针刺对帕金森病模型大鼠黑质神经细胞凋亡的影响
【摘要】 目的 研究针刺对帕金森病(Parkinson’s disease，PD)模型大鼠黑质神经细胞凋亡的影响。方法 采用末端标记法检测针刺治疗前后PD模型大鼠黑质神经细胞凋亡的情况。结果 针刺治疗能明显抑制PD模型大鼠黑质神经细胞凋亡，其作用和美多巴近似。结论针刺治疗PD可能是通过抑制中脑黑质神经细胞凋亡起作用的。
关键词 帕金森病 针刺治疗细胞凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)10-0871-02
The effect of acupuncture on neuron apoptosis in
mesencephalic substantia nigra of Parkinson’s disease in rat
, 百拇医药 Luo Zhongda，Chen Xinghua，Tang Chunzhi，et al.
Department of Acupuncture，Futian Hospital of Chinese Medicine，Shenzhen518033
【Abstract】 Objective To investigate the effect of acupuncture on neuron apoptosis in mesencephalic substanˉtia nigra of Parkinson’s disease in rat.Methods TUNEL was adopted to detect neuron apoptosis in mesencephalic substantia nigra.Results Acupuncture could significantly suppress neuron apoptosis in mesenceph
, http://www.100md.com
alic substantia niˉgra of Parkinson’s disease in rat.Its effect was quite similar to that of medopa.Conclusion Suppressing neuron apoptosis in mesencephalic substantia nigra of Parkinson’s disease in rat might be one action mechanism of acupuncˉture therapy.
Key words Parkinson’s disease acupuncture therapy apoptosis
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种以中脑黑质多巴胺能神经元严重缺失为主要病变，广泛累及中枢神经系统的较为常见且症候复杂多样的慢性神经元变性性疾病。目前其发病机制尚未明确，但内、外源性神经毒素可能起到重要作用。治疗方面，针灸治疗PD的有效性已为临床及实验研究所证实 [1，2] 。但对其获效机制的研究较少。本研究通过对实验性PD大鼠的针刺治疗，观察了针刺对PD模型大鼠黑质神经细胞凋亡的影响，对针刺治疗PD的机制进行初步探讨。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 选择性偏侧大鼠PD模型制备
1.1.1 手术前准备 成熟健康SD大鼠，雌性，体重180～250g。动物在室温下笼中常规喂养，术前不禁食。6-羟基多巴胺(6-OHDA.HBr，Sigma chemical Co.产品)溶于0.02%的抗坏血酸液中配制成0.2%的溶液，低温(-20℃)冰箱密封避光保存备用。阿朴吗啡(Apomorphine.HCl，APO，Sigma chemical Co.产品)用双蒸水配成0.01%溶液备用，以上溶液要求严格无菌。
1.1.2 选择性右侧偏侧大鼠PD模型制备 [3，4] 动物用0.3%戊巴比妥钠10ml/kg腹腔注射麻醉后，固定在立体定位仪上(江湾Ⅰ型C)。在无菌条件下，正中切开大鼠颅顶部皮肤，剥离骨膜，暴露前囟(十字缝)、人字缝。用鼠颅骨钻于手术要求部位钻一直径为5mm的颅骨孔。参照Pellegriˉno等 [5] 大鼠脑立体定位图谱，参看Whishaw等体重在180～250g范围内的大
, 百拇医药
鼠使用此图谱的数学折算方法。确定右侧黑质部位坐标位置。用10μl微量进样器(上海计量仪器厂生产)分两次将6-OHDA按下列坐标位置注入右侧黑质部建立右侧选择性大鼠PD模型。B坐标系统:外耳道连线(耳杆尖中心连线)低于上门齿板上缘5mm，即水平0平面。第一次注射4μl，针尖斜面朝嘴侧，坐标为前囟后3.0mm，正中线右侧2.5mm，硬脑膜腹侧8.6mm。第二次注射3μl，针尖斜面朝尾侧，坐标为前囟后2.4mm，正中线右侧2.7mm，硬脑膜腹侧8.6mm。注射速度为1μl/min，每次注射完毕留针10min，然后以1.0mm/min速度缓慢拔针(约10min)。手术完毕，用医用明胶海绵填塞颅骨孔，缝合切口，放回笼中喂养。
