肌腱细胞的生物学特性
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)11-0993-03
肌腱细胞是肌腱的基本功能单位，它合成和分泌胶原等细胞外基质，维持肌腱组织的新陈代谢。目前，肌腱组织工程研究的焦点集中在种子细胞来源问题上。肌腱细胞是一种分化程度很高的细胞，在体外培养条件下，增殖相对缓慢，尤其是经过多次传代后，肌腱细胞甚至丧失进入增殖期的能力。这是组织工程化肌腱研究的瓶颈问题。因此，寻求种子细胞是组织工程化肌腱构建的关键所在。根据文献，有学者采用皮肤成纤维细胞 [1] 和骨髓基质细胞 [2] 作为种子细胞。然而，在采用其它细胞替代肌腱细胞构建组织工程化肌腱前，有必要对肌腱细胞与这些细胞的差异与共同点进行了解。基于此，本文拟从起源、形态学特点、细胞外基质、生长因子和生物力学等方面对肌腱细胞作一综述，以提供肌腱细胞与其它细胞比较研究的理论依据。
1 肌腱细胞的发生来源
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肌腱细胞起源于胚胎时期的间充质细胞。间充质是胚胎期填充在外胚层和内胚层之间的散在的中胚层组织。间充质细胞呈星形，有许多胞质突起。电镜下核较大，卵圆形，核仁明显，相邻的细胞突起彼此连接成网。间充质细胞分化程度低，有很强的分裂分化能力。
2 肌腱细胞的形态学特点
肌腱细胞是形态发生改变的成纤维细胞，呈棱形，细胞核长而着色深，顺胶原纤维的长轴成行排列，细胞质甚薄成翼状包着纤维束，翼突也伸入纤维束内分隔包裹着胶原纤维。电镜下胞质内粗面内质网较丰富，较少线粒体，高尔基体少见 [3] 。与此相反，皮肤成纤维细胞胞体较大，扁平，细胞核卵圆形，胞质着色浅，不明显。电镜下胞质内细胞器较肌腱细胞密集。
3 肌腱细胞分泌的细胞外基质
肌腱细胞的功能是形成肌腱胶原纤维和基质。在肌腱组织中，肌腱细胞与胞外基质之间存在着非常密切的相互关系。肌腱细胞可持续地合成、分泌某些物质，如胶原、可溶性蛋白多糖等，并可降解、吸收基质中的代谢产物，调节着周围的微环境。同时，基质也能有效地影响细胞的代谢、生长、增殖和运动等细胞行为。与成纤维细胞分泌的细胞外基质相比，胶原纤维在肌腱的胞外基质中比例较大，占其中有形成分的70%以上，且特化为抗拉结构。仅有少量纤细的弹力纤维夹杂在胶原纤维之间。而真皮除有胶原纤维束交织成网外，还有许多弹力纤维赋予皮肤较大的韧性和弹性。
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胶原纤维是构成肌腱组织的主要成分，呈束状排列，新鲜状态下，大体观呈银白色。光镜观察，在组织中呈平行波浪状，横断面近似椭圆形。肌腱胶原纤维的抗拉性能极强，可承受6kg/mm 2 的拉力。一般认为肌腱胶原纤维的排列与受力方向平行，但还有部分纤维束呈扭转或交错排列，防止纤维分离，同时也有利于对来自不同方向的力的缓冲。而真皮组织的胶原纤维排列杂乱无章，向不同方向伸展。肌腱细胞的胞外基
质主要由不溶性胶原蛋白、弹性蛋白、原纤维和可溶性蛋白聚糖构成，可有效地分散肌腱组织的张力和重力，维持肌腱结构的正常形态，为包埋在基质中的肌腱细胞提供适宜的物理和化学环境。肌腱细胞合成的蛋白聚糖有透明质酸、装饰蛋白(decorin)、粘胶蛋白(tenascin)和纤维调节素(fibromodulin)等，并可形成多孔的分子筛，营养物质和代谢产物可自由通过。Decorin可以阻止胶原原纤维形成，通过下调decorin的表达，可在兔韧带瘢痕中重建粗大纤维 [4] 。Tenascin-c能使肌腱细胞适应压力
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。Fibromodulin起稳定纤维中成熟的原纤维的作用。Maria等 [7] 研究与胶原原纤维生长有关的26个的cDNA片段，发现上游结构蛋白α 1 (Ⅰ)collagen、α 2 (Ⅰ)collagen、α 1 (Ⅺ)collagen、α 1 (Ⅵ)collagen和fibromodulin表达增加。
4 肌腱组织中的胶原类型
