碳纳米管针尖对上皮细胞的高分辨率成像研究
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中华中西医杂志 2003年5月 第4卷 第9期
【文献标识码】 B 【文章编号】 1606-8106(2003)09-1332-02
【摘要】 目的 探讨碳纳米管原子力显微镜针尖对上皮细胞的高分辨率成像的研究。方法 取脐静脉上皮细胞，用含10%胎牛血清和RPMI1640培养基的培养液培养，用胰蛋白酶和EDTA消化后，取悬液加入放有玻片的24孔培养板，待细胞吸附后，贴壁生长24h，弃培养液，PBS洗2次，加入2.5%戊二醛固定30min。将玻片从培养板中取出，PBS液洗3次，晾干后于AFM下观察。结果 碳纳米针尖获得的细胞的形貌明显好于Si针尖扫描得到的细胞形貌，与实际形貌相符，细节更丰富，分辨率更高。结论 碳纳米管针尖的高纵横比，较小的曲率半径，以及较高的柔韧性能够获得更高分辨率，更真实的生物细胞形貌图像。
关键词 碳纳米管针尖 原子力显微镜 分辨率
以往人们只能通过光学显微镜和电子显微镜观察细胞的形态，原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，AFM)的出现使细胞生物学的研究手段进一步丰富。AFM的优势一是高分辨率，二是可在液体中近生理条件下观察，三是可以进行理化特性的研究。AFM对细胞的研究避免了光镜的分辨率低，特别是电镜对细胞自然形态的损坏方面，具有较大的优势 [1～3] 。
, 百拇医药
原核细胞大小约为1～10μm，真核细胞约为10～100μm，人类的细胞多在数十微米，细胞表面是由细胞膜和细胞被构成。细胞膜是将细胞质与外界隔开的一层薄膜，主要由蛋白质、磷脂构成，也含有少量糖类、水分和无机盐。动物细胞的细胞被位于膜外，呈绒毛状或细丝状，其上有各种受体、膜抗原、酶等，既有保护作用，又有生理功能。因此，AFM用于细胞成像时，对结构细节的高分辨成像尤为重要。由于AFM刚刚发展不久，在细胞方面还有很多需要深入研究的问题 [4，5] 。运用碳纳米管针尖对结构有显著特征的上皮细胞进行观察，以期获得更多的信息。
1 材料与方法
1.1 材料 胎牛血清、RPMI1640培养基购自Gibco-BRL公司，胰蛋白酶、EDTA、青、链霉素等购自Sigma公司。其它试剂为国产分析纯。Wistar大鼠由中国医学科学院动物中心提供。细胞生长的基底为AFM专用的玻璃片，高度平整，购自Ted Pella公司。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 EW上皮细胞样品制备 取脐静脉上皮细胞，用含10%胎牛血清和RPMI1640培养基的培养液培养。用胰蛋白酶和EDTA消化后，取细胞悬液加入放有玻片的24孔培养板，待细胞吸附后，贴壁生长24h，弃培养液，PBS洗2次，加入2.5%戊二醛固定30min。
1.2.2 AFM观察 将载有细胞的玻璃片从培养板中取出，PBS液洗3次，晾干后观察。先在光镜下选取目标细胞，然后用碳纳米管针尖大范围的扫描，可能包括几个细胞在扫描区域内。选择形态比较好的细胞作为目标，运用自制碳纳米管针尖和AFM的Si针尖分别对其进行扫描成像。
实验用美国Digital Instrument公司的NanoscopeⅢa型MultiMode原子力显微镜，扫描管为J型扫描模式为敲击模式(Tapping mode)，成像条件为室温，大气环境，扫描速度1.5Hz，图像只采用Flatten Auto处理，以消除慢扫描方向上的低频噪音，以512×512象素收集图像。
, 百拇医药
2 结果
从图1可以看到，EW细胞呈圆形或椭圆形，大小约为20～30μm，细胞核位于中央，多分为三叶，高度明显大于胞体的其它部分。从三维结构可以看出，整个细胞如火山状，细胞表面不饱满，高度不等，表面有网格状空隙。
碳纳米管针尖获得的细胞的形貌(图1b)明显好于Si针尖扫描得到的细胞形貌(图1c)，与实际形貌相符，细节更丰富，分辨率更高。
图1 上皮细胞原子力显微镜图像(略)
3 讨论
细胞属于生物样品，又由于细胞的大小在微米量级，特别是其表面粗糙不平，因此也可将其视为粗糙样品。由理论分析可知，针尖的几何形状是决定是否能获得细胞高分辨率成像的关键因素。通常情况下，针尖越尖锐、纵横比越高，AFM探测到的深度及获得的横向分辨率也就越高。因此，碳纳米管针尖的高纵横比、较小的曲率半径，以及较高的柔韧性能够获得更高分辨率、更真实的生物细胞形貌图像。
, http://www.100md.com
目前AFM在细胞研究中的应用主要是集中在形态、功能和物理性质三方面。在形态上可以观察不同细胞的精细或特殊结构，比如神经细胞、红细胞、肝细胞等等。在功能下，可以比较细胞在不同时期的结构变化，比较加入药物、病毒或保护剂后细胞的变化，通过高分辨率成像观察受体与配体的结合，观察蛋白的分泌。在物理性质方面，可以记录细胞的跳动与机械脉冲(如心肌细胞)，探讨细胞的弹性和粘滞等等。但也存在很多问题 [6] ，比如对观察对象的确认:如何判断观察到的是受体、是蛋白通道、是脂膜?如何保证对照实验的可靠性?需要大量的实验积累和多种手段的比较验证。
参考文献
1 Girasole M，Cricenti A，Generosi R，et al.Artificially induced unusual shape of erythrocytes:an atomic force microscopy study.J Microsc，2001，204(Pt1):46-52.
