尼莫地平抑制大鼠烧伤后枯否细胞TNFα的产生
【摘要】 目的 探讨钙离子通道阻断剂尼莫地平调控烧伤后枯否细胞(KC)合成释放TNFα的可能性，为寻找到一种有效减轻、控制烧伤后过度全身炎症反应的措施提供理论依据。方法 内灌注消化、密度梯度离心法分离培养正常SD大鼠KC，显微荧光分光光度计复合倒置显微镜技术观察烫伤血清作用下单个KC细胞内钙([Ca 2+ ]i)变化，ELISA方法测定烫伤血清培养的KC上清中TNFα浓度变化;SD大鼠行30%TBSAⅢ度烫伤，伤后6h分离KC，RNA酶保护分析法测定KC TNFαmRNA表达量，并测定血浆TNFα水平;观察尼莫地平存在时，上述结果的改变。结果 与对照组相比，烧伤组KC[Ca 2+ ]i峰值及培养上清中TNFα浓度增加值均显著增加(P<0.01)，在1μM尼莫地平存在时，两者均显著减少(P<0.01)。烧伤后6h KC TNFαmRNA表达量及血浆TNFα水平显著升高，静脉给予尼莫地平(40μg·kg -1 ·h -1 )后，两者均显著减少(P<0.01)。结论 烧伤后，KC合成释放TNFα，通过细胞内钙离子通道信号传导途径实现。尼莫地平能抑制烧伤后KC TNFαmRNA表达，使KC产生TNFα明显减少，并下调血浆中TNFα的总体水平。
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关键词 烧伤 尼莫地平 枯否细胞 肿瘤坏死因子α
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)04-0483-03
Nimodipine can inhibit the production of TNFαby kupffer cells in severe b
urned rats
Wang Guangyi，Tian Jianguang，Zhu Shihui，et al.
Burn Department，ChanghaiHospital，Shanghai200433.
【Abstract】 Objective To study whether nimodipine，a Dihydropyridine-type calcium channel blocker，can inhibit the production of TNFαby kupffer cells(KC)and down-regulate its level of plasma after severe burn injury.Methods KCs of normal rats were isolated with portal vein catheter，intrahepatic digestion and density gradient cenˉtrifugation.Intracellular calcium concentration([Ca 2+ ]i)in individual KC after stimulated with postburn serumwas asˉsessed fluorometrically with microspectrofluorometer.Level of TNFαin the supernatant of KC cultured with postburn serumwas detected by ELISA.SD rats underwent30%TBSA full thickness burn.Six hours later，KC were isolated and their total RNA was extracted.Level of TNFαmRNA was detected by ribonuclease protection assay.Level of plasma TNFαwas also detected.Role of nimodipine on above-mentioned effects were observed.Results Compared with that of control group，[Ca 2+ ]i of KC and level of TNFαin supernatant in burn group increased significantly.At present of1μM nimodipine，however，the numerical value decreased significantly.Compared with that of control group，level of KC mRNA and plasma TNFαin burn group also increased significantly.After intravenously injection with nimodipine(40μg·kg -1 ·h -1)，the numerical value decreased significantly.Conclusion Kupffer cells of rats are activated to secret TNFαafter severe burn injury and this process is realized through calcium ion signal transduction channel.Nimodipine can inhibit TNF
