天芎注射液细菌内毒素的鲎试验研究
【摘要】 目的 探讨天芎注射液进行细菌内毒素检查的可行性。方法 通过稀释法和超滤法等排除干扰的方法对样品中的细菌内毒素进行鲎试验研究。结果 3批天芎注射液经最大有效稀释后对普通鲎试剂及特异性鲎试剂的细菌内毒素检查均有明显的干扰作用，而经超滤后对鲎试验检查无干扰作用。结论 日常细菌内毒素检查时可将天芎注射液进行超滤以排除其干扰作用。
关键词 天芎注射液 鲎试验 细菌内毒素 超滤 干扰试验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2003)07-0588-03
The study which tachypleus amebocyte lysate test
of bacterial endotoxins in tianxiong injection
, http://www.100md.com
Xiao Guinan，Ou Xuan，Li Chunzhu，et al.
Guangdong Institute of Drug Control，Guangzhou510180.
【Abstract】 Objective To explore the feasibility of bacterial endotoxins test for tianxiong injection(TXI).Methods Methods of dilution and superfiltration of tachypleus amebocyte lysate(TAL)test were applied to detect the bacterial endotoxins in TXI and avoid interference effect.Results After the maximum valid dilution，three batches of TXI obviously interfered with the test for bacterial endotoxins no matter with common TAL or endotoxin-specific TAL，while not after superfiltration of samples.Conclusion TXI can be superfiltrated to avoid their
, 百拇医药
interference efˉfects on routine test for bacterial endotoxins.
Key words tianxiong injection(TXI) tachypleus amebocyte lysate(TAL)test bacterial endotoxins superˉfiltration interfering test
自从20世纪60年代阐明鲎血凝集的机制并由此建立鲎试验方法学以来，世界各国越来越多地以细菌内毒素检查药品生物制品中的致热物质来替代兔法热原检查以控制药品质量。近年来国内也逐步开展了鲎试验在中药注射液细菌内毒素检查中的应用，天芎注射液是一种由天麻和川芎组成的中药注射液，临床上主要用于治疗头痛、风湿痹证等，《中国药典》2000年版尚未收载该品种。我们通过稀释法和超滤法以普通鲎试剂和特异性鲎试剂对天芎注射液进行了细菌内毒素的鲎试验研究，考察了该药进行内毒素检查的可行性。
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1 材料与仪器
1.1 药品与试剂 天芎注射液(批号分别为020506、020508、020510;每瓶100ml)由广东彼迪药业公司提供。批号为2002621的普通鲎试剂(灵敏度λ为0.03EU·ml -1 及批号为20020904的特异性鲎试剂(λ为0.125EU·ml -1 )由广东湛江海洋生物制品厂生产，批号为0301151的普通鲎试剂(λ为0.03EU·ml -1 )及批号为0207172的特异性鲎试剂(λ为0.125EU·ml -1 )由广东湛江安度斯生物公司生产;细菌内毒素国家标准品(批号为981，9000EU·Amp -1 )由中国药品生物制品检定所提供;细菌内毒素检查用水(批号为 020309，5.0ml·Apm -1 )由湛江海洋生物制品厂生产。
1.2 仪器 旋涡振荡器及恒温水浴系统(型号为19A，精密度为0.01℃)均由德国Julabo公司生产;超滤系统(包括三醋酸纤维素滤膜)由美国Millipore公司提供;实验所用的玻璃器皿经重铬酸钾浓硫酸洗液处理后以250℃干烤2h去除外源性细菌内毒素。
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2 方法与结果
2.1 鲎试剂标示灵敏度(λ)的复核 [1] 按《中国药典》规定的方法对实验所用鲎试剂(TAL)进行灵敏度复核，结果鲎试剂的实测灵敏度均在(0.5～2.0)λ之间，符合规定。
2.2 样品细菌内毒素限值(L)的确定 [2] 药品中细菌内毒素的限值L=K·M -1 ，本例K值为5EU·kg -1 ·h -1 ;M为人用每公斤体重每小时最大可接受的药品剂量，天芎注射液的成人每次最大临床用量为100ml，故M=1.67ml·kg -1 ·h -1 ，求得L=3.0EU·ml -1 。
2.3 样品中细菌内毒素的常规检查 取3批样品稀释100倍并以灵敏度为0.03EU·ml -1 的普通鲎试剂进行常规五管凝胶法细菌内毒素检查，结果见表1，表明样品原液中的细菌内毒素含量均“高于”3.0EU·ml -1 。
