pcDNA3.1(+)TPA转染人皮肤成纤维细胞的实验研究
【摘要】 目的 建立组织型纤溶酶原激活因子(TPA)基因导入人类细胞并表达外源性TPA产物的方法,为缺血性心脏疾病的基因治疗及防止血管再狭窄提供理论依据和技术指导。方法 构建真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA,然后将pcDNA3.1(+)TPA转入人皮肤成纤维细胞,并观察外源性TPA表达情况。结果 真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA在人皮肤成纤维细胞中获有效表达,酶联免疫吸附法TPA蛋白表达定量检测结果为647.8ng/10 6 细胞/24h,未转pcDNA3.1(+)TPA的皮肤成纤维细胞测得为19.2ng/10 6 细胞/24h;发色底物法测得外源性TPA活性为125.0IU/10 6 细胞/24h,未转pcDˉNA3.1(+)TPA的皮肤成纤维细胞测得为5.8IU/10 6 细胞/24h。结论 pcDNA3.1(+)TPA转入人皮肤成纤维细胞后,外源性TPA基因获有效表达,为缺血性心脏病的TPA基因治疗提供了理论依据和技术指导。
关键词 组织型纤溶酶原激活因子 基因治疗 pcDNA3.1 皮肤成纤维细胞 缺血性心脏病
【文献标识码】 A 【文章编号】 1609-6614(2003)13-1161-04
Experimental study of the transinfection of human
skin fibroblast of expression vector pcDNA3.1(+)TPA
Yang Jinfu,Zhou Xinmin,Chen Yong,et al.
Department of Cardiothoracic Surgery,Second Xiangya Hospital,Central South
University,Changsha410011.
【Abstract】 Objective To establish the method of transferring tissue plasminogen activator(TPA)gene into human cells and expression of TPA exogenous products.This could offer both theoretical basic and technical guidance for gene therapy of ischemic heart disease and prevention of postoperative vessel re-stenosis.Methods Expression vector pcDNA3.1(+)TPA was created,transferred into human skin fibroblasts,and the exogenous expression was observed.Results The expression quantity of expression vector pcDNA3.1(+)TPA in human skin fibroblasts transˉferred group was higher than that of non-transferred group.The protein quantity of transferred group was647.8ng/10 6 cell/24hr,when measured by enzyme-linked immunosorbent assay,while that of non-transferred group was19.2ng/10 6 cell/24hr;and the exogenous TPA’s activity was125.0IU/10 6 cell/24hr,when measured by chromogenic substrate assay,while that of non-transferred group was5.8IU/10 6 cell/24hr.Conclusion When transferred into human skin fibroblasts,pcDNA3.1(+)TPA,can be expressed exogenously,which could offer theoretical basic and technical guidance for TPA gene therapy of ischemic heart disease.