, 百拇医药
αproduction of KC by preventing its mRNA transcription，down-regulated its level of plasma.Key words burn nimodipine kupffer cells tumor necrosis factorα
严重烧伤后，大量炎症介质释放，引起全身炎症反应综合征(SIRS)。肿瘤坏死因子α(TNFα)在SIRS的发生发展中起主导作用，而枯否细胞(KC)是体内TNFα的重要来源。钙离子通道作为细胞信号传导的第二信使，在KC的活化中起重要作用。本研究旨在探讨钙离子通道阻断剂的尼莫地平调控KC合成释放TNFα的可能性，为寻找到一种能用于烧伤临床治疗的有效减轻、控制过度全身炎症反应的措施提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 烫伤血清的制备 成年SD大鼠(第二军医大学实验动物中心提供，以下同)，雌雄不限，体重200～250g，随机分成烧伤组和对照组。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，剃躯干毛。烧伤组大鼠浸入98℃热水中烫背部10s，造成30%TBˉSAⅢ度烧伤(经病理证实);对照组大鼠用室温水模拟烫伤过程。伤后6h取颈动脉血，分离血清，于-70℃冻存。
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1.2 KC的分离和培养 参照Tomioka等方法，采用密度梯度离心法分离正常SD大鼠肝脏KC。将分离的KC接种于96孔板中，每孔细胞数量4.0×10 5 个，随机分为烧伤组(B组)、对照组(C组)和尼莫地平组(N组)，置于5%CO 2 培养箱中。用DMEM培养液37℃培养24h后，弃去培养液，加入含20%血清的DMEM培养液，其中烧伤组和尼莫地平组[培养液中含1μM尼莫地平(购自Bayer公司)]为烫伤血清，对照组为对照血清。各培养孔于培养开始及3h后取上清，采用ELISA方法进行TNFα浓度测定，ELISA试剂盒购自Diaclone公司。将培养3h的TNFα浓度测定值减去培养初始浓度，计算TNFα的浓度增加值。
1.3 单细胞细胞内游离钙离子浓度([Ca 2+ ]i)的测定 将分离的正常SD大鼠KC贴附于盖玻片上，培养24h后，分别在含20%对照血清、烫伤血清和含1μM尼莫地平的烫伤血清条件下，参照Agafonove等方法，采用显微荧光分光光度计复合倒置显微镜(购自Olympus公司)技术，观察单个KC[Ca 2+ ]i变化，荧光指示剂为Fura-2/AM(购自Calˉbiochem公司)。
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1.4 血浆细胞因子浓度测定 成年SD大鼠18只，体重200～250g，随机分成对照组(C组)、烧伤组(B组)、尼莫地平组(N组)，每组大鼠各6只。按实验步骤1中的方法烫伤B组和N组大鼠，C组大鼠行假烫处理。大鼠烫伤成功后立即行尾静脉穿刺，按Parkland公式持续液体复苏，其中B组大鼠单纯用乳酸钠林格氏液复苏，N组大鼠复苏液体中含有尼莫地平，用量40μg·kg -1 ·h -1 ，C组大鼠行尾静脉穿刺不补液。伤后6h取血，采用ELISA方法进行血浆TNFα浓度测定。同时按前述方法分离KC，采用一步法进行KC总RNA的抽提，使用RNA抽提纯化试剂盒(购自上海华舜生物工程公司)。
1.5 细胞因子mRNA含量测定 参照Rottman等方法，主要试剂均购自Pharmingen公司。体外转录合成同位素α- 32 P标记的RNA探针:包括TNFα和内参照GAPDH探针。采用RNA酶保护分析法将RNA探针与KC总RNA杂交，进行非梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显像，用Gel Works1D Advanced v4.01软件进行图像分析，以GAPDH灰度值进行标准量化后，测量TNFα条带的相对灰度值。TNFαmRNA的表达量，用已经标准量化的GAPDH灰度值的相对值表示(100%)。
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1.6 统计学处理 TNFα含量、[Ca 2+ ]i和mRNA表达量用ˉx±s表示，不同组间统计学差异做非配对资料的t检验。
2 结果