1.1.3 APO诱发动物旋转行为观察 造模术后2周，大鼠腹腔注射0.01%，APO10ml/kg诱发大鼠旋转行为(逆时针方向)，验证6-OHDA对中脑黑质DA神经元的损伤效应。注射APO10min开始记录，共记录30min。旋转速度达到6转/min视为选择性偏侧大鼠PD模型制备成功。
, 百拇医药
1.2 动物分组及处理 造模成功后将实验动物分为模型自然恢复组、针刺治疗组、针刺结合美多巴治疗及美多巴治疗4个组。每组10只。模型组自然恢复组不给予任何治疗，针刺治疗组取筋会穴“阳陵泉”及“舞蹈震颤区”为治疗穴。方法是针刺双侧“阳陵泉”及“舞蹈震颤区”，采用提插和捻转手法刺激，针刺时间为10min。每天1次。美多巴治疗组:按照400mg/kg的剂量给大鼠灌胃美多巴治疗。每天1次。针刺结合美多巴治疗组，除了针刺治疗外，按照美多巴组的剂量给予大鼠灌胃治疗。每组的治疗时间均为2周。
1.3 统计学处理 采用两样本均数比较的t检验。
2 结果
2.1 大鼠旋转行为改变 经过针刺“阳陵泉”及“舞蹈震颤区”和美多巴等治疗后的大鼠旋转次数比模型自然恢复组明显减少(见表1)，其中针刺结合美多巴治疗组减少最明显，这和其他研究的结果是一致的。
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表1 针刺对PD大鼠旋转次数的影响 略
2.2 TUNEL法测定的PD模型大鼠黑质神经细胞凋亡 检测结果显示自然恢复PD模型大鼠脑黑质部位有大量阳性细胞，散在分布，细胞核固缩，呈棕黑色，圆形或不规则形，部分细胞核裂解为多个深棕色凋亡小体。而治疗后三个组的细胞凋亡阳性数明显减少，其中针刺结合美多巴治疗组降低最明显(见表2)。
表2 针刺治疗对PD模型大鼠黑质神经细胞凋亡的影响 略
3 讨论帕金森病最主要的病理特征是黑质致密部多巴胺能神 经元的选择性的死亡、缺失，从而导致基底节神经调节功能的紊乱，在临床上表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势不稳定等。目前PD发病机制仍不明确，但随着生物医学科学的发展，越来越多的证据表明细胞凋亡与PD的发病有密切关系 [6，7] 。本研究采用6-OHDA脑内注射成功制备了PD大鼠模型。而6-OHDA能诱导实验动物中脑黑质神经细胞的凋亡已被证实 [8] ，我们的研究结果也支持这一观点。中医认为PD为“内风”所致，肝主风，主筋，本病的主症震颤、强直、运动减少等均为筋脉失养的表现，所以本研究选取筋会穴“阳陵泉”和“舞蹈震颤区”为治疗穴。研究结果显示，模型自然恢复组中脑黑质神经细胞凋亡阳性数最高，针刺治疗、针刺结合美多巴及美多巴治疗后神经细胞凋亡阳性数明显减少(P<0.001)。其中针刺结合美多巴治疗组减少最明显。但是3个治疗组之间神经细胞凋亡阳性数无明显差异(P>0.05)。本研究结果提示针刺治疗PD可能是通过抑制中脑黑质神经细胞凋亡起作用的，其效应和针刺结合美多巴及单独使用美多巴治疗接近。至于其抑制中脑黑质神经细胞凋亡的具体作用途径尚有待进一步深入研究。
, 百拇医药
参考文献
1 陶怀玉.电针加穴位注射治疗震颤麻痹42例临床观察.中国针灸，1989，5:17.
2 罗明富.电针治疗震颤麻痹的实验研究.中国针灸，1994，5:39.
3 Perese DA，Ulman J，Viola J，et al.A6-hydroxydopamine-induced selective parkinsonian rat model.Brain Res，1989，494-285.
4 Thomas J，Wang J，Takubo H，et al.A6-hydroxydopamine-induced selective parkinsonian rat model:further biochemical and behavioral characterization.Exp Neurol，1994，126:159.
, 百拇医药
5 Pellegrino LJ，Pellegrino AS，Cushman AJ.A stereotaxic atlas of the rat brain.2 nd edition.Plenum press，1979，43.
6 Ziv I，Melamed E，Nardi N，et al.Dopamine induces apoptosis-like cell death in cultured chick sympathetic neurons:a possible novel pathoˉgenetic in Parkinson’s disease.Neurosci Letter，1994，170:136.
7 Tompkins MM，Basgall EJ，Zamrini E，et al.Apoptotic-like changes in Lewy-body-associated disorders and normal aging in substantial niˉgral neurons.Am J Pathol，1997，150(1):119.
, 百拇医药
8 张旺明，徐如祥，蔡颖谦，等.6-羟基多巴胺诱导帕金森病模型鼠黑质神经细胞凋亡.
中华老年医学杂志，2000，19(2):119-121.