Key words tissue plasminogen activator gene therapy pcDNA3.1 skin fibroblastischemic heart disease
缺血性心脏病是中老年人的一种常见病,在欧美国家为第一位的致死原因,近年来,随着生活水平的提高,国人缺血性心脏病的发病率逐年增加,许多患者不得不接受冠脉搭桥手术,但术后由于严重的血管内皮细胞损伤带来的血小板沉积和血栓形成,使得血管桥(特别是静脉桥)在3~5年内又出现不同程度的狭窄,患者被迫接受第2次甚至第3次冠脉搭桥手术,严重影响了患者的生活质量,甚至威胁到患者的生命,因此,优化缺血性心脏病治疗方法成为当务之急。我们拟利用组织型纤溶酶原激活因子(tissue plasminogen activator,TPA)的抗血栓治疗作用进行梗死区血管再通和血管再狭窄防治的实验研究。首先,我们将TPA基因装入真核表达载体pcDNA3.1,然后将pcDNA3.1(+)TPA转入人皮肤成纤维细胞,并观察外源性TPA表达情况,为pcDNA3.1(+)TPA的临床基因治疗奠定理论基础。 现报道如下。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器 pcDNA3.1为SB公司(SmithKline Beecham)赠送,TPA活性测定试剂盒购于福建太阳生物技术公司,组织型纤溶酶原激活剂测定ELISA、底物发色法试剂盒购自上海太阳生物技术公司;实验仪器设备由中国医学遗传学国家重点实验室提供,实验在该实验室完成。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 设计引物TPA-1、TPA-2用于扩增人TPA全长cDNA,在TPA-1的5’端加上一个NheⅠ的酶切位点,在TPA-2的5’端加上一个HindⅢ的酶切位点。5’端引物TPA-1:5’-ATGCTAGCTGTGAAGCAATCATGGA TGCA-3’,3’端引物TPA-2:5’-CTAAGCTTTTCCTGˉGTCACGGTCGCATGTT-3’。用于检测TPA转入细胞RT-PCR引物TPA-3:5’-GAGGAGCCAGATCTTACCAAGT-3’;TPA-4:5’-AACTCTGAGCTGTACTTCCCCGCC-3’(产物515bp)。
1.2.2 人TPA全长cDNA的获取 以TPA-1、TPA-2为引物,人胎盘cDNA文库为模板PCR扩增出人TPA全长cDˉNA。PCR参数为96℃变性5min后进入循环:95℃30s,56℃30s,72℃30s共30个循环,最后72℃延伸5min,4℃保存。反应后的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.3 pcDNA3.1(+)TPA真核表达载体的构建和证实 保真酶pyrobest Taq酶扩增的PCR产物用QIAquick PCR Puˉrification Kit进行纯化后,用HindⅢ和NheⅠ消化双酶切,同时将pcDNA3.1(+)载体也用HindⅢ和NheⅠ消化双酶切,将两者酶切产物在1%的低熔点琼脂糖凝胶上电泳,EB染色,切下目的带于16℃下连接过夜,转化JM109感受态,涂在含氨苄抗性的固体LB平皿上,37℃下培养12~16h,挑取克隆,培养,提取质粒。少量提取的质粒用HindⅢ和NheⅠ消化鉴定,对酶消化正确的质粒,重新培养细菌,采用Spin Kit提取DNA(按说明书操作),进行DNA测序证实。
1.2.4 皮肤成纤维细胞的分离和体外培养 取手术患者腹部1~2cm 2 的皮肤,置于含有100U/ml氨苄青霉素和100mg/ml硫酸链霉素的PBS中,反复经过PBS漂洗后,剪弃脂肪和结缔组织。将皮肤剪成1mm 3 左右的小块,加入含有胶原酶200U/ml、透明质酸酶300U/ml的DMEM中,放置4℃过夜。1:1的比例加入含有0.25%胰酶和0.02%EDˉTA的PBS消化液,37℃空气摇床180rpm20min,血清终止。1000rpm离心10min收集细胞。DMEM洗脱2次后,用含有15%胎牛血清的DMEM调定细胞密度以每ml(2~4)×10 5 细胞接种,37℃,5%CO2 ,90%湿度条件下开放培养。并予细胞形态学观察及鉴定。