, 百拇医药
2 Mathur AB，Collinsworth AM，Reichert WM，et al.Endothelial，cardiac muscleand skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properˉties as determined by atomic force microscopy.J Biomech，2001，34(12):1545-1553.
3 Braet F，Vermijlen D，Bossuyt V，et al.Early detection of cytotoxic eventsbetween hepatic natural killer cells and colon carcinoma cells as probed with the atomic force microscope.Ultramicroscopy，2001，89(4):265-273.
, http://www.100md.com 4 Haberle W，Horber JK，Ohnesorge FM，et al.In situ investigation of sinˉgle living cells infected by viruses.Ultramicroscopy，1992，42-44(PtB):1161-1167.
5 Ohnesorge FM，Horber JK，Haberle W，et al.AFM review study on pox viruses and living cells.Biophys J，1997，73(4):2183-2194.
6 Lehenlkari PP，Charras GT，Nykanen A.Adapting atomic force miˉcroscopy for cell biology.Ultramicroscopy，2000，82:289-295.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:50202006)
作者单位:1 150001哈尔滨工业大学精密工程研究所
2 100084清华大学机械工程系
(编辑 秋实), http://www.100md.com(国立秋 董申 张飞虎 赵清亮 梁吉)
【摘要】 目的 探讨碳纳米管原子力显微镜针尖对上皮细胞的高分辨率成像的研究。方法 取脐静脉上皮细胞，用含10%胎牛血清和RPMI1640培养基的培养液培养，用胰蛋白酶和EDTA消化后，取悬液加入放有玻片的24孔培养板，待细胞吸附后，贴壁生长24h，弃培养液，PBS洗2次，加入2.5%戊二醛固定30min。将玻片从培养板中取出，PBS液洗3次，晾干后于AFM下观察。结果 碳纳米针尖获得的细胞的形貌明显好于Si针尖扫描得到的细胞形貌，与实际形貌相符，细节更丰富，分辨率更高。结论 碳纳米管针尖的高纵横比，较小的曲率半径，以及较高的柔韧性能够获得更高分辨率，更真实的生物细胞形貌图像。
关键词 碳纳米管针尖 原子力显微镜 分辨率
以往人们只能通过光学显微镜和电子显微镜观察细胞的形态，原子力显微镜(Atomic Force Microscopy，AFM)的出现使细胞生物学的研究手段进一步丰富。AFM的优势一是高分辨率，二是可在液体中近生理条件下观察，三是可以进行理化特性的研究。AFM对细胞的研究避免了光镜的分辨率低，特别是电镜对细胞自然形态的损坏方面，具有较大的优势 [1～3] 。
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原核细胞大小约为1～10μm，真核细胞约为10～100μm，人类的细胞多在数十微米，细胞表面是由细胞膜和细胞被构成。细胞膜是将细胞质与外界隔开的一层薄膜，主要由蛋白质、磷脂构成，也含有少量糖类、水分和无机盐。动物细胞的细胞被位于膜外，呈绒毛状或细丝状，其上有各种受体、膜抗原、酶等，既有保护作用，又有生理功能。因此，AFM用于细胞成像时，对结构细节的高分辨成像尤为重要。由于AFM刚刚发展不久，在细胞方面还有很多需要深入研究的问题 [4，5] 。运用碳纳米管针尖对结构有显著特征的上皮细胞进行观察，以期获得更多的信息。
1 材料与方法
1.1 材料 胎牛血清、RPMI1640培养基购自Gibco-BRL公司，胰蛋白酶、EDTA、青、链霉素等购自Sigma公司。其它试剂为国产分析纯。Wistar大鼠由中国医学科学院动物中心提供。细胞生长的基底为AFM专用的玻璃片，高度平整，购自Ted Pella公司。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 EW上皮细胞样品制备 取脐静脉上皮细胞，用含10%胎牛血清和RPMI1640培养基的培养液培养。用胰蛋白酶和EDTA消化后，取细胞悬液加入放有玻片的24孔培养板，待细胞吸附后，贴壁生长24h，弃培养液，PBS洗2次，加入2.5%戊二醛固定30min。
