胰蛋白酶抑制剂研究进展
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)10-0891-03
胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor，TI)泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的一类物质，其分子量一般都比较小，作用机制清楚，是研究蛋白质构效关系的合适材料 [1] 。在蛋白质的一级结构、溶液构象、晶体结构、作用机制、功能区域拆分、构象重组、基因结构与表达等方面的研究工作中是一个较为理想的研究对象。作为基因表达的初级产物，蛋白酶抑制剂已经成为植物抗虫基因工程较理想的工具。生物体内许多重要的生理过程都受蛋白酶及其抑制剂的调控，从而在疾病的诊断、治疗和预防等方面，作为新型药物显示出了广阔的应用前景。
根据TI来源不同分为许多种类，如从牛肺或牛胰中提取的抑肽酶(aprotinin)、从人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制剂(urinary trypsin inhibitor-UTI)、从黄豆中提取的大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor-SBTI)、从南瓜籽中提取的南瓜胰蛋白酶抑制剂(Cucurbita maxima trypsin inhibitor-CMTI)等，另外还有很多人工合成的，如甲磺酸
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胍己苯脂(gabesate mesyl)等，这些TI能够抑制丝氨酸蛋白酶的活性。丝氨酸蛋白酶是一类重要的蛋白水解酶，在体内广泛存在。胰脏分泌的消化酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶以及血液中的凝血酶和组织中控制血流的激肽释放酶等都属于丝氨酸蛋白酶家族。这些酶在体内发挥不同的调节作用，维持机体正常的生理功能。这些酶的催化中心都有一个活性特异的丝氨酸侧链，在与底物作用时该丝氨酸侧链和底物上特异的肽键部位形成一个过渡的四面体结构，其抑制剂与其活性中心结合的部位同底物与该类酶结合的部位非常相似，同时抑制剂的结构类似于酶与底物作用时酶与底物变构形成的四面体结构，抑制剂上的活性氨基酸残基占据了该类蛋白酶活性中心氨基酸侧链所形成的特异性的口袋结构，使底物上被水解肽键的羰基氧不能靠近活性中心部位，从而无法与酶进行氢键或疏水键的结合 [2]，发挥抑制丝氨酸蛋白酶活性的作用。
1 TI在临床上的应用
丝氨酸蛋白酶的正常作用受到破坏或与机体自身存在的抑制剂之间的平衡发生异常，均会引起机体组织的损伤或某些病变，用TI可对这些损伤和病变进行防治。在疾病的防治方面，TI在临床上广泛用于急性胰腺炎、手术后器官功能衰竭以及再灌注损伤、早产、肺气肿、脑水肿、肿瘤的浸润和转移等疾病。
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1.1 用于治疗急性胰腺炎 急性胰腺炎发病时，胰腺中的血清淀粉酶、溶酶体酶、组织蛋白酶B以及苹果酸脱氢酶的水平均会显著增高，溶酶体酶、组织蛋白酶B能激活胰蛋白酶原，从而激活许多其它的消化酶，导致多种蛋白酶在胰腺内的过度累积，引起胰腺本身的炎症及缺血性坏死等 症状，炎性介质及毒素的进一步释放将导致全身的炎性反应综合征，严重时会出现多器官障碍。胰蛋白酶抑制剂可以抑制许多对导致急性胰腺炎起关键作用的酶，如胰蛋白酶、磷脂酶A、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶等，并能抑制溶酶体酶，稳定溶酶体膜，从而起到对胰腺的保护作用。目前临床上应用的几种胰蛋白酶抑制剂类药物对急性胰腺炎均有显著疗效 [3] 。