1.2.5 pcDNA3.1(+)TPA真核表达载体转染人皮肤成纤维细胞 质粒的纯化采用VITAGENE公司Endotocin-free Plasmid Purification Kit,整个操作过程严格按照KIT说明书进行。转染前用胰酶消化细胞并计数,接种到6孔板中,每孔2.5ml,含5.0×10 5 个细胞,将3.0μg的DNA稀释到250μl不含血清的DMEM培养基中,取12μl Lipfectin2000 TM 250μl稀释到250μl不含血清的DMEM培养基中,5min后混合DNA-Lipfectin2000 TM 混合物,4h后换液,换液48h取上清进行检测,细胞抽提RNA进行RT-PCR。
1.2.6 RT-PCR
1.2.6.1 第一链cDNA的合成 用Trizol抽提细胞总RNA,先合成第一链cDNA,操作按Reverse Transcription system Kit说明进行,但略有改动:取2μg的总RNA为模板,以oligo(dT)作为引物,总体积20μl。先于42℃作用60min,然后99℃,5min,最后放置于冰上2min,结束后-20℃保存。
1.2.6.2 PCR扩增 先用Nuclease-free H 2 O稀释第一条链cDNA的合成产物到100μl;取20μl作为模板,用TPA-3和TPA-4作为引物PCR扩增,PCR参数:先于96℃变性5min,然后进入循环:95℃30s,56℃30s,72℃1min共30个循环;最后于72℃延伸10min,4℃保存。结束后取PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
1.2.7 TPA蛋白定量测定(酶联免疫吸附法) 首先将标准品稀释成浓度为60、30、15、7.5、3.75ng/ml5个标准点,同时用稀释液将样品1:10和1:20稀释;每孔加入0.1ml,空白对照孔中加入稀释液,37℃孵育150min;洗涤液反复洗涤3次,拍干后加入酶标抗体0.1ml,37℃孵育60min;洗涤3次,显色15~20min;终止后在酶标仪490nm处以空白对照孔调定,测定各孔A值。
1.2.8 TPA活性测定(发色底物法) 首先将标准品稀释成浓度为2.5×10 2 、2.0×10 2 、1.5×10 2 、1.0×10 2 、0.5×10 2 、0IU/ml加入平底酶标板上;用缓冲液将酸化的待测样品稀释1000倍;吸取0.1ml加入酶标板,同时加入0.01ml发色底物,37℃湿盒孵育150~180min;加入终止液0.03ml终止反应,在酶标仪405nm处测定各孔A值。
2 结果
2.1 人TPA全长cDNA的获取 从人胎盘cDNA文库中PCR扩增到一1700bp左右的特异片段,见图1。
图1 PCR扩增获得TPA全长cDNA 1为空白对照;2为扩增获取的TPA全长cDNA;M为DNA分子量标准略
2.2 真核表达载体的构建 挑取8个克隆的细菌抽提质粒跑胶,并对3、6、8号质粒用NheⅠ和HindⅢ消化,其中3、8号克隆可得到一1700bp左右的泳带,见图2;经测序证明为克隆到pcDNA3.1(+)上的TPA cDNA,该序列与已发表的人TPAcDNA序列完全相同,阅读框完全一致,见图3。
图2 pcDNA3.1(+)TPA表达质粒的酶切鉴定电泳图3、6、8号为克隆编号;M为DNA分子量标准略
图3 克隆到pcDNA3.1(+)上的TPA cDNA测序部分结果略
2.3 人成纤维细胞的培养与观察 免疫组织化学显示10 代以后的细胞绝大部分形态为梭形,胞浆被染成深黄色,显示为成纤维细胞(图4A)。细胞连续传代30代,细胞呈单层生长,排列整齐,形态舒展,伸展性好,折光性强,有接触抑制,生长速度无明显改变,苏木精-伊红进行染色后未观察到细胞异常变化(图4B)。
图4.A 第10代皮肤细胞免疫组织化学(100×)略
4.B 第30代皮肤细胞苏木精-伊红染色(100×)略
2.4 RT-PCR 阳性质粒pcDNA(+)TPA转染人皮肤成纤 维细胞后,用Trizol抽提细胞总RNA,然后行RT-PCR,扩增出相应大小(515bp)的DNA片段,pcDNA3.1(+)空载体质粒转染的细胞则无相应的DNA片段,见图5。
图5 RT-PCR扩增TPA基因电泳图: M为DNA分子量标准;1、2为阳性质粒pcDNA3.1(+)TPA转染人皮肤成纤维细胞RNA;3为pcDNA3.1(+)空载体质粒转染人皮肤成纤维细胞RNA 略