2.1 烫伤血清对KC[Ca 2+ ]i的影响 对照组[Ca 2+ ]i峰值为(10.7±0.89)nM，加入烫伤血清后，[Ca 2+ ]i峰值为(42.1±1.66)nM，显著高于对照组(P<0.01)，在1μM尼莫地平存在时，[Ca 2+ ]i峰值较单纯烧伤组显著减少[(19.9±0.58)nM](P<0.01)(见图1)。
图2 尼莫地平对烧伤血清刺激的KC[Ca 2+ ]i的影响(n=6×30个细胞) (图略)
2.2 尼莫地平对KC分泌TNFα的抑制作用 在含对照血 清的C组，KC培养上清中TNFα浓度增加值为(19.32±3.45)pg/ml，而在含烫伤血清的B组，TNFα浓度增加值(437.56±69.78)pg/ml显著升高(P<0.01)，在1μM尼莫地平存在时，TNFα浓度增加值(42.54±14.23)pg/ml较单纯烧伤组显著减少(P<0.01)。
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2.3 尼莫地平对细胞因子mRNA表达的影响 对照组大鼠KC表达一定量的TNFαmRNA(0.47±0.15)，烧伤后细胞因子mRNA表达显著升高(1.17±0.31，P<0.01)，给予尼莫地平后，细胞因子mRNA表达显著降低(0.86±0.23，P<0.01)。
2.4 尼莫地平对大鼠烧伤后血浆TNFα水平的影响 对照组大鼠血浆内存在少量TNFα(27.65±9.59)pg/ml，大鼠烧伤后6h血浆TNFα水平(610.35±95.47)pg/ml显著增加(P<0.01)，静脉给予尼莫地平后，血浆TNFα水平(275.46±12.63)pg/ml显著下降(P<0.01)。
3 讨论
严重烧伤后，免疫系统被激活，大量炎症介质释放，导致SIRS的发生。TNFα在SIRS的发生、发展中起主导作用。KC作为巨噬细胞中最大的细胞群体，占巨噬细胞总数80%～90%，是体内TNFα的主要来源，因而在烧伤后SIRS的发生发展中起重要作用。KC作用的发挥是在激活状态下实现的，KC细胞膜上存在二羟吡啶类钙离子通道，钙离子作为细胞内信号传导的第二信使，介导KC的许多生物活性效应。本研究用烧伤血清刺激体外培养的KC，以模拟烧伤后KC存在的体液环境，发现烧伤血清能刺激体外培养的KC[Ca 2+ ]i快速升高，并使KC释放TNFα增多;另外，在培养液中加入1μM尼莫地平后，烫伤血清刺激的KC[Ca 2+ ]i峰值显著下降，而TNFα的产生也明显减少，表明烫伤血清刺激TNFα的生成作用是通过钙离子信号传导途径实现的，阻断钙离子通道可以抑制TNFα的释放。这提示，烧伤后KC可以被循环中的物质激活，其钙离子信号传导途径被启动并释放TNFα。
, 百拇医药
钙离子通道阻断剂用于调控炎症介质释放的实验研究有近10年的历史。在内毒素休克、肝脏移植、低氧和化学性肝脏损害模型中，已经进行了钙离子通道阻断剂用于减轻炎症性损害的动物实验研究，并取得了一定的预期效果，但其确切机制尚不清楚。本研究之所以选择尼莫地平，是因为在所有的二羟吡啶类钙离子通道阻断剂中，其对全身循环的影响最小。
本研究还观察了动物整体情况下，尼莫地平对TNFα产生的调控作用。结果发现，烧伤后KC TNFαmRNA表达量显著增加，细胞因子血浆水平显著升高;静脉给予尼莫地平，能明显抑制烧伤后KC TNFαmRNA表达，血浆TNFα水平也显著下降。这进一步证实，烧伤后KC激活并合成TNFα的过程是通过钙离子信号途径实现的，阻断钙离子通道信号传导可以抑制KC TNFα的体内合成，并下调烧伤早期TNFα的血浆水平。上述的研究结果提示，钙离子通道阻断剂能抑制烧伤后KC的分泌活性，减少促炎性细胞因子的释放。由严重烧伤及伤后延迟复苏、感染等造成的过度炎症反应会造成广泛的自身组织损伤，寻找能将炎症反应控制在适当范围的方法具有重大意义。该研究为钙离子通道阻断剂用于治疗严重烧伤后过度炎症性组织损害，提供了一定的理论依据。
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参考文献
1 Tomioka M，Linuma H，Okinaga K.Impaired Kupffer cell function and effect of immunotherapy in obstructive jaundice.J Surg Res，2002，92(2):276-282.
2 Agafonove IG，Aminin DL，Shubina LK，et al.Influence of polyhydroxˉyteroids on[Ca 2+ ]i.Steroids，2002，67(8):695-701.
3 Rottman JB.The rib Gad MZ.The distribution of non-specific carˉboxylesterase nuclease protection assay:a powerful tool for veterinarypathologist.Vel Pathol，2002，39(1):912-918.