1.2 用于心脏外科手术体外循环(CPB) 在CPB过程中机体处于一种非生理状态，同时伴有缺血、缺氧和各种酶、炎性介质、自由基的大量释放，体内很多丝氨酸蛋白酶释放也较多，而其抑制剂消耗较大，引起二者平衡的失调，导致凝血异常以及心脏、肺、肾等重要器官和血管的内皮损伤，并可引起术后出血、器官功能衰竭及再灌注损伤等 [4] 。TI在CPB中既有抗凝血作用，又有止血作用:其抗凝血作用是因为它可以抑制舒血管素的活化，并可抑制激肽释放酶，间接抑制凝血因子XII的活化，阻断内源性凝血途径;其止血作用是由于它能抑制纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原的激活因子，阻止纤维蛋白溶酶原的活化，同时可预防血小板损伤 [5] 。另外TI还可通过降低纤维蛋白原的降解产物水平来减轻其对再灌注心肌的损害 [6] 。
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1.3 治疗脑水肿 脑缺血时血液及脑组织中缓激肽的水平升高，其能够激活磷脂酶A 2 ，加速花生四烯酸的释放，花生四烯酸及其代谢产物如白三烯、前列腺素等均为血管活性物质，可导致血管通透性增加，诱发脑水肿 [7] 。TI能够抑制激肽酶的生成 [8] ，并可抑制溶酶体活化，从而达到改善脑水肿的作用。
1.4 防治肺再灌注损伤 再灌注损伤在肺移植后期是个很严重的问题，再灌注过程中引起血管内皮细胞发生某些变化，激活沉积在夹紧的一侧肺上的中性粒细胞 [9] ，活化的中性粒细胞释放中性粒细胞弹性蛋白酶，该酶能够使胶原蛋白分解，结果导致渗透性加速性肺水肿。TI对中性粒细胞弹性蛋白酶和中性粒细胞组织蛋白酶G有抑制作用，并可以稳定溶酶体膜 [10] ，避免损伤的进一步发展。
1.5 用于预防感染引起的早产 因感染引起的绒毛膜羊膜炎是迫切早产的主要发病机制之一，研究证明炎性介质浓度过高以及随之而产生的多形核中性粒细胞弹性酶(PMNE)在其中有重要的作用 [11] 。临床实验证明TI可以通过抑制相关的炎性介质，如白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)以及白介素8(IL-8)，并抑制PMNE以防止早产。
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1.6 抑制肿瘤的浸润与转移 肿瘤的转移是肿瘤的恶性特征之一，是大多数实体瘤患者死亡的主要原因。基底膜是细胞外基质的一种，其破坏是肿瘤浸润转移的标志。肿瘤细胞对基底膜的浸润可分为3步:粘附、溶解和转移。其中溶解过程是由蛋白酶降解瘤细胞下方的基底膜。由此可见，蛋白溶解酶在瘤细胞浸润转移中的作用必不可少，其中多种丝氨酸蛋白酶浓度与肿瘤的侵袭呈正相关。研究证明，人体内许多肿瘤细胞上都有TI的受体 [12] ，TI与受体的结合能够调节纤维蛋白酶的活性，抑制其对蛋白质的分解作用，阻断肿瘤细胞的浸润和转移过程，并重新修复细胞屏障。此外，TI还可用于治疗肺气肿、关节炎等，在胰岛的移植过程中还可抑制各种丝氨酸蛋白酶的活性，从而提高移植的成功率 [13] 。
2 植物来源TI的研究概况
TI普遍存在于动物、植物、微生物体内。多数已开发的胰蛋白酶抑制剂来源于人和动物，如人尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)、抑肽酶等，但它们一般具有较大的分子量，结构复杂，对其提取分离以及研究合成并进一步开发都存在着很多困难。而且它们在发挥治疗作用的同时也存在诸多的不足之处，如二者分别提取于人尿、牛肺，易受到病原微生物(如病毒等)的污染，且分子量较大，可引起过敏反应等。为了克服这些不足之处，近年来，科研工作者已将目光转向品种繁多的植物，目前已从多种植物组织中发现并提取获得各类TI，并已对从大豆、豇豆、赤小豆、荞麦 [14] 、波叶青牛胆 [15] 、苦瓜、南瓜、慈姑、海芋、刺桐 [16] 白杨 [17] 芥菜 [18] 以及太湖蓝藻等不同植物的不同组织中提取的TI进行了多方面的研究。