2.5 TPA蛋白定量测定(酶联免疫吸附法) pcDNA3.1(+)TPA转染人皮肤成纤维细胞阳性质粒TPA表达蛋白含量用酶联免疫吸附法测定,两次测得结果分别为647.8ng/10 6 细胞/24h和546.6ng/10 6 细胞/24h,TPA背景高的HT1080细胞测得为35.3ng/10 6 细胞/24h,未转pcDNA3.1(+)TPA的人皮肤成纤维细胞测得为19.2ng/10 6 细胞/24h。
2.6 TPA活性测定结果(发色底物法) pcDNA3.1(+)TPA转染人皮肤成纤维细胞阳性质粒TPA活性检测,两次测定分别为125.0IU/10 6 细胞/24h和121.3IU/10 6 细胞/24h,TPA背景高的HT1080细胞测得为10.6IU/10 6 细胞/24h,未转pcDNA3.1(+)TPA的人皮肤成纤维细胞测得为5.8IU/10 6 细胞/24h。
3 讨论
人皮肤成纤维细胞,作为一种重要的基因治疗受体细胞,具以下优点:(1)获取容易和体外养技术熟练,基因转移和细胞移植也较方便;(2)易转染、并能稳定地表达外源目的基因,合成和分泌的蛋白质可以通过血液供各种类型细胞使用;(3)植回的成纤维细胞很容易被取出 [1] 。许多实验室已进行了皮肤成纤维细胞的自体移植动物实验,并观察到外源基因的有效表达。近年来,皮肤成纤维细胞受到重视,特别是皮肤成纤维细胞途径对血友病B基因治疗 [2] 获得成功后,该细胞应用于其它病的基因治疗广泛推广,且成纤维细胞可用于肌肉注射,并与肌纤维融合,这一特性使该类细胞在基因治疗中有更大的价值 [3] 。我们已从人皮肤中分离出成纤维细胞,已培养到60代,并已建系;通过连续细胞形态学观察、染色体核型分析、致瘤性试验、内毒素试验、支原体、衣原体检测、细菌、真菌、病毒检测及异常毒性试验等一系列安全性试验,结果提示是安全的,可作为临床基因治疗的载体细胞和靶细胞 [4] 。
人组织纤溶酶原激活剂(TPA),被认为是血管系统(动脉和静脉)内初期血栓清除的关键酶,其防治血栓形成主要有以下潜在机制:(1)直接降低纤维蛋白成分;(2)减少活化血小板与纤维蛋白的聚集;(3)抑制纤维蛋白原依赖的血小板在早期纤维蛋白裂解产物作用下重新聚集;(4)降低血栓与纤维蛋白的结合 [5] 。有文献证明,TPA主要由内皮细胞分泌,并储存于内皮细胞的魏柏-帕拉得小体中,常常伴随血管性血友病因子(vWf)释放,随血液循环运输到全身各组织 [6] 。蛋白质型TPA由527个氨基酸构成,在人体内半衰期约6~8min,分布广泛,含量低,正常情况下,血液中含量为4~20ng/ml,其作用是结合血纤维蛋白,并能激活血纤维蛋白溶酶原,使其转化成具有生物活性的血纤维蛋白溶酶,后者可水解血栓的基质,即血纤维蛋白,使凝血块溶解,血管再通 [7] 。试验证明,在诱导大猩猩弥漫性血管内凝血时,血浆内TPA水平在数分钟内增加50倍以上 [6] ,说明血栓增加时,TPA释放增加,即血栓刺激TPA释放,并很快检测到血液中纤维蛋白降解产物(FDP)出现,血栓性疾病的发生是内源性TPA的剂量不够产生的,因此,国内外有一些医学工作者用商品化的蛋白质型TPA作为冠心病急性心肌梗死溶栓治疗的抢救性药物,使用剂量为0.5mg/kg,取得了一定的效果 [8] ,但蛋白质型TPA药物昂贵,在人体内半衰期短,需长期用药,且TPA药物剂量不好控制,即大剂量的TPA容易引起颅内及其它器官出血等严重并发症,所以许多学者想到要用基因治疗的方法,即导入TPA基因入患者体内,促其分泌蛋白质,以其持续性稳定的低剂量的产生TPA蛋白质,从而达到治疗并预防冠状动脉栓塞,并减少或防止出血发生,同时能防止停药引起的血栓反跳 [9] 。赵永
波等 [10] 构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA质粒,并获 得了较好的表达。