根据编码基因和肽链组合的不同，目前至少有20型胶原完成了物理或化学定性。每一种又根据其一级结构分为许多亚型，它们的分子结构、组织分布和物理性能均有差异。不同类型的胶原的α链由各自独立的基因编码。已经明确肌腱组织中含有的胶原有Ⅰ型、Ⅴ型 [8] 、Ⅵ型 [9] 、Ⅷ型、Ⅺ型 [10] 、Ⅻ型 [11] 、ⅩⅣ型 [12] 和ⅩⅩ [13] 型。其中，Ⅰ型胶原是肌腱组织的主要纤维性胶原，较粗大，起稳定组织的作用。它在肌腱中形成绳索样结构，在皮肤中则形成片状结构。Ⅻ型、ⅩⅣ型和ⅩⅩ型胶原是装配在原纤维表面上的胶原，是原纤维结合胶原 [13] ，其作用是将原纤维结合起来，参与调节和控制原纤维的形状，使之适应肌腱组织的功能需要。当肌腱受到损伤进行修复时，会出现Ⅲ型胶原的暂时表达 [14] 。
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5 胶原纤维的合成和重塑
胶原纤维是经多步骤过程装配而成，包括胶原分子的合成、分泌和修饰等步骤。胶原分子的多肽链是在内质网膜结合的核糖体上合成的，最初合成的多肽链为前α链。在内质网腔中，前α链与其他两条前α链通过氢键相互结合，构成了三股螺旋的前胶原分子。此分子的装配起始于内质网，后经高尔基体装配完成，被包装到分泌泡中，分泌到细胞外。前胶原分子分泌到细胞外之后，前肽序列被专一的蛋白水解酶切除，于是前胶原转变成了胶原分子。相邻的胶原分子在细胞外经赖氨酸残基横联成共价键，相互以四分之一错位排列的方式 [15] 装配成了胶原原纤维。如果横键的建立受阻，则原纤维的张力强度大大下降。跟腱中横键特别丰富，具有很强的抗张能力，适应于支撑体重和进行剧烈运动。
6 胶原原纤维的组成
胶原纤维的直径以其中所含胶原原纤维的多少、粗细而定。原纤维的直径随其所在组织的不同而异。肌腱的原纤维可比角膜中的原纤维粗约20倍。高负荷力的组织中原纤维比较粗，其负荷力的大小与原纤维粗细成正相关。另外，影响原纤维粗细的因素还有糖基化程度(越细的原纤维其糖基化程度越高)、原纤维表面是否存在较小的胶原分子、胶原分子末端是否存在较长的肽链、周围蛋白多糖的类型和浓度。
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肌腱细胞胶原纤维的组成需经过三个过程:胶原原纤维阶段、原纤维束阶段、组织特异性
聚合体阶段 [16] 。在肌腱的形成过程中，细胞外部按不同等级分成了许多胞外分 隔，它代表了胞质成分向胞外空间的延伸。原纤维的组装发生在细胞表面的胞外分隔中。初级分隔是一系列较窄的通道，包含单根或成组的原纤维。这些原纤维被胞膜包绕且深入胞浆内部，远端与胞外区域相通。这些较窄的通道相互从侧面融合形成第二级划定分隔。在第二级分隔中，原纤维单体相互以添加融合或相似融合的方式 [15] 形成原纤维束。这种排列方式的形成原因在于:只有如此程度的重叠才能使相邻胶原分子的氨基酸相互作用而形成稳定状态。在电镜下明显可见64～70nm左右的周期性横纹结构。从横切面看是圆形结构，从纵切面看为两端逐渐变细的尾状结构。Scott(1984)提出通过decorin的表面包被可以促使原纤维融合过程发生。第三级分
隔是由并联的两个或三个细胞来确定界限。在其中，原纤维束相互之间以融合或接合方式聚合成聚合体。第三级分隔相互交叉，部分区域相邻，部分区域相通。
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7 生长因子及其受体表达对肌腱细胞的影响
生长因子是由细胞产生的，能调节自身和其它细胞功能小分子可溶性蛋白质或多肽，通过与受体特异性的结合启动其效应作用。它可以调节细胞的增殖、分化过程并改变细胞产物的合成。
Murphy [17] 研究发现肌腱细胞的增殖在一定范围内与IGF-1的浓度呈量效关系，同时发现IGF-1对肌腱细胞的胶原合成有促进作用。Klein [18] 应用TGF-β后发现肌腱细胞的胶原产量明显增加，细胞数量变化不明显。Barbara等 [19] 对bFGF研究后发现，bFGF参与肌腱愈合的早期修复过程，能够促进肌腱细胞增殖，提高Ⅲ型胶原的表达。Molˉloy [20] 研究认为bFGF在体内可促进肌腱细胞增殖及胶原合成。Haydon [21] 把BMP-13、14直接注射到大鼠肌腱损伤部位，可使修复后的肌腱最大张力提高39%，而把BMP-12用于鸡的肌腱损伤部位后，其最大张力也有所提高。Rodeo [22] 认为BMP-2有利于肌腱的愈合。Fu [23] 研究BMP-12可以促进肌腱细胞的增殖和基质生成。
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8 生物力学对肌腱细胞的影响