这些TI有的在植物体内已经存在，有的是因为受到害虫侵害或病原菌感染诱导产生 [19] 。它们具有相似的活性位点和作用机制，分子量大小不等，对各种丝氨酸蛋白酶的抑制作用程度也各不相同 [20] 。植物体内存在的TI被认为是植物天然的自我防御体系，是植物抗病基因工程的重要基因来源。它们一般分子量较小，在自然界的含量丰富，活性明确，非常适用于研究蛋白质的分子进化、蛋白质的结构与功能的关系及蛋白质分子间相互作用机制等。研究证明，这些TI对胰蛋白酶、血浆激肽释放酶、凝血酶、血纤维溶解酶、凝血因子Xa、凝血因子XIIa等具有较强的抑制作用 [21] 。现将几种研究比较多的介绍如下。
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2.1 大豆来源TI型抑制剂 通过对所研究的大豆来源的TI的结构和性质的研究，发现这些TI可以分为两大类:其中一类为Browan-Birk(BBTi)抑制剂，分子量约为8KD，含较多的二硫键，一个抑制剂分子可以结合2分子的胰蛋白酶，属双头抑制剂;另一类为Kunitz(KTi)抑制剂，分子量为21KD，含有2对二硫键，一个抑制剂分子可以结合一分子胰蛋白酶，属单头抑制剂。通常认为这两类抑制剂具有贮藏、调节内源蛋白酶活性及植物防御作用。其中KTi型抑制剂在大豆种子中含量最丰富，能够特异性的抑制胰蛋白酶，迄今为止，至少已有4种基因被克隆，并通过转基因技术在烟草、水稻、小麦等作物获得抗性植株;而BBTi型抑制剂则对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及弹性蛋白酶3种相关的蛋白没发生特异的抑制作用 [22] ，近年来发现，BBTi型抑制剂还具有抗炎和抗肿瘤的作用 [23] 。
2.2 南瓜籽来源TI 南瓜籽抑制剂家族由20多种不同的抑制剂组成。所有这些抑制剂均是由属于南瓜家族的植物种子中分离出来的。它们的生理作用虽然不是很清楚，但它们都是高表达的蛋白，是丝氨酸蛋白酶的可逆性抑制剂，绝大部分能够强烈抑制胰蛋白酶。这些抑制剂都较小，一般由28～31个氨基酸组成，而且在结构上都有一个异常的由3个二硫键组成的结状结构。目前对该家族研究最多的是CMTIⅠ和CMTIⅢ，它们均由29个氨基酸组成，可以高效的抑制牛β-胰蛋白酶，缔合平衡常数(associasion equilibˉrium constant)分别为3.2×10 11 和6.8×10 11 ，其活性部位经 证明为5位的Arg和6位的Ile形成的肽键结构，这一结构破坏后整个分子骨架将会发生变化，表现为多数原子在质谱中有较大的化学位移变化，而且该部位肽键的破坏将导致两个抑制剂的抑制作用大大降低。目前国内外对于CMTIⅠ和CMTIⅢ的研究多着眼于其三维立体结构，通过NMR及X-射线衍射等方法对CMTIⅠ和CMTIⅢ，以及它们和胰蛋白酶结合后形成的复合物的晶体结构进行了深入的研究，并通过对CMTIⅠ及CMTIⅢ的某些氨基酸残基进行定位突变，研究并阐明了其分子作用机制 [24] 及其与胰蛋白酶作用的构效关系。以这些研究结果为依据，很多科学家构建了很多与胰蛋白酶作用的底物或对底物进行改造以增强和酶的特异性的结合，丰富了有关蛋白质作用机制的内容。对多种丝氨酸蛋白酶具有抑制作用，对血浆激肽释放酶、组织蛋白酶以及凝血酶具有较强的抑制作用 [25] 。对于人β因子Ⅻa也具有很强的抑制作用。目前世界上对来自该家族的另一个成员———CMTIⅤ研究的也较多，对其空间构型和作用的关系已经有较清晰的认识 [26] 。Shan J等 [27] 研究了CMTIⅤ和人重组凝血因子XⅡ作用有关的数据，有助于阐明该重组凝血因子的作用特点。
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2.3 植物来源TI在农业中的应用