本研究构建的pcDNA3.1(+)TPA真核表达载体转染人皮肤成纤维细胞,阳性克隆酶切电泳可得到一1700bp左右的泳带,经测序证明为克隆到pcDNA3.1(+)上的TPA cDNA,且TPAcDNA序列与发表的人TPAcDNA序列完全相同,阅读框完全正确。阳性质粒pcDNA(+)TPA转染人皮肤成纤维细胞后,提取细胞总RNA,进行RT-PCR扩增出相应大小(515bp)的DNA片段,pcDNA3.1(+)空载体质粒转染的细胞则无相应的DNA片段。酶联免疫吸附(ELISA)法行TPA基因表达蛋白定量检测结果为647.8ng/10 6 细胞/24h,而TPA本底高的HT1080细胞才35.3ng/10 6细胞/24h;发色底物法测得外源性TPA活性为125.0IU/10 6 细胞/24h,而本身分泌TPA高的HT1080细胞才10.6IU/10 6 细胞/24h。说明pcDNA3.1(+)TPA转染皮肤成纤维细胞的效率是相当高的,为真核表达载体pcDNA3.1(+)TPA今后用于缺血性心脏病基因治疗提供了理论依据和技术指导。
参考文献
1 孙树权,张平武,戴建新,等.基因工程原理与方法,北京:人民军医出版社,2001,251.
2 Qiu X,Lu D,Zhou J,et al.Implantation of autologous skin fibroblast genetically modified to secrete clotting factorⅨpartially corrects the hemorrhagictendencies in two hemophilia B patients.Chin Med J(Enˉgl),1996,109(11):832-839.
3 唐镇生,应其龙,田新华.分子外科与基因治疗,上海:上海医科大学出版社,1999,253.
4 陈勇,陈玉祥,龙志高,等.皮肤成纤维细胞体外培养的安全性实验研究.中国医师杂志,2002,4(11):1176-1179.
5 David A,Dichek,Johanna Anderson,et al.Enhanced in ivvo Anˉtithromboticeffects of endothelial cells expressing recombinant plasminoˉgenactivators transduced with retroviral vectors.Circulation,1996,93(2):301-309.
6 Rosnoblet C,Vischer UM,Gerand RD,et al.Storage of tissue-type plasminogen activator in Weibel-Palade bodies of human endothelial cells.Arterioscler Thromb Vasc Biol1999,19(7):1796-1803.
7 王凯,赖良学,付殿国,等.人组织型纤溶酶原激活剂乳腺定位表达载体的构建及其表达.高技术通讯,1999,10,52-55.
8 Gibson CM,Cannon CP,Murphy SA,et al.Weight-adjusted dosing of TNK-tissue plasminogen activator and its relation to angiographic outcomes in the thrombolysis in myocardial infarction10B trial.TIMI10B Investigators.Am J Cardiol,1999,84(9):976-980.
9 Waugh JM,KattashM,Li J,et al.Gene therapy to promote thromboreˉsistance:Local over expression of tissue plasminogen activator toprevent arterial thrombosis in an in vivo rabbit model.Proc Natl Acad Sci USA,1999,96(3):1065-1070.
10 赵永波,李钰,张贵演,等.携带tPA基因转移的真核表达载体的构建研究.中国地方病杂志,1999,18(6):401-403.
基金项目:国家自然科学基金(30200280);湖南省自然科学基金(01JJY2077,01ssy2008-17);美国中华医学基金项目(99-698)
作者单位:1 410011湖南长沙中南大学湘雅二医院胸心外科
2 410078中国医学遗传学国家重点实验室
(编辑 使臻)(杨进福)