高脂血症家兔心肌、血管壁受体相关蛋白的表达研究
【摘要】 目的 探讨受体相关蛋白(RAP)与脂代谢的关系。方法 制备实验性家兔高脂血症动物模型，运用分子生物学技术克隆RAP基因片段，制备GST-RAP融合蛋白，用单克隆技术制备抗RAP单克隆抗体rapF2，用Western-Blot方法及免疫组化法观察高脂血症家兔心肌，血管壁中RAP的表达及分布。结果 与对照组相比，高脂血症组心肌、血管壁中RAP表达增加，且主要分布于心脏的外膜、冠状动脉内壁与外周血管壁的内、外膜，并在67～94KD间出现特异表达带。结论 血液中过量的脂质及脂质代谢的紊乱可引起血管壁的病理改变并伴随RAP表达增加，RAP表达可能与脂质的代谢过程密切相关。
关键词 受体相关蛋白 表达 高脂血症
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)09-0773-03
Research on expression of receptor-assciated protein(RAP) in the cardiac muscle，vascular wall in hyperlipemia in rabbit
, 百拇医药
Hu Yingqing，Wang Xiaoying，Qian Jihu，et al.
Department of Immunity，Nantong Medical College，Jiang su226001.
【Abstract】 Objective To investigate the expression and distribution of the receptor-assciated protein(RAP)in cardiac muscle，coronary and vascular wall in hyperlipemia in rabbits.Methods The hyperlipemia model was esˉtablished in rabbits.Fragment of gene(RAP)was gotten by RT-PCR，and the recombinant plasmid(PGEX-RAP)was constructed by inserting the RAP-cDNA into the PGEX.The recombinant plasmid was transfected into DH 5 αand expressed the GST-RAP fusion protein by IPTG inducing.The single-clone antibody against RAP was obtained by single-clone technique after the fusion protion purificated.Expression and distribution of RAPwas showed with Westˉern-bolt and immunohistochemistry technique.Results Compared with control rabbits，the expression of RAP in carˉdiac muscle，coronary and vascular wall in rabbits of hyperlipemia group were increased.The distri
, 百拇医药
butions of RAP were mainly showed in outer and inner membrane of vascular wall and inner of coronary，cardiac outer-membrane.In addiˉtion，discovering a exceptional band in67～94Kd.Conclusion The more lipid and inordinate of metabolism in blood would bring on pathology changing in vascular wall，with increasing express
ion of RAP.The RAP may play a role in the process of metabolism of lipid.
Key words receptor-assciated protein expression hyperlipemia 44KD受体相关蛋白(RAP)因其结构模式属于低密度脂蛋白受体家族 [1] 而受到关注，其确切的生理意义目前尚不清楚。为探讨RAP与脂代谢的相关性，前期研究我们运用分子生物学技术克隆了RAP基因片段，制备了GST-RAP融合蛋白，并已证实RAP在各组织中均有不同程度的分布。近期研究发现RAP在高胆固醇血症动物模型的肾皮质中高表达 [2] ，提示RAP在脂代谢过程中发挥一定的作用。为进一步探明RAP与高胆固醇血症的相关性。本研究制备了高胆固醇血症家兔实验模型，运用单克隆技术制备了抗RAP单克隆抗体，用Western-Blot方法及免疫组化观察了家兔心肌、血管壁中RAP的表达及分布。
, 百拇医药
1 材料和方法
1.1 实验试剂及实验材料 SP2/0细胞由中科院上海细胞所提供。GST-RAP融合蛋白由本室研制，IPTG(Isopropy1-β-D-thiogal a ctopyranoside)购自Promega公司，IgG/Ap 作者单位:1226001江苏省南通医学院免疫教研室2江苏省南通市通济医院内科 抗体及显色系统试剂购自Brchringer公司，IgG/HRP抗体购自华美公司，恒流稳压电泳仪购自南京大学，四星图像分析系统购自上海复旦大学。7080-全自动生化分析仪购自日立公司。
1.2 基因重组及融合蛋白的制备 用RT-PCR法获得RAP基因片段，插入PGEX表达载体，转化大肠杆菌DH5a，反复克隆后，经限制性内切酶筛选、DNA测序鉴定后，体外用IPTG诱导表达GST-RAP融合蛋白。