2.3.1 保护植物种子不受昆虫和病原菌的侵害 植物中具有胰蛋白酶抑制剂是植物在进化过程中获得的自我保护的一种特性，这种特性对其生长与繁衍具有明显的价值。研究表明胰蛋白酶抑制剂能抑制昆虫肠道蛋白酶的活性，使昆虫生长发育不良而死亡 [28] 。Ceci LR等 [29] 利用噬菌体表面展示技术对一种芥子植物来源的TI不同突变体进行表达，从中筛选出抑虫活性强的突变体病进行相关机制的研究。另外，胰蛋白酶抑制剂还可以抑制病原菌蛋白酶对寄主细胞的降解，使病原菌营养不足，生长增殖受限，浸染与扩展受阻，从而达到抗病的目的 [30] 。
2.3.2 研究植物胰蛋白酶抑制剂的失活，提高对植物蛋白的利用率 很多植物如大豆等是重要的植物蛋白源，蛋白质含量高，必需氨基酸的组成比例适宜，具有较高的营养价值。但由于胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制以及胰腺的毒性作用，不利于这些植物食品与饲料的开发，因此对植物来源的蛋白酶抑制剂的失活的研究对提高天然植物食品与饲料的营养价值和使用安全性具有重大的意义 [31] 。Ellen MH等 [32] 对反刍动物对植物中含有的TI所形成的天然的防御措施进行研究，发现在反刍动物的第1个胃里通过微生物发酵作用将有害的TI进行降解，从而减少了其对动物本身的毒性作用。
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2.3.3 研制具有较高抗虫性转基因植物 由于胰蛋白酶抑制剂尤其是植物来源的蛋白酶抑制剂，其分子较小，对其分子结构研究的较为透彻，在植物基因工程中将胰蛋白酶抑制剂转入不同的植物，不仅可以使受体植物获得抗性，转入的蛋白酶抑制剂还通过抑制蛋白酶的水解活力，保护其他的防御蛋白不被降解，有效提高植物的防御机制，而且也可以为我们对胰蛋白酶抑制剂抗性的分子机制的研究提供不同的线索。
此外，还可根据植物基因中相应TI基因的有无来作为确定该植物数量性状基因座(quantitative trait locus，QTL)的一个标准 [33] 。
参考文献
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作者单位:1 250012 山东省济南市卫生局信息化服务中心
2 山东大学药学院生化与生物技术药物研究所(硕士研究生)
3 250012 山东省济南市中心医院
(收稿日期:2003-10-07)
(编 辑 晓勇), 百拇医药(贾洪)
胰蛋白酶抑制剂(Trypsin inhibitor，TI)泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的一类物质，其分子量一般都比较小，作用机制清楚，是研究蛋白质构效关系的合适材料 [1] 。在蛋白质的一级结构、溶液构象、晶体结构、作用机制、功能区域拆分、构象重组、基因结构与表达等方面的研究工作中是一个较为理想的研究对象。作为基因表达的初级产物，蛋白酶抑制剂已经成为植物抗虫基因工程较理想的工具。生物体内许多重要的生理过程都受蛋白酶及其抑制剂的调控，从而在疾病的诊断、治疗和预防等方面，作为新型药物显示出了广阔的应用前景。
根据TI来源不同分为许多种类，如从牛肺或牛胰中提取的抑肽酶(aprotinin)、从人尿中提取的人尿胰蛋白酶抑制剂(urinary trypsin inhibitor-UTI)、从黄豆中提取的大豆胰蛋白酶抑制剂(soybean trypsin inhibitor-SBTI)、从南瓜籽中提取的南瓜胰蛋白酶抑制剂(Cucurbita maxima trypsin inhibitor-CMTI)等，另外还有很多人工合成的，如甲磺酸
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胍己苯脂(gabesate mesyl)等，这些TI能够抑制丝氨酸蛋白酶的活性。丝氨酸蛋白酶是一类重要的蛋白水解酶，在体内广泛存在。胰脏分泌的消化酶，如胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、弹性蛋白酶以及血液中的凝血酶和组织中控制血流的激肽释放酶等都属于丝氨酸蛋白酶家族。这些酶在体内发挥不同的调节作用，维持机体正常的生理功能。这些酶的催化中心都有一个活性特异的丝氨酸侧链，在与底物作用时该丝氨酸侧链和底物上特异的肽键部位形成一个过渡的四面体结构，其抑制剂与其活性中心结合的部位同底物与该类酶结合的部位非常相似，同时抑制剂的结构类似于酶与底物作用时酶与底物变构形成的四面体结构，抑制剂上的活性氨基酸残基占据了该类蛋白酶活性中心氨基酸侧链所形成的特异性的口袋结构，使底物上被水解肽键的羰基氧不能靠近活性中心部位，从而无法与酶进行氢键或疏水键的结合 [2]，发挥抑制丝氨酸蛋白酶活性的作用。