1.2.2 AFM观察 将载有细胞的玻璃片从培养板中取出，PBS液洗3次，晾干后观察。先在光镜下选取目标细胞，然后用碳纳米管针尖大范围的扫描，可能包括几个细胞在扫描区域内。选择形态比较好的细胞作为目标，运用自制碳纳米管针尖和AFM的Si针尖分别对其进行扫描成像。
实验用美国Digital Instrument公司的NanoscopeⅢa型MultiMode原子力显微镜，扫描管为J型扫描模式为敲击模式(Tapping mode)，成像条件为室温，大气环境，扫描速度1.5Hz，图像只采用Flatten Auto处理，以消除慢扫描方向上的低频噪音，以512×512象素收集图像。
, 百拇医药
2 结果
从图1可以看到，EW细胞呈圆形或椭圆形，大小约为20～30μm，细胞核位于中央，多分为三叶，高度明显大于胞体的其它部分。从三维结构可以看出，整个细胞如火山状，细胞表面不饱满，高度不等，表面有网格状空隙。
碳纳米管针尖获得的细胞的形貌(图1b)明显好于Si针尖扫描得到的细胞形貌(图1c)，与实际形貌相符，细节更丰富，分辨率更高。
图1 上皮细胞原子力显微镜图像(略)
3 讨论
细胞属于生物样品，又由于细胞的大小在微米量级，特别是其表面粗糙不平，因此也可将其视为粗糙样品。由理论分析可知，针尖的几何形状是决定是否能获得细胞高分辨率成像的关键因素。通常情况下，针尖越尖锐、纵横比越高，AFM探测到的深度及获得的横向分辨率也就越高。因此，碳纳米管针尖的高纵横比、较小的曲率半径，以及较高的柔韧性能够获得更高分辨率、更真实的生物细胞形貌图像。
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目前AFM在细胞研究中的应用主要是集中在形态、功能和物理性质三方面。在形态上可以观察不同细胞的精细或特殊结构，比如神经细胞、红细胞、肝细胞等等。在功能下，可以比较细胞在不同时期的结构变化，比较加入药物、病毒或保护剂后细胞的变化，通过高分辨率成像观察受体与配体的结合，观察蛋白的分泌。在物理性质方面，可以记录细胞的跳动与机械脉冲(如心肌细胞)，探讨细胞的弹性和粘滞等等。但也存在很多问题 [6] ，比如对观察对象的确认:如何判断观察到的是受体、是蛋白通道、是脂膜?如何保证对照实验的可靠性?需要大量的实验积累和多种手段的比较验证。
参考文献
1 Girasole M，Cricenti A，Generosi R，et al.Artificially induced unusual shape of erythrocytes:an atomic force microscopy study.J Microsc，2001，204(Pt1):46-52.
, 百拇医药
2 Mathur AB，Collinsworth AM，Reichert WM，et al.Endothelial，cardiac muscleand skeletal muscle exhibit different viscous and elastic properˉties as determined by atomic force microscopy.J Biomech，2001，34(12):1545-1553.
3 Braet F，Vermijlen D，Bossuyt V，et al.Early detection of cytotoxic eventsbetween hepatic natural killer cells and colon carcinoma cells as probed with the atomic force microscope.Ultramicroscopy，2001，89(4):265-273.
, http://www.100md.com 4 Haberle W，Horber JK，Ohnesorge FM，et al.In situ investigation of sinˉgle living cells infected by viruses.Ultramicroscopy，1992，42-44(PtB):1161-1167.
5 Ohnesorge FM，Horber JK，Haberle W，et al.AFM review study on pox viruses and living cells.Biophys J，1997，73(4):2183-2194.
6 Lehenlkari PP，Charras GT，Nykanen A.Adapting atomic force miˉcroscopy for cell biology.Ultramicroscopy，2000，82:289-295.
基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:50202006)
作者单位:1 150001哈尔滨工业大学精密工程研究所
2 100084清华大学机械工程系
(编辑 秋实), http://www.100md.com(国立秋 董申 张飞虎 赵清亮 梁吉)