性渗出物，光镜下腺体排列整齐，仅见少量淋巴细胞和中性粒细胞浸润，损伤指数明显低于模型组及生理盐水组(P<0.01)，见表1。
2.3 NO、SOD及MDA含量变化 与正常大鼠比较，UC大鼠的结肠粘膜组织中SOD活性显著下降(P<0.01)，NO和MDA含量显著上升(P<0.01)，雷公藤多苷组SOD明显高于模型组和生理盐水组，NO、MDA含量较模型组和生理盐水组明显下降(P<0.01)，见表2。
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表1 各组大鼠结肠大体形态和组织学损伤评分比较 (ˉx±s)(表略)
表2 各组大鼠结肠组织SOD活性及NO、MDA含量比较 (ˉx±s)(表略)
3 讨论
溃疡性结肠炎是肠道炎性疾病，肠道局部炎性损伤是其重要病理改变，而三硝基苯磺酸(TNBS)结肠炎仍是研究炎性肠道疾病(IBD)最常用的模型，TNBS诱导的溃疡性结肠炎具有类似人类IBD大体病理及组织学改变，并由免疫系统所介导;此外，该模型体现了急性炎症向慢性转化的动态过程，有利于评价药物疗效。
雷公藤多苷具有的较强抗炎作用及细胞和体液免疫抑制作用，已广泛用于类风湿关节炎、器官移植排斥反应、肾脏疾病及支气管哮喘等疾病的临床治疗，但雷公藤多苷对UC作用的报道较少，本实验在建立大鼠模型的同时用雷公藤多苷灌胃进行保护，发现雷公藤多苷组大鼠一般情况、肠粘膜组织大体形态及组织学损伤评分指数明显低于生理盐水组和模型组，表明雷公藤多苷对大鼠溃疡性结肠炎具有很好的保护作用。我们同时观察了大鼠肠组织中NO、MDA含量和SOD活性，探讨雷公藤多苷对UC的作用机制。
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NO是一种广泛存在于机体的生物活性物质，在体内参与诸多的病理生理过程。NO在UC的发病机制中的作用并未完全被确定。但可以肯定一氧化氮在UC炎症过程中的作用是双重的，在UC早期，NO可维持微循环的完整性，抑制血小板、白细胞在内皮细胞表面的粘附，积聚，防止血栓形成和内皮细胞与中性粒细胞、单核细胞的相互作用，这一保护作用是通过增加靶细胞内5-环磷酸鸟苷(5-cGMP)浓度及抑制P-选择素基因表达完成的。而在UC中晚期，随着NO产生增多和积聚，它很容易在O 2 ·- 存在时转变为氧化能力更强的氧化亚硝酸，后者进一步分解为OH - 和NO，通过自由基链式反应导致含巯基蛋白和脂质过氧化，从而促进组织细胞损伤。
研究证明，机体在抗氧化系统削弱或OFR形成过量时，OFR除可直接损伤组织外，还通过触发细胞膜上的多链不饱和脂肪酸发生脂质过氧化的链式反应并产生MDA等脂质过氧化物，引起细胞膜结构受损、炎症介质大量释放。SOD是存在于生物体内的重要的抗氧化酶系，能有效地清除氧自由基，催化超氧化自由基分解成H 2 O 2 ，进而在过氧化氢酶的作用下分解成H 2 O和氧分子，从而抑制肠组织中的脂质过氧化反应。许多学者认为UC体内，特别是肠粘膜组织局部SOD活性降低，清除OFR能力降低是导致OFR堆积造成肠粘膜损伤的重要机制之一，因此NO、MDA水平及SOD活性可间接反映机体的脂质过氧化反应和抗脂质过氧化反应的能力。本实验中大鼠肠组织大体形态和病理组织学变化表明造模成功，且结肠粘膜组织的SOD活性显著低于正常大鼠，同时NO、MDA水平显著高于正常大鼠，也支持了溃疡性结肠炎中自由基损伤的观点。
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实验结果同时表明，与生理盐水组和模型组相比，雷公藤多苷组大鼠肠组织中SOD含量明显上升，NO、MDA水平明显降低，说明雷公藤多苷有明显的抗氧化和抗脂质过氧化的作用，其对大鼠溃疡性结肠炎的保护作用可能与其抗氧化应激有关，本实验结果为雷公藤多苷临床用于治疗或辅助治疗溃疡性结肠炎提供了理论依据。
参考文献
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