1 TI在临床上的应用
丝氨酸蛋白酶的正常作用受到破坏或与机体自身存在的抑制剂之间的平衡发生异常，均会引起机体组织的损伤或某些病变，用TI可对这些损伤和病变进行防治。在疾病的防治方面，TI在临床上广泛用于急性胰腺炎、手术后器官功能衰竭以及再灌注损伤、早产、肺气肿、脑水肿、肿瘤的浸润和转移等疾病。
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1.1 用于治疗急性胰腺炎 急性胰腺炎发病时，胰腺中的血清淀粉酶、溶酶体酶、组织蛋白酶B以及苹果酸脱氢酶的水平均会显著增高，溶酶体酶、组织蛋白酶B能激活胰蛋白酶原，从而激活许多其它的消化酶，导致多种蛋白酶在胰腺内的过度累积，引起胰腺本身的炎症及缺血性坏死等 症状，炎性介质及毒素的进一步释放将导致全身的炎性反应综合征，严重时会出现多器官障碍。胰蛋白酶抑制剂可以抑制许多对导致急性胰腺炎起关键作用的酶，如胰蛋白酶、磷脂酶A、胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶等，并能抑制溶酶体酶，稳定溶酶体膜，从而起到对胰腺的保护作用。目前临床上应用的几种胰蛋白酶抑制剂类药物对急性胰腺炎均有显著疗效 [3] 。
1.2 用于心脏外科手术体外循环(CPB) 在CPB过程中机体处于一种非生理状态，同时伴有缺血、缺氧和各种酶、炎性介质、自由基的大量释放，体内很多丝氨酸蛋白酶释放也较多，而其抑制剂消耗较大，引起二者平衡的失调，导致凝血异常以及心脏、肺、肾等重要器官和血管的内皮损伤，并可引起术后出血、器官功能衰竭及再灌注损伤等 [4] 。TI在CPB中既有抗凝血作用，又有止血作用:其抗凝血作用是因为它可以抑制舒血管素的活化，并可抑制激肽释放酶，间接抑制凝血因子XII的活化，阻断内源性凝血途径;其止血作用是由于它能抑制纤维蛋白溶酶和纤维蛋白溶酶原的激活因子，阻止纤维蛋白溶酶原的活化，同时可预防血小板损伤 [5] 。另外TI还可通过降低纤维蛋白原的降解产物水平来减轻其对再灌注心肌的损害 [6] 。
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1.3 治疗脑水肿 脑缺血时血液及脑组织中缓激肽的水平升高，其能够激活磷脂酶A 2 ，加速花生四烯酸的释放，花生四烯酸及其代谢产物如白三烯、前列腺素等均为血管活性物质，可导致血管通透性增加，诱发脑水肿 [7] 。TI能够抑制激肽酶的生成 [8] ，并可抑制溶酶体活化，从而达到改善脑水肿的作用。
1.4 防治肺再灌注损伤 再灌注损伤在肺移植后期是个很严重的问题，再灌注过程中引起血管内皮细胞发生某些变化，激活沉积在夹紧的一侧肺上的中性粒细胞 [9] ，活化的中性粒细胞释放中性粒细胞弹性蛋白酶，该酶能够使胶原蛋白分解，结果导致渗透性加速性肺水肿。TI对中性粒细胞弹性蛋白酶和中性粒细胞组织蛋白酶G有抑制作用，并可以稳定溶酶体膜 [10] ，避免损伤的进一步发展。
1.5 用于预防感染引起的早产 因感染引起的绒毛膜羊膜炎是迫切早产的主要发病机制之一，研究证明炎性介质浓度过高以及随之而产生的多形核中性粒细胞弹性酶(PMNE)在其中有重要的作用 [11] 。临床实验证明TI可以通过抑制相关的炎性介质，如白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)以及白介素8(IL-8)，并抑制PMNE以防止早产。