1.3 抗RAP单克隆抗体的制备 GST-RAP融合蛋白纯化后作为抗原，免疫BALB/C小鼠，末次抗原尾静脉注射3天后取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，ELISA间接法筛选阳性株，反复克隆获阳性杂交株rapF2，注射入BALB/C小鼠腹腔制备腹水，获得特异性抗RAP单克隆抗体。
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1.4 单克隆抗体的鉴定 组织匀浆提取正常家兔肾皮质天然膜抗原，以纯化RAP为对照，低分子Mark为标准作SDS-PAGE电泳分离，Western-Blot方法分析鉴定。
1.5 高脂血症模型的制备 健康成年新西兰兔12只体重2.0～2.5kg，在实验条件下给普通饲料喂养。10天后，抽取血清用7080-全自动生化分析仪测各血脂水平。动物分笼饲养，随机分两组:对照组6只(NC)，每天喂标准颗粒饲料。高脂组(HC)6只，每天喂高脂饲料(标准饲料+0.2g/kg胆固醇+3ml猪油/只)。10周时耳缘静脉取血，测血脂各项指标。
1.6 Western-Blot分析 各实验组动物用20%乌拉坦麻醉后，取心肌、胸主动脉分别用蛋白提取液(150mmol/L NaCl;10mmol/L Tris-HCl pH7.2;5mmol/L EDTA;1%Trion-100;胆酸钠)提取组织蛋白。离心取上清液测蛋白浓度，5%浓缩胶，10%分离胶进行SDS-PAGE电泳分离，低分子蛋白作标准Mark，分离各组织蛋白，转移至硝酸纤维素薄膜，5%脱脂奶粉封阻，用制备的rap F2单抗为Ⅰ抗，IgG/AP为Ⅱ抗进行免疫印迹分析，RAP表达量用四星图像分析系统进
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行分析。
1.7 免疫组化分析 实验动物麻醉后，取材后固定于甲醛 溶液中。石蜡切片，10%的小牛血清封阻，rapF2为Ⅰ抗，IgG/HRP为Ⅱ抗，进行免疫组化分析。观察模型家兔主动脉升部、弓部及胸主动脉病变情况同时取肝脏、心肌组织和胸主动脉做石蜡切片，HE染色作病理观察
分析。
1.8 统计分析 用SAS软件对血脂实验数据进行统计分析并进行t检验。
2 结果
2.1 单克隆抗体的鉴定 Western-Blotf分析结果显示提取的天然抗原与对照均在44KDa处出现一条特异杂交带，与RAP分子大小一致，说明制备的rapF2抗体特异识别RAP蛋白抗原决定簇。
2.2 实验动物模型制备结果 实验模型组(HC)与对照组(NC)血浆总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、载脂蛋白A(APO-A)、载脂蛋白B(APO-B)水平，见表1。
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表1 高脂血症组与正常对照组血脂水平 (X±s) (略)
病理切片观察结果显示:高脂血症组心肌组织脂肪变性，外膜脂肪组织增生，心肌细胞浑浊肿胀变性。实验模型家兔主动脉升部、弓部及胸主动脉可见黄白色斑点，条纹或隆起小斑块，光镜下内膜里有泡沫细胞浸润，条纹或隆起小斑块表面覆盖的内皮细胞变性坏死，内皮下出现大量胶原纤维与弹力纤维积聚，平滑肌细胞增生。
2.3 Western-Blot分析结果 正常对照组及实验模型组的心肌、血管壁蛋白提取物在44KD处均出现RAP特异表达带，说明RAP在正常状态下亦有表达。但两组表达量有差异。经四星图像分析系统分析显示:高脂组心肌、血管壁RAP的表达量明显高于对照组，见表2。高脂组血管壁提取物位于67～94KD间出现特异表达带见图1。模型组心肌此位置处亦可见微量表达。
图1 心肌、血管壁提取物中RAP表达分析(Western-blot)(略)
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2.4 免疫组化观察结果 免疫组化结果显示:心脏外膜明
显阳性，心肌组织内DAB棕色颗粒大多分布在冠状动脉管 壁，胸主动脉内、外膜及与血管平滑肌交界处的间质内，RAP表达较丰富。
表2 高胆固醇血症模型家兔心肌、血管壁RAP的表达量 (%)(略)
3 讨论
受体相关蛋白(RAP)其蛋白相对分子质量为44KD，分子空间结构模式类似于低密度脂蛋白受体的构成，RAP属于低密度脂蛋白受体家庭成员。目前，RAP的生理意义并没有搞清楚。配体印迹、亲和层析和密度梯度法证实RAP可以和低密度脂蛋白受体相关蛋白结合，且这种结合是钙离子依赖性的 [3] 。生物化学研究显示，细胞表面存在的RAP能有效地抑制配体与细胞表面低密度脂蛋白结合的作用 [4，5] 。前期工作我们已发现RAP在许多组织中均有不同程度的分布。有学者用免疫细胞化学显示，在L2细胞中，RAP在内质网内含量极其丰富，提示RAP在细胞内发挥某种功能。
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高胆固醇血症以血浆中的血脂增高，胆固醇增高、脂质代谢紊乱为特征。2～4周高脂饮食动物可见主动脉及胸部有灶性内皮细胞肿胀，核型不规则。10周龄实验模型动物主动脉升部、弓部及胸主动脉可见黄白色斑点，条纹或隆起小斑块，光镜下内膜里有泡沫细胞浸润，出现动脉粥样硬化斑块，其表面覆盖的内皮细胞变性坏死，内皮下出现大量胶原纤维与弹力纤维积聚，平滑肌细胞增生。上述形态的改变表明血脂的增高最终导致动脉粥样硬化斑块的形成，是血液中高浓度的脂质及脂类物质所引起的血管壁病理变化的基础上发展而来的。
本实验的Western-Blot分析结果显示:高脂血症家兔心肌、血管壁蛋白提取物RAP表达量明显高于对照组，血管壁提取物出现另一条比44KD分子量大的特异蛋白表达带，该蛋白与RAP具有共同的抗原决定簇，分子量在67～94KD间，可能为RAP的代谢物或结合产物。免疫组化结果显示高脂组冠状动脉及外周血管壁的内、外膜部位RAP表达丰富。上述结果提示:血液中过量的脂质及脂质代谢的紊乱可引起血管壁的病理改变，并伴随RAP表达增加，推测RAP表达可能与脂质的代谢过程密切相关。RAP是否参与了脂质在血管内外的转运或脂质在血管壁的沉积还有待进一步研究。