基金项目:广东省中医药管理局资助课题(编号:101112);深圳市科委资助课题(编号:F2000A20)
作者单位:1 518033广东省深圳市福田区中医院针灸科
2 510405广州中医药大学第一附属医院针灸科
3 510405广州中医药大学针灸推拿学院
(收稿日期:2003-06-01)
(编 辑 晓勇), 百拇医药(骆仲达 陈兴华 唐纯志 尹利华 林锦泉)
关键词 帕金森病 针刺治疗细胞凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)10-0871-02
The effect of acupuncture on neuron apoptosis in
mesencephalic substantia nigra of Parkinson’s disease in rat
, 百拇医药 Luo Zhongda，Chen Xinghua，Tang Chunzhi，et al.
Department of Acupuncture，Futian Hospital of Chinese Medicine，Shenzhen518033
【Abstract】 Objective To investigate the effect of acupuncture on neuron apoptosis in mesencephalic substanˉtia nigra of Parkinson’s disease in rat.Methods TUNEL was adopted to detect neuron apoptosis in mesencephalic substantia nigra.Results Acupuncture could significantly suppress neuron apoptosis in mesenceph
, http://www.100md.com
alic substantia niˉgra of Parkinson’s disease in rat.Its effect was quite similar to that of medopa.Conclusion Suppressing neuron apoptosis in mesencephalic substantia nigra of Parkinson’s disease in rat might be one action mechanism of acupuncˉture therapy.
Key words Parkinson’s disease acupuncture therapy apoptosis
帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是一种以中脑黑质多巴胺能神经元严重缺失为主要病变，广泛累及中枢神经系统的较为常见且症候复杂多样的慢性神经元变性性疾病。目前其发病机制尚未明确，但内、外源性神经毒素可能起到重要作用。治疗方面，针灸治疗PD的有效性已为临床及实验研究所证实 [1，2] 。但对其获效机制的研究较少。本研究通过对实验性PD大鼠的针刺治疗，观察了针刺对PD模型大鼠黑质神经细胞凋亡的影响，对针刺治疗PD的机制进行初步探讨。
, http://www.100md.com
1 材料和方法
1.1 选择性偏侧大鼠PD模型制备
1.1.1 手术前准备 成熟健康SD大鼠，雌性，体重180～250g。动物在室温下笼中常规喂养，术前不禁食。6-羟基多巴胺(6-OHDA.HBr，Sigma chemical Co.产品)溶于0.02%的抗坏血酸液中配制成0.2%的溶液，低温(-20℃)冰箱密封避光保存备用。阿朴吗啡(Apomorphine.HCl，APO，Sigma chemical Co.产品)用双蒸水配成0.01%溶液备用，以上溶液要求严格无菌。
1.1.2 选择性右侧偏侧大鼠PD模型制备 [3，4] 动物用0.3%戊巴比妥钠10ml/kg腹腔注射麻醉后，固定在立体定位仪上(江湾Ⅰ型C)。在无菌条件下，正中切开大鼠颅顶部皮肤，剥离骨膜，暴露前囟(十字缝)、人字缝。用鼠颅骨钻于手术要求部位钻一直径为5mm的颅骨孔。参照Pellegriˉno等 [5] 大鼠脑立体定位图谱，参看Whishaw等体重在180～250g范围内的大
, 百拇医药
鼠使用此图谱的数学折算方法。确定右侧黑质部位坐标位置。用10μl微量进样器(上海计量仪器厂生产)分两次将6-OHDA按下列坐标位置注入右侧黑质部建立右侧选择性大鼠PD模型。B坐标系统:外耳道连线(耳杆尖中心连线)低于上门齿板上缘5mm，即水平0平面。第一次注射4μl，针尖斜面朝嘴侧，坐标为前囟后3.0mm，正中线右侧2.5mm，硬脑膜腹侧8.6mm。第二次注射3μl，针尖斜面朝尾侧，坐标为前囟后2.4mm，正中线右侧2.7mm，硬脑膜腹侧8.6mm。注射速度为1μl/min，每次注射完毕留针10min，然后以1.0mm/min速度缓慢拔针(约10min)。手术完毕，用医用明胶海绵填塞颅骨孔，缝合切口，放回笼中喂养。
1.1.3 APO诱发动物旋转行为观察 造模术后2周，大鼠腹腔注射0.01%，APO10ml/kg诱发大鼠旋转行为(逆时针方向)，验证6-OHDA对中脑黑质DA神经元的损伤效应。注射APO10min开始记录，共记录30min。旋转速度达到6转/min视为选择性偏侧大鼠PD模型制备成功。