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表1 鲎试剂的细菌内毒素的常规检查结果略
2.4 样品的稀释法干扰试验 市售用于药品检验的鲎试剂其灵敏度一般在(0.03～0.50)EU·ml -1 之间，故在确定了天芎注射液的细菌内毒素限值为3.0EU·ml -1 后，可算出其有效稀释倍数为6～100倍。分别取普通鲎试剂及特异性鲎试剂对本品的100倍及24倍稀释液进行干扰试验，并计 算以样品稀释液配制的细菌内毒素溶液反应终点浓度的几何均值(Et)及用内毒素检查用水配制的内毒素溶液反应终点浓度的几何均值(Es)，结果见表2、表3。可看出样品对普通鲎试剂及特异性鲎试剂的内毒素检查有明显的干扰作用。
表2 普通鲎试剂的干扰试验检查结果略
表3 特异性鲎试剂的干扰试验检查结果略
2.5 样品超滤后的干扰试验及细菌内毒素的检测 取3批样品以三醋酸纤维素滤膜进行超滤，取留在滤膜上的液体补足细菌内毒素检查用水至100ml，进行内毒素的常规检查 及干扰试验，结果见表4、表5。可见样品中的细菌内毒素含量均低于3.0EU·ml -1 ，而且膜上层检查液对鲎试验检查无干扰作用。
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表4 天芎注射液超滤后的细菌内毒素常规检查结果略
表5 天芎注射液超滤后的干扰试验检查结果略
3 讨论
鲎试剂为东方鲎或美洲鲎的血液变形细胞溶解物的冻干品，在一定条件下(适宜的温度、pH值及无干扰作用时)该剂能与微量的细菌内毒素反应形成凝胶，细菌内毒素的检查正是基于上述机制。一个新品种是否适于应用细菌内毒素检查法，很重要的一点就是要研究该样品本身是否存在干扰因素，干扰试验的目的就是要确定出该品种在什么有效浓度范围内可以克服干扰因素[3] 。本研究发现天芎注射液经稀释后无论用普通鲎试剂还是特异性鲎试剂检查均表现出明显的干扰作用，容易误判为内毒素超标，而样品经过超滤后其上层检查液中实际内毒素的含量小于3.0EU·ml -1 ，且对鲎试验检查无干扰作用。常见的干扰因素大多可以通过稀释消除，但一些成分复杂的中药注射液应用稀释法难于消除的可考虑用超滤法去除干扰因素。由于细菌内毒素的分子量大于10000道尔顿且多以微团形式存在， 微团的分子量接近100000道尔顿，而化学药物的分子量一般为数百个道尔顿，不超过2000道尔顿，我们选用截留分子量10000道尔顿的三醋酸纤维素滤膜可有效滤除药物，截留内毒素，这样就可以在内毒素含量几乎不变的情况下使药物浓度大大降低，从而消除药物的干扰作用，而滤膜上含有内毒素的物质
, 百拇医药
可以用内毒素检查用水冲洗下来进行细菌内毒素检测和干扰试验。
参考文献
1 国家药典委员会.中华人民共和国药典，北京:化学工业出版社，2000，682.
2 国家药典委员会.中华人民共和国药典，北京:化学工业出版社，2000，附录204-205.
3 肖贵南，吴招娣，关永源.顺铂注射液细菌内毒素的动态浊度法定量研究.中国药理学通报，2003，19(4):435-437.
作者单位:1 510180广东省药品检验所
2 510182广州医学院
(收稿日期:2003-09-08)
(编辑 夏天), 百拇医药
关键词 天芎注射液 鲎试验 细菌内毒素 超滤 干扰试验
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-6424(2003)07-0588-03
The study which tachypleus amebocyte lysate test
of bacterial endotoxins in tianxiong injection
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Xiao Guinan，Ou Xuan，Li Chunzhu，et al.
Guangdong Institute of Drug Control，Guangzhou510180.
【Abstract】 Objective To explore the feasibility of bacterial endotoxins test for tianxiong injection(TXI).Methods Methods of dilution and superfiltration of tachypleus amebocyte lysate(TAL)test were applied to detect the bacterial endotoxins in TXI and avoid interference effect.Results After the maximum valid dilution，three batches of TXI obviously interfered with the test for bacterial endotoxins no matter with common TAL or endotoxin-specific TAL，while not after superfiltration of samples.Conclusion TXI can be superfiltrated to avoid their
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interference efˉfects on routine test for bacterial endotoxins.