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参考文献
1 Nielsen PR，Ellgaard L，Etzerodt M，et al.The solution struture of the N -terminal domain of alpha2-macroglobulin receptor-associated proˉtein.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(14):7521-7525.
2 胡迎青，徐广飞，倪恒键，等.高胆固醇血症肾皮质中RAP的表达.中国临床医学，2002，9(3):210-212.
3 Orlando RA，Farquhar MG.Functional domains of the receptor-associˉated protein(RAP).Proc Acad Sci USA，1994，91(8):3161-3165.4 Rasmussen LK，EllgaardL，Jensen PH，et al.Localization of a single transglutaminase-reactive glutamine in the third do-main of RAP，the alph2-macroglobulin recepor-associated protein.J Protein Chem，1999，18(1):69-73.
5 Bacskai BJ，Xia MQ，Strickland DK，et al.he endocytic receptor protein LRP also mediates neuronal calcium signaling via N-methyl-D-asˉpartate receptors.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(21):11551-11556.
(收稿日期:2003-05-24)
(编辑 一坤), http://www.100md.com
关键词 受体相关蛋白 表达 高脂血症
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)09-0773-03
Research on expression of receptor-assciated protein(RAP) in the cardiac muscle，vascular wall in hyperlipemia in rabbit
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Hu Yingqing，Wang Xiaoying，Qian Jihu，et al.
Department of Immunity，Nantong Medical College，Jiang su226001.
【Abstract】 Objective To investigate the expression and distribution of the receptor-assciated protein(RAP)in cardiac muscle，coronary and vascular wall in hyperlipemia in rabbits.Methods The hyperlipemia model was esˉtablished in rabbits.Fragment of gene(RAP)was gotten by RT-PCR，and the recombinant plasmid(PGEX-RAP)was constructed by inserting the RAP-cDNA into the PGEX.The recombinant plasmid was transfected into DH 5 αand expressed the GST-RAP fusion protein by IPTG inducing.The single-clone antibody against RAP was obtained by single-clone technique after the fusion protion purificated.Expression and distribution of RAPwas showed with Westˉern-bolt and immunohistochemistry technique.Results Compared with control rabbits，the expression of RAP in carˉdiac muscle，coronary and vascular wall in rabbits of hyperlipemia group were increased.The distri
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butions of RAP were mainly showed in outer and inner membrane of vascular wall and inner of coronary，cardiac outer-membrane.In addiˉtion，discovering a exceptional band in67～94Kd.Conclusion The more lipid and inordinate of metabolism in blood would bring on pathology changing in vascular wall，with increasing express
ion of RAP.The RAP may play a role in the process of metabolism of lipid.