, http://www.100md.com
4 王光毅，田建广，唐洪泰，等.枯否细胞在大鼠烧伤后促炎性细胞因子产生中的作用.中华烧伤杂志，2002，18(5):282-
284.
5 Hotchkiss RS，Osborne DF，Lappas GD，et al.Calcium antagonists deˉcrease plasma and tissue concentrations of tumor necrosis factor-a，inˉterleukinlb，interleukinla in a mouse model of endotoxin.Shock，1995，3:337-342.
6 Hotchkiss RS，karl IE.Calcium:a regulator of the inflammatory response in exdotoxemia and sepsis.New Horizone，1996，4:58-71.
(编辑 于少伟), 百拇医药
, 百拇医药
关键词 烧伤 尼莫地平 枯否细胞 肿瘤坏死因子α
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)04-0483-03
Nimodipine can inhibit the production of TNFαby kupffer cells in severe b
urned rats
Wang Guangyi，Tian Jianguang，Zhu Shihui，et al.
Burn Department，ChanghaiHospital，Shanghai200433.
【Abstract】 Objective To study whether nimodipine，a Dihydropyridine-type calcium channel blocker，can inhibit the production of TNFαby kupffer cells(KC)and down-regulate its level of plasma after severe burn injury.Methods KCs of normal rats were isolated with portal vein catheter，intrahepatic digestion and density gradient cenˉtrifugation.Intracellular calcium concentration([Ca 2+ ]i)in individual KC after stimulated with postburn serumwas asˉsessed fluorometrically with microspectrofluorometer.Level of TNFαin the supernatant of KC cultured with postburn serumwas detected by ELISA.SD rats underwent30%TBSA full thickness burn.Six hours later，KC were isolated and their total RNA was extracted.Level of TNFαmRNA was detected by ribonuclease protection assay.Level of plasma TNFαwas also detected.Role of nimodipine on above-mentioned effects were observed.Results Compared with that of control group，[Ca 2+ ]i of KC and level of TNFαin supernatant in burn group increased significantly.At present of1μM nimodipine，however，the numerical value decreased significantly.Compared with that of control group，level of KC mRNA and plasma TNFαin burn group also increased significantly.After intravenously injection with nimodipine(40μg·kg -1 ·h -1)，the numerical value decreased significantly.Conclusion Kupffer cells of rats are activated to secret TNFαafter severe burn injury and this process is realized through calcium ion signal transduction channel.Nimodipine can inhibit TNF