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1.6 抑制肿瘤的浸润与转移 肿瘤的转移是肿瘤的恶性特征之一，是大多数实体瘤患者死亡的主要原因。基底膜是细胞外基质的一种，其破坏是肿瘤浸润转移的标志。肿瘤细胞对基底膜的浸润可分为3步:粘附、溶解和转移。其中溶解过程是由蛋白酶降解瘤细胞下方的基底膜。由此可见，蛋白溶解酶在瘤细胞浸润转移中的作用必不可少，其中多种丝氨酸蛋白酶浓度与肿瘤的侵袭呈正相关。研究证明，人体内许多肿瘤细胞上都有TI的受体 [12] ，TI与受体的结合能够调节纤维蛋白酶的活性，抑制其对蛋白质的分解作用，阻断肿瘤细胞的浸润和转移过程，并重新修复细胞屏障。此外，TI还可用于治疗肺气肿、关节炎等，在胰岛的移植过程中还可抑制各种丝氨酸蛋白酶的活性，从而提高移植的成功率 [13] 。
2 植物来源TI的研究概况
TI普遍存在于动物、植物、微生物体内。多数已开发的胰蛋白酶抑制剂来源于人和动物，如人尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)、抑肽酶等，但它们一般具有较大的分子量，结构复杂，对其提取分离以及研究合成并进一步开发都存在着很多困难。而且它们在发挥治疗作用的同时也存在诸多的不足之处，如二者分别提取于人尿、牛肺，易受到病原微生物(如病毒等)的污染，且分子量较大，可引起过敏反应等。为了克服这些不足之处，近年来，科研工作者已将目光转向品种繁多的植物，目前已从多种植物组织中发现并提取获得各类TI，并已对从大豆、豇豆、赤小豆、荞麦 [14] 、波叶青牛胆 [15] 、苦瓜、南瓜、慈姑、海芋、刺桐 [16] 白杨 [17] 芥菜 [18] 以及太湖蓝藻等不同植物的不同组织中提取的TI进行了多方面的研究。这些TI有的在植物体内已经存在，有的是因为受到害虫侵害或病原菌感染诱导产生 [19] 。它们具有相似的活性位点和作用机制，分子量大小不等，对各种丝氨酸蛋白酶的抑制作用程度也各不相同 [20] 。植物体内存在的TI被认为是植物天然的自我防御体系，是植物抗病基因工程的重要基因来源。它们一般分子量较小，在自然界的含量丰富，活性明确，非常适用于研究蛋白质的分子进化、蛋白质的结构与功能的关系及蛋白质分子间相互作用机制等。研究证明，这些TI对胰蛋白酶、血浆激肽释放酶、凝血酶、血纤维溶解酶、凝血因子Xa、凝血因子XIIa等具有较强的抑制作用 [21] 。现将几种研究比较多的介绍如下。
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2.1 大豆来源TI型抑制剂 通过对所研究的大豆来源的TI的结构和性质的研究，发现这些TI可以分为两大类:其中一类为Browan-Birk(BBTi)抑制剂，分子量约为8KD，含较多的二硫键，一个抑制剂分子可以结合2分子的胰蛋白酶，属双头抑制剂;另一类为Kunitz(KTi)抑制剂，分子量为21KD，含有2对二硫键，一个抑制剂分子可以结合一分子胰蛋白酶，属单头抑制剂。通常认为这两类抑制剂具有贮藏、调节内源蛋白酶活性及植物防御作用。其中KTi型抑制剂在大豆种子中含量最丰富，能够特异性的抑制胰蛋白酶，迄今为止，至少已有4种基因被克隆，并通过转基因技术在烟草、水稻、小麦等作物获得抗性植株;而BBTi型抑制剂则对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶及弹性蛋白酶3种相关的蛋白没发生特异的抑制作用 [22] ，近年来发现，BBTi型抑制剂还具有抗炎和抗肿瘤的作用 [23] 。