Key words receptor-assciated protein expression hyperlipemia 44KD受体相关蛋白(RAP)因其结构模式属于低密度脂蛋白受体家族 [1] 而受到关注，其确切的生理意义目前尚不清楚。为探讨RAP与脂代谢的相关性，前期研究我们运用分子生物学技术克隆了RAP基因片段，制备了GST-RAP融合蛋白，并已证实RAP在各组织中均有不同程度的分布。近期研究发现RAP在高胆固醇血症动物模型的肾皮质中高表达 [2] ，提示RAP在脂代谢过程中发挥一定的作用。为进一步探明RAP与高胆固醇血症的相关性。本研究制备了高胆固醇血症家兔实验模型，运用单克隆技术制备了抗RAP单克隆抗体，用Western-Blot方法及免疫组化观察了家兔心肌、血管壁中RAP的表达及分布。
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1 材料和方法
1.1 实验试剂及实验材料 SP2/0细胞由中科院上海细胞所提供。GST-RAP融合蛋白由本室研制，IPTG(Isopropy1-β-D-thiogal a ctopyranoside)购自Promega公司，IgG/Ap 作者单位:1226001江苏省南通医学院免疫教研室2江苏省南通市通济医院内科 抗体及显色系统试剂购自Brchringer公司，IgG/HRP抗体购自华美公司，恒流稳压电泳仪购自南京大学，四星图像分析系统购自上海复旦大学。7080-全自动生化分析仪购自日立公司。
1.2 基因重组及融合蛋白的制备 用RT-PCR法获得RAP基因片段，插入PGEX表达载体，转化大肠杆菌DH5a，反复克隆后，经限制性内切酶筛选、DNA测序鉴定后，体外用IPTG诱导表达GST-RAP融合蛋白。
1.3 抗RAP单克隆抗体的制备 GST-RAP融合蛋白纯化后作为抗原，免疫BALB/C小鼠，末次抗原尾静脉注射3天后取脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合，ELISA间接法筛选阳性株，反复克隆获阳性杂交株rapF2，注射入BALB/C小鼠腹腔制备腹水，获得特异性抗RAP单克隆抗体。
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1.4 单克隆抗体的鉴定 组织匀浆提取正常家兔肾皮质天然膜抗原，以纯化RAP为对照，低分子Mark为标准作SDS-PAGE电泳分离，Western-Blot方法分析鉴定。
1.5 高脂血症模型的制备 健康成年新西兰兔12只体重2.0～2.5kg，在实验条件下给普通饲料喂养。10天后，抽取血清用7080-全自动生化分析仪测各血脂水平。动物分笼饲养，随机分两组:对照组6只(NC)，每天喂标准颗粒饲料。高脂组(HC)6只，每天喂高脂饲料(标准饲料+0.2g/kg胆固醇+3ml猪油/只)。10周时耳缘静脉取血，测血脂各项指标。
1.6 Western-Blot分析 各实验组动物用20%乌拉坦麻醉后，取心肌、胸主动脉分别用蛋白提取液(150mmol/L NaCl;10mmol/L Tris-HCl pH7.2;5mmol/L EDTA;1%Trion-100;胆酸钠)提取组织蛋白。离心取上清液测蛋白浓度，5%浓缩胶，10%分离胶进行SDS-PAGE电泳分离，低分子蛋白作标准Mark，分离各组织蛋白，转移至硝酸纤维素薄膜，5%脱脂奶粉封阻，用制备的rap F2单抗为Ⅰ抗，IgG/AP为Ⅱ抗进行免疫印迹分析，RAP表达量用四星图像分析系统进
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行分析。
1.7 免疫组化分析 实验动物麻醉后，取材后固定于甲醛 溶液中。石蜡切片，10%的小牛血清封阻，rapF2为Ⅰ抗，IgG/HRP为Ⅱ抗，进行免疫组化分析。观察模型家兔主动脉升部、弓部及胸主动脉病变情况同时取肝脏、心肌组织和胸主动脉做石蜡切片，HE染色作病理观察
分析。
1.8 统计分析 用SAS软件对血脂实验数据进行统计分析并进行t检验。
2 结果
2.1 单克隆抗体的鉴定 Western-Blotf分析结果显示提取的天然抗原与对照均在44KDa处出现一条特异杂交带，与RAP分子大小一致，说明制备的rapF2抗体特异识别RAP蛋白抗原决定簇。
2.2 实验动物模型制备结果 实验模型组(HC)与对照组(NC)血浆总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、载脂蛋白A(APO-A)、载脂蛋白B(APO-B)水平，见表1。
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表1 高脂血症组与正常对照组血脂水平 (X±s) (略)
病理切片观察结果显示:高脂血症组心肌组织脂肪变性，外膜脂肪组织增生，心肌细胞浑浊肿胀变性。实验模型家兔主动脉升部、弓部及胸主动脉可见黄白色斑点，条纹或隆起小斑块，光镜下内膜里有泡沫细胞浸润，条纹或隆起小斑块表面覆盖的内皮细胞变性坏死，内皮下出现大量胶原纤维与弹力纤维积聚，平滑肌细胞增生。