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αproduction of KC by preventing its mRNA transcription，down-regulated its level of plasma.Key words burn nimodipine kupffer cells tumor necrosis factorα
严重烧伤后，大量炎症介质释放，引起全身炎症反应综合征(SIRS)。肿瘤坏死因子α(TNFα)在SIRS的发生发展中起主导作用，而枯否细胞(KC)是体内TNFα的重要来源。钙离子通道作为细胞信号传导的第二信使，在KC的活化中起重要作用。本研究旨在探讨钙离子通道阻断剂的尼莫地平调控KC合成释放TNFα的可能性，为寻找到一种能用于烧伤临床治疗的有效减轻、控制过度全身炎症反应的措施提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 烫伤血清的制备 成年SD大鼠(第二军医大学实验动物中心提供，以下同)，雌雄不限，体重200～250g，随机分成烧伤组和对照组。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，剃躯干毛。烧伤组大鼠浸入98℃热水中烫背部10s，造成30%TBˉSAⅢ度烧伤(经病理证实);对照组大鼠用室温水模拟烫伤过程。伤后6h取颈动脉血，分离血清，于-70℃冻存。
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1.2 KC的分离和培养 参照Tomioka等方法，采用密度梯度离心法分离正常SD大鼠肝脏KC。将分离的KC接种于96孔板中，每孔细胞数量4.0×10 5 个，随机分为烧伤组(B组)、对照组(C组)和尼莫地平组(N组)，置于5%CO 2 培养箱中。用DMEM培养液37℃培养24h后，弃去培养液，加入含20%血清的DMEM培养液，其中烧伤组和尼莫地平组[培养液中含1μM尼莫地平(购自Bayer公司)]为烫伤血清，对照组为对照血清。各培养孔于培养开始及3h后取上清，采用ELISA方法进行TNFα浓度测定，ELISA试剂盒购自Diaclone公司。将培养3h的TNFα浓度测定值减去培养初始浓度，计算TNFα的浓度增加值。
1.3 单细胞细胞内游离钙离子浓度([Ca 2+ ]i)的测定 将分离的正常SD大鼠KC贴附于盖玻片上，培养24h后，分别在含20%对照血清、烫伤血清和含1μM尼莫地平的烫伤血清条件下，参照Agafonove等方法，采用显微荧光分光光度计复合倒置显微镜(购自Olympus公司)技术，观察单个KC[Ca 2+ ]i变化，荧光指示剂为Fura-2/AM(购自Calˉbiochem公司)。
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1.4 血浆细胞因子浓度测定 成年SD大鼠18只，体重200～250g，随机分成对照组(C组)、烧伤组(B组)、尼莫地平组(N组)，每组大鼠各6只。按实验步骤1中的方法烫伤B组和N组大鼠，C组大鼠行假烫处理。大鼠烫伤成功后立即行尾静脉穿刺，按Parkland公式持续液体复苏，其中B组大鼠单纯用乳酸钠林格氏液复苏，N组大鼠复苏液体中含有尼莫地平，用量40μg·kg -1 ·h -1 ，C组大鼠行尾静脉穿刺不补液。伤后6h取血，采用ELISA方法进行血浆TNFα浓度测定。同时按前述方法分离KC，采用一步法进行KC总RNA的抽提，使用RNA抽提纯化试剂盒(购自上海华舜生物工程公司)。
1.5 细胞因子mRNA含量测定 参照Rottman等方法，主要试剂均购自Pharmingen公司。体外转录合成同位素α- 32 P标记的RNA探针:包括TNFα和内参照GAPDH探针。采用RNA酶保护分析法将RNA探针与KC总RNA杂交，进行非梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显像，用Gel Works1D Advanced v4.01软件进行图像分析，以GAPDH灰度值进行标准量化后，测量TNFα条带的相对灰度值。TNFαmRNA的表达量，用已经标准量化的GAPDH灰度值的相对值表示(100%)。
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1.6 统计学处理 TNFα含量、[Ca 2+ ]i和mRNA表达量用ˉx±s表示，不同组间统计学差异做非配对资料的t检验。
2 结果
2.1 烫伤血清对KC[Ca 2+ ]i的影响 对照组[Ca 2+ ]i峰值为(10.7±0.89)nM，加入烫伤血清后，[Ca 2+ ]i峰值为(42.1±1.66)nM，显著高于对照组(P<0.01)，在1μM尼莫地平存在时，[Ca 2+ ]i峰值较单纯烧伤组显著减少[(19.9±0.58)nM](P<0.01)(见图1)。
图2 尼莫地平对烧伤血清刺激的KC[Ca 2+ ]i的影响(n=6×30个细胞) (图略)
2.2 尼莫地平对KC分泌TNFα的抑制作用 在含对照血 清的C组，KC培养上清中TNFα浓度增加值为(19.32±3.45)pg/ml，而在含烫伤血清的B组，TNFα浓度增加值(437.56±69.78)pg/ml显著升高(P<0.01)，在1μM尼莫地平存在时，TNFα浓度增加值(42.54±14.23)pg/ml较单纯烧伤组显著减少(P<0.01)。