Key words tianxiong injection(TXI) tachypleus amebocyte lysate(TAL)test bacterial endotoxins superˉfiltration interfering test
自从20世纪60年代阐明鲎血凝集的机制并由此建立鲎试验方法学以来，世界各国越来越多地以细菌内毒素检查药品生物制品中的致热物质来替代兔法热原检查以控制药品质量。近年来国内也逐步开展了鲎试验在中药注射液细菌内毒素检查中的应用，天芎注射液是一种由天麻和川芎组成的中药注射液，临床上主要用于治疗头痛、风湿痹证等，《中国药典》2000年版尚未收载该品种。我们通过稀释法和超滤法以普通鲎试剂和特异性鲎试剂对天芎注射液进行了细菌内毒素的鲎试验研究，考察了该药进行内毒素检查的可行性。
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1 材料与仪器
1.1 药品与试剂 天芎注射液(批号分别为020506、020508、020510;每瓶100ml)由广东彼迪药业公司提供。批号为2002621的普通鲎试剂(灵敏度λ为0.03EU·ml -1 及批号为20020904的特异性鲎试剂(λ为0.125EU·ml -1 )由广东湛江海洋生物制品厂生产，批号为0301151的普通鲎试剂(λ为0.03EU·ml -1 )及批号为0207172的特异性鲎试剂(λ为0.125EU·ml -1 )由广东湛江安度斯生物公司生产;细菌内毒素国家标准品(批号为981，9000EU·Amp -1 )由中国药品生物制品检定所提供;细菌内毒素检查用水(批号为 020309，5.0ml·Apm -1 )由湛江海洋生物制品厂生产。
1.2 仪器 旋涡振荡器及恒温水浴系统(型号为19A，精密度为0.01℃)均由德国Julabo公司生产;超滤系统(包括三醋酸纤维素滤膜)由美国Millipore公司提供;实验所用的玻璃器皿经重铬酸钾浓硫酸洗液处理后以250℃干烤2h去除外源性细菌内毒素。
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2 方法与结果
2.1 鲎试剂标示灵敏度(λ)的复核 [1] 按《中国药典》规定的方法对实验所用鲎试剂(TAL)进行灵敏度复核，结果鲎试剂的实测灵敏度均在(0.5～2.0)λ之间，符合规定。
2.2 样品细菌内毒素限值(L)的确定 [2] 药品中细菌内毒素的限值L=K·M -1 ，本例K值为5EU·kg -1 ·h -1 ;M为人用每公斤体重每小时最大可接受的药品剂量，天芎注射液的成人每次最大临床用量为100ml，故M=1.67ml·kg -1 ·h -1 ，求得L=3.0EU·ml -1 。
2.3 样品中细菌内毒素的常规检查 取3批样品稀释100倍并以灵敏度为0.03EU·ml -1 的普通鲎试剂进行常规五管凝胶法细菌内毒素检查，结果见表1，表明样品原液中的细菌内毒素含量均“高于”3.0EU·ml -1 。
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表1 鲎试剂的细菌内毒素的常规检查结果略
2.4 样品的稀释法干扰试验 市售用于药品检验的鲎试剂其灵敏度一般在(0.03～0.50)EU·ml -1 之间，故在确定了天芎注射液的细菌内毒素限值为3.0EU·ml -1 后，可算出其有效稀释倍数为6～100倍。分别取普通鲎试剂及特异性鲎试剂对本品的100倍及24倍稀释液进行干扰试验，并计 算以样品稀释液配制的细菌内毒素溶液反应终点浓度的几何均值(Et)及用内毒素检查用水配制的内毒素溶液反应终点浓度的几何均值(Es)，结果见表2、表3。可看出样品对普通鲎试剂及特异性鲎试剂的内毒素检查有明显的干扰作用。
表2 普通鲎试剂的干扰试验检查结果略
表3 特异性鲎试剂的干扰试验检查结果略
2.5 样品超滤后的干扰试验及细菌内毒素的检测 取3批样品以三醋酸纤维素滤膜进行超滤，取留在滤膜上的液体补足细菌内毒素检查用水至100ml，进行内毒素的常规检查 及干扰试验，结果见表4、表5。可见样品中的细菌内毒素含量均低于3.0EU·ml -1 ，而且膜上层检查液对鲎试验检查无干扰作用。
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表4 天芎注射液超滤后的细菌内毒素常规检查结果略
表5 天芎注射液超滤后的干扰试验检查结果略
3 讨论
鲎试剂为东方鲎或美洲鲎的血液变形细胞溶解物的冻干品，在一定条件下(适宜的温度、pH值及无干扰作用时)该剂能与微量的细菌内毒素反应形成凝胶，细菌内毒素的检查正是基于上述机制。一个新品种是否适于应用细菌内毒素检查法，很重要的一点就是要研究该样品本身是否存在干扰因素，干扰试验的目的就是要确定出该品种在什么有效浓度范围内可以克服干扰因素[3] 。本研究发现天芎注射液经稀释后无论用普通鲎试剂还是特异性鲎试剂检查均表现出明显的干扰作用，容易误判为内毒素超标，而样品经过超滤后其上层检查液中实际内毒素的含量小于3.0EU·ml -1 ，且对鲎试验检查无干扰作用。常见的干扰因素大多可以通过稀释消除，但一些成分复杂的中药注射液应用稀释法难于消除的可考虑用超滤法去除干扰因素。由于细菌内毒素的分子量大于10000道尔顿且多以微团形式存在， 微团的分子量接近100000道尔顿，而化学药物的分子量一般为数百个道尔顿，不超过2000道尔顿，我们选用截留分子量10000道尔顿的三醋酸纤维素滤膜可有效滤除药物，截留内毒素，这样就可以在内毒素含量几乎不变的情况下使药物浓度大大降低，从而消除药物的干扰作用，而滤膜上含有内毒素的物质
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可以用内毒素检查用水冲洗下来进行细菌内毒素检测和干扰试验。
参考文献
1 国家药典委员会.中华人民共和国药典，北京:化学工业出版社，2000，682.
2 国家药典委员会.中华人民共和国药典，北京:化学工业出版社，2000，附录204-205.
3 肖贵南，吴招娣，关永源.顺铂注射液细菌内毒素的动态浊度法定量研究.中国药理学通报，2003，19(4):435-437.
作者单位:1 510180广东省药品检验所
2 510182广州医学院
(收稿日期:2003-09-08)
(编辑 夏天), 百拇医药