2.3 Western-Blot分析结果 正常对照组及实验模型组的心肌、血管壁蛋白提取物在44KD处均出现RAP特异表达带，说明RAP在正常状态下亦有表达。但两组表达量有差异。经四星图像分析系统分析显示:高脂组心肌、血管壁RAP的表达量明显高于对照组，见表2。高脂组血管壁提取物位于67～94KD间出现特异表达带见图1。模型组心肌此位置处亦可见微量表达。
图1 心肌、血管壁提取物中RAP表达分析(Western-blot)(略)
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2.4 免疫组化观察结果 免疫组化结果显示:心脏外膜明
显阳性，心肌组织内DAB棕色颗粒大多分布在冠状动脉管 壁，胸主动脉内、外膜及与血管平滑肌交界处的间质内，RAP表达较丰富。
表2 高胆固醇血症模型家兔心肌、血管壁RAP的表达量 (%)(略)
3 讨论
受体相关蛋白(RAP)其蛋白相对分子质量为44KD，分子空间结构模式类似于低密度脂蛋白受体的构成，RAP属于低密度脂蛋白受体家庭成员。目前，RAP的生理意义并没有搞清楚。配体印迹、亲和层析和密度梯度法证实RAP可以和低密度脂蛋白受体相关蛋白结合，且这种结合是钙离子依赖性的 [3] 。生物化学研究显示，细胞表面存在的RAP能有效地抑制配体与细胞表面低密度脂蛋白结合的作用 [4，5] 。前期工作我们已发现RAP在许多组织中均有不同程度的分布。有学者用免疫细胞化学显示，在L2细胞中，RAP在内质网内含量极其丰富，提示RAP在细胞内发挥某种功能。
, 百拇医药
高胆固醇血症以血浆中的血脂增高，胆固醇增高、脂质代谢紊乱为特征。2～4周高脂饮食动物可见主动脉及胸部有灶性内皮细胞肿胀，核型不规则。10周龄实验模型动物主动脉升部、弓部及胸主动脉可见黄白色斑点，条纹或隆起小斑块，光镜下内膜里有泡沫细胞浸润，出现动脉粥样硬化斑块，其表面覆盖的内皮细胞变性坏死，内皮下出现大量胶原纤维与弹力纤维积聚，平滑肌细胞增生。上述形态的改变表明血脂的增高最终导致动脉粥样硬化斑块的形成，是血液中高浓度的脂质及脂类物质所引起的血管壁病理变化的基础上发展而来的。
本实验的Western-Blot分析结果显示:高脂血症家兔心肌、血管壁蛋白提取物RAP表达量明显高于对照组，血管壁提取物出现另一条比44KD分子量大的特异蛋白表达带，该蛋白与RAP具有共同的抗原决定簇，分子量在67～94KD间，可能为RAP的代谢物或结合产物。免疫组化结果显示高脂组冠状动脉及外周血管壁的内、外膜部位RAP表达丰富。上述结果提示:血液中过量的脂质及脂质代谢的紊乱可引起血管壁的病理改变，并伴随RAP表达增加，推测RAP表达可能与脂质的代谢过程密切相关。RAP是否参与了脂质在血管内外的转运或脂质在血管壁的沉积还有待进一步研究。
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参考文献
1 Nielsen PR，Ellgaard L，Etzerodt M，et al.The solution struture of the N -terminal domain of alpha2-macroglobulin receptor-associated proˉtein.Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(14):7521-7525.
2 胡迎青，徐广飞，倪恒键，等.高胆固醇血症肾皮质中RAP的表达.中国临床医学，2002，9(3):210-212.
3 Orlando RA，Farquhar MG.Functional domains of the receptor-associˉated protein(RAP).Proc Acad Sci USA，1994，91(8):3161-3165.4 Rasmussen LK，EllgaardL，Jensen PH，et al.Localization of a single transglutaminase-reactive glutamine in the third do-main of RAP，the alph2-macroglobulin recepor-associated protein.J Protein Chem，1999，18(1):69-73.
5 Bacskai BJ，Xia MQ，Strickland DK，et al.he endocytic receptor protein LRP also mediates neuronal calcium signaling via N-methyl-D-asˉpartate receptors.Proc Natl Acad Sci USA，2000，97(21):11551-11556.
(收稿日期:2003-05-24)
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