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2.3 尼莫地平对细胞因子mRNA表达的影响 对照组大鼠KC表达一定量的TNFαmRNA(0.47±0.15)，烧伤后细胞因子mRNA表达显著升高(1.17±0.31，P<0.01)，给予尼莫地平后，细胞因子mRNA表达显著降低(0.86±0.23，P<0.01)。
2.4 尼莫地平对大鼠烧伤后血浆TNFα水平的影响 对照组大鼠血浆内存在少量TNFα(27.65±9.59)pg/ml，大鼠烧伤后6h血浆TNFα水平(610.35±95.47)pg/ml显著增加(P<0.01)，静脉给予尼莫地平后，血浆TNFα水平(275.46±12.63)pg/ml显著下降(P<0.01)。
3 讨论
严重烧伤后，免疫系统被激活，大量炎症介质释放，导致SIRS的发生。TNFα在SIRS的发生、发展中起主导作用。KC作为巨噬细胞中最大的细胞群体，占巨噬细胞总数80%～90%，是体内TNFα的主要来源，因而在烧伤后SIRS的发生发展中起重要作用。KC作用的发挥是在激活状态下实现的，KC细胞膜上存在二羟吡啶类钙离子通道，钙离子作为细胞内信号传导的第二信使，介导KC的许多生物活性效应。本研究用烧伤血清刺激体外培养的KC，以模拟烧伤后KC存在的体液环境，发现烧伤血清能刺激体外培养的KC[Ca 2+ ]i快速升高，并使KC释放TNFα增多;另外，在培养液中加入1μM尼莫地平后，烫伤血清刺激的KC[Ca 2+ ]i峰值显著下降，而TNFα的产生也明显减少，表明烫伤血清刺激TNFα的生成作用是通过钙离子信号传导途径实现的，阻断钙离子通道可以抑制TNFα的释放。这提示，烧伤后KC可以被循环中的物质激活，其钙离子信号传导途径被启动并释放TNFα。
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钙离子通道阻断剂用于调控炎症介质释放的实验研究有近10年的历史。在内毒素休克、肝脏移植、低氧和化学性肝脏损害模型中，已经进行了钙离子通道阻断剂用于减轻炎症性损害的动物实验研究，并取得了一定的预期效果，但其确切机制尚不清楚。本研究之所以选择尼莫地平，是因为在所有的二羟吡啶类钙离子通道阻断剂中，其对全身循环的影响最小。
本研究还观察了动物整体情况下，尼莫地平对TNFα产生的调控作用。结果发现，烧伤后KC TNFαmRNA表达量显著增加，细胞因子血浆水平显著升高;静脉给予尼莫地平，能明显抑制烧伤后KC TNFαmRNA表达，血浆TNFα水平也显著下降。这进一步证实，烧伤后KC激活并合成TNFα的过程是通过钙离子信号途径实现的，阻断钙离子通道信号传导可以抑制KC TNFα的体内合成，并下调烧伤早期TNFα的血浆水平。上述的研究结果提示，钙离子通道阻断剂能抑制烧伤后KC的分泌活性，减少促炎性细胞因子的释放。由严重烧伤及伤后延迟复苏、感染等造成的过度炎症反应会造成广泛的自身组织损伤，寻找能将炎症反应控制在适当范围的方法具有重大意义。该研究为钙离子通道阻断剂用于治疗严重烧伤后过度炎症性组织损害，提供了一定的理论依据。
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参考文献
1 Tomioka M，Linuma H，Okinaga K.Impaired Kupffer cell function and effect of immunotherapy in obstructive jaundice.J Surg Res，2002，92(2):276-282.
2 Agafonove IG，Aminin DL，Shubina LK，et al.Influence of polyhydroxˉyteroids on[Ca 2+ ]i.Steroids，2002，67(8):695-701.
3 Rottman JB.The rib Gad MZ.The distribution of non-specific carˉboxylesterase nuclease protection assay:a powerful tool for veterinarypathologist.Vel Pathol，2002，39(1):912-918.
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4 王光毅，田建广，唐洪泰，等.枯否细胞在大鼠烧伤后促炎性细胞因子产生中的作用.中华烧伤杂志，2002，18(5):282-
284.
5 Hotchkiss RS，Osborne DF，Lappas GD，et al.Calcium antagonists deˉcrease plasma and tissue concentrations of tumor necrosis factor-a，inˉterleukinlb，interleukinla in a mouse model of endotoxin.Shock，1995，3:337-342.
6 Hotchkiss RS，karl IE.Calcium:a regulator of the inflammatory response in exdotoxemia and sepsis.New Horizone，1996，4:58-71.
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