2.2 南瓜籽来源TI 南瓜籽抑制剂家族由20多种不同的抑制剂组成。所有这些抑制剂均是由属于南瓜家族的植物种子中分离出来的。它们的生理作用虽然不是很清楚，但它们都是高表达的蛋白，是丝氨酸蛋白酶的可逆性抑制剂，绝大部分能够强烈抑制胰蛋白酶。这些抑制剂都较小，一般由28～31个氨基酸组成，而且在结构上都有一个异常的由3个二硫键组成的结状结构。目前对该家族研究最多的是CMTIⅠ和CMTIⅢ，它们均由29个氨基酸组成，可以高效的抑制牛β-胰蛋白酶，缔合平衡常数(associasion equilibˉrium constant)分别为3.2×10 11 和6.8×10 11 ，其活性部位经 证明为5位的Arg和6位的Ile形成的肽键结构，这一结构破坏后整个分子骨架将会发生变化，表现为多数原子在质谱中有较大的化学位移变化，而且该部位肽键的破坏将导致两个抑制剂的抑制作用大大降低。目前国内外对于CMTIⅠ和CMTIⅢ的研究多着眼于其三维立体结构，通过NMR及X-射线衍射等方法对CMTIⅠ和CMTIⅢ，以及它们和胰蛋白酶结合后形成的复合物的晶体结构进行了深入的研究，并通过对CMTIⅠ及CMTIⅢ的某些氨基酸残基进行定位突变，研究并阐明了其分子作用机制 [24] 及其与胰蛋白酶作用的构效关系。以这些研究结果为依据，很多科学家构建了很多与胰蛋白酶作用的底物或对底物进行改造以增强和酶的特异性的结合，丰富了有关蛋白质作用机制的内容。对多种丝氨酸蛋白酶具有抑制作用，对血浆激肽释放酶、组织蛋白酶以及凝血酶具有较强的抑制作用 [25] 。对于人β因子Ⅻa也具有很强的抑制作用。目前世界上对来自该家族的另一个成员———CMTIⅤ研究的也较多，对其空间构型和作用的关系已经有较清晰的认识 [26] 。Shan J等 [27] 研究了CMTIⅤ和人重组凝血因子XⅡ作用有关的数据，有助于阐明该重组凝血因子的作用特点。
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2.3 植物来源TI在农业中的应用
2.3.1 保护植物种子不受昆虫和病原菌的侵害 植物中具有胰蛋白酶抑制剂是植物在进化过程中获得的自我保护的一种特性，这种特性对其生长与繁衍具有明显的价值。研究表明胰蛋白酶抑制剂能抑制昆虫肠道蛋白酶的活性，使昆虫生长发育不良而死亡 [28] 。Ceci LR等 [29] 利用噬菌体表面展示技术对一种芥子植物来源的TI不同突变体进行表达，从中筛选出抑虫活性强的突变体病进行相关机制的研究。另外，胰蛋白酶抑制剂还可以抑制病原菌蛋白酶对寄主细胞的降解，使病原菌营养不足，生长增殖受限，浸染与扩展受阻，从而达到抗病的目的 [30] 。
2.3.2 研究植物胰蛋白酶抑制剂的失活，提高对植物蛋白的利用率 很多植物如大豆等是重要的植物蛋白源，蛋白质含量高，必需氨基酸的组成比例适宜，具有较高的营养价值。但由于胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的抑制以及胰腺的毒性作用，不利于这些植物食品与饲料的开发，因此对植物来源的蛋白酶抑制剂的失活的研究对提高天然植物食品与饲料的营养价值和使用安全性具有重大的意义 [31] 。Ellen MH等 [32] 对反刍动物对植物中含有的TI所形成的天然的防御措施进行研究，发现在反刍动物的第1个胃里通过微生物发酵作用将有害的TI进行降解，从而减少了其对动物本身的毒性作用。
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2.3.3 研制具有较高抗虫性转基因植物 由于胰蛋白酶抑制剂尤其是植物来源的蛋白酶抑制剂，其分子较小，对其分子结构研究的较为透彻，在植物基因工程中将胰蛋白酶抑制剂转入不同的植物，不仅可以使受体植物获得抗性，转入的蛋白酶抑制剂还通过抑制蛋白酶的水解活力，保护其他的防御蛋白不被降解，有效提高植物的防御机制，而且也可以为我们对胰蛋白酶抑制剂抗性的分子机制的研究提供不同的线索。
此外，还可根据植物基因中相应TI基因的有无来作为确定该植物数量性状基因座(quantitative trait locus，QTL)的一个标准 [33] 。
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作者单位:1 250012 山东省济南市卫生局信息化服务中心
2 山东大学药学院生化与生物技术药物研究所(硕士研究生)
3 250012 山东省济南市中心医院
(收稿日期:2003-10-07)
(编 辑 晓勇), 百拇医药(贾洪)