, 百拇医药
1.2 动物分组及处理 造模成功后将实验动物分为模型自然恢复组、针刺治疗组、针刺结合美多巴治疗及美多巴治疗4个组。每组10只。模型组自然恢复组不给予任何治疗，针刺治疗组取筋会穴“阳陵泉”及“舞蹈震颤区”为治疗穴。方法是针刺双侧“阳陵泉”及“舞蹈震颤区”，采用提插和捻转手法刺激，针刺时间为10min。每天1次。美多巴治疗组:按照400mg/kg的剂量给大鼠灌胃美多巴治疗。每天1次。针刺结合美多巴治疗组，除了针刺治疗外，按照美多巴组的剂量给予大鼠灌胃治疗。每组的治疗时间均为2周。
1.3 统计学处理 采用两样本均数比较的t检验。
2 结果
2.1 大鼠旋转行为改变 经过针刺“阳陵泉”及“舞蹈震颤区”和美多巴等治疗后的大鼠旋转次数比模型自然恢复组明显减少(见表1)，其中针刺结合美多巴治疗组减少最明显，这和其他研究的结果是一致的。
, http://www.100md.com
表1 针刺对PD大鼠旋转次数的影响 略
2.2 TUNEL法测定的PD模型大鼠黑质神经细胞凋亡 检测结果显示自然恢复PD模型大鼠脑黑质部位有大量阳性细胞，散在分布，细胞核固缩，呈棕黑色，圆形或不规则形，部分细胞核裂解为多个深棕色凋亡小体。而治疗后三个组的细胞凋亡阳性数明显减少，其中针刺结合美多巴治疗组降低最明显(见表2)。
表2 针刺治疗对PD模型大鼠黑质神经细胞凋亡的影响 略
3 讨论帕金森病最主要的病理特征是黑质致密部多巴胺能神 经元的选择性的死亡、缺失，从而导致基底节神经调节功能的紊乱，在临床上表现为静止性震颤、肌强直、运动迟缓和姿势不稳定等。目前PD发病机制仍不明确，但随着生物医学科学的发展，越来越多的证据表明细胞凋亡与PD的发病有密切关系 [6，7] 。本研究采用6-OHDA脑内注射成功制备了PD大鼠模型。而6-OHDA能诱导实验动物中脑黑质神经细胞的凋亡已被证实 [8] ，我们的研究结果也支持这一观点。中医认为PD为“内风”所致，肝主风，主筋，本病的主症震颤、强直、运动减少等均为筋脉失养的表现，所以本研究选取筋会穴“阳陵泉”和“舞蹈震颤区”为治疗穴。研究结果显示，模型自然恢复组中脑黑质神经细胞凋亡阳性数最高，针刺治疗、针刺结合美多巴及美多巴治疗后神经细胞凋亡阳性数明显减少(P<0.001)。其中针刺结合美多巴治疗组减少最明显。但是3个治疗组之间神经细胞凋亡阳性数无明显差异(P>0.05)。本研究结果提示针刺治疗PD可能是通过抑制中脑黑质神经细胞凋亡起作用的，其效应和针刺结合美多巴及单独使用美多巴治疗接近。至于其抑制中脑黑质神经细胞凋亡的具体作用途径尚有待进一步深入研究。
, 百拇医药
参考文献
1 陶怀玉.电针加穴位注射治疗震颤麻痹42例临床观察.中国针灸，1989，5:17.
2 罗明富.电针治疗震颤麻痹的实验研究.中国针灸，1994，5:39.
3 Perese DA，Ulman J，Viola J，et al.A6-hydroxydopamine-induced selective parkinsonian rat model.Brain Res，1989，494-285.
4 Thomas J，Wang J，Takubo H，et al.A6-hydroxydopamine-induced selective parkinsonian rat model:further biochemical and behavioral characterization.Exp Neurol，1994，126:159.
, 百拇医药
5 Pellegrino LJ，Pellegrino AS，Cushman AJ.A stereotaxic atlas of the rat brain.2 nd edition.Plenum press，1979，43.
6 Ziv I，Melamed E，Nardi N，et al.Dopamine induces apoptosis-like cell death in cultured chick sympathetic neurons:a possible novel pathoˉgenetic in Parkinson’s disease.Neurosci Letter，1994，170:136.
7 Tompkins MM，Basgall EJ，Zamrini E，et al.Apoptotic-like changes in Lewy-body-associated disorders and normal aging in substantial niˉgral neurons.Am J Pathol，1997，150(1):119.
, 百拇医药
8 张旺明，徐如祥，蔡颖谦，等.6-羟基多巴胺诱导帕金森病模型鼠黑质神经细胞凋亡.
中华老年医学杂志，2000，19(2):119-121.
基金项目:广东省中医药管理局资助课题(编号:101112);深圳市科委资助课题(编号:F2000A20)
作者单位:1 518033广东省深圳市福田区中医院针灸科
2 510405广州中医药大学第一附属医院针灸科
3 510405广州中医药大学针灸推拿学院
(收稿日期:2003-06-01)
(编 辑 晓勇), 百拇医药(骆仲达 陈兴华 唐纯志 尹利华 林锦泉)