肌腱是连接骨骼肌肌腹与骨骼之间的单轴致密胶原纤维结缔组织束，是弹性小、寡血管的组织，用于传导肌腹收缩所产生的力，牵引骨骼使之产生运动。肌腱本身不具有收缩能力，但具有很强的耐压抗张力和抗摩擦的能力。因此，力学刺激必然对肌腱细胞的生物学特性产生很大的影响。力学信号可刺激细胞表面的牵张受体和粘附位点，导致一系列瀑布效应，从而改变细胞周围的营养成分、氧气等 [24] 。还可改变细胞内的第二信使NO或Ca 2+ 浓度，直接或间接影响细胞因子mRNA的表达，从而影响基质蛋白的合成。有人 [5，6] 研究tenascin-C mRNA和蛋白质水平在牛的屈肌肌腱远端(受力大)含量比近端(受力小)大。在受力条件下，肌腱细胞之间相互连接紧密，组合更多的胞质actin进入有原肌球蛋白的张力纤维 [25] 。局部给予兔韧带一定的张力可增加胶原原纤维D周期的长度 [26] 。Carina [27] 发现注入CDMP-2，在不受力的条件下可向骨的方向转化，在受静态力的条件下可向软骨方向转化，而在受周期性牵张力的条件下则会向肌腱方向转化。Hannafin等 [28] 则对狗的肌腱进行了研究，发现若不施以应力，则8周后细胞的数目、细胞合成胶原的量明显减少。但若施以周围性张力，仅4周即可发现细胞数目、细胞合成胶原数量有明显的增加。Skutek [29] 发现周期性张力促进肌腱愈合的机制主要是通过提高各类生长因子的含量，如TGF-B、PDGF、bFGF，从而促进细胞增殖、分化及基质形成。他还认为 [30] 当肌腱受外力作用后，IL-6分泌增多，IL-6参与炎症反应，同时也能修复肌腱。组织工程化肌腱使人类在体外预制有生命的肌腱组织以替代病损肌腱成为可能。而构建组织工程化肌腱需要快速扩增的大量种子细胞，肌腱细胞的来源受到了一定条件的制约，这限制了肌腱组织工程学的进展。组织工程化肌腱要想产业化生产，就不能只限于自体肌腱细胞作为种子细胞的唯一来源。因此，研究组织工程化肌腱的种子细胞来源问题极其重要。
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基金项目:国家高科技研究“863”计划资助项目(2002AA205031)
作者单位: 200011 上海第二医科大学附属第九人民医院整形外科、上海第二医科大学组织工程研究中心
(收稿日期:2003-08-14)
(编辑 曲全), 百拇医药(许锋)
肌腱细胞是肌腱的基本功能单位，它合成和分泌胶原等细胞外基质，维持肌腱组织的新陈代谢。目前，肌腱组织工程研究的焦点集中在种子细胞来源问题上。肌腱细胞是一种分化程度很高的细胞，在体外培养条件下，增殖相对缓慢，尤其是经过多次传代后，肌腱细胞甚至丧失进入增殖期的能力。这是组织工程化肌腱研究的瓶颈问题。因此，寻求种子细胞是组织工程化肌腱构建的关键所在。根据文献，有学者采用皮肤成纤维细胞 [1] 和骨髓基质细胞 [2] 作为种子细胞。然而，在采用其它细胞替代肌腱细胞构建组织工程化肌腱前，有必要对肌腱细胞与这些细胞的差异与共同点进行了解。基于此，本文拟从起源、形态学特点、细胞外基质、生长因子和生物力学等方面对肌腱细胞作一综述，以提供肌腱细胞与其它细胞比较研究的理论依据。
1 肌腱细胞的发生来源
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肌腱细胞起源于胚胎时期的间充质细胞。间充质是胚胎期填充在外胚层和内胚层之间的散在的中胚层组织。间充质细胞呈星形，有许多胞质突起。电镜下核较大，卵圆形，核仁明显，相邻的细胞突起彼此连接成网。间充质细胞分化程度低，有很强的分裂分化能力。
2 肌腱细胞的形态学特点
肌腱细胞是形态发生改变的成纤维细胞，呈棱形，细胞核长而着色深，顺胶原纤维的长轴成行排列，细胞质甚薄成翼状包着纤维束，翼突也伸入纤维束内分隔包裹着胶原纤维。电镜下胞质内粗面内质网较丰富，较少线粒体，高尔基体少见 [3] 。与此相反，皮肤成纤维细胞胞体较大，扁平，细胞核卵圆形，胞质着色浅，不明显。电镜下胞质内细胞器较肌腱细胞密集。
3 肌腱细胞分泌的细胞外基质
肌腱细胞的功能是形成肌腱胶原纤维和基质。在肌腱组织中，肌腱细胞与胞外基质之间存在着非常密切的相互关系。肌腱细胞可持续地合成、分泌某些物质，如胶原、可溶性蛋白多糖等，并可降解、吸收基质中的代谢产物，调节着周围的微环境。同时，基质也能有效地影响细胞的代谢、生长、增殖和运动等细胞行为。与成纤维细胞分泌的细胞外基质相比，胶原纤维在肌腱的胞外基质中比例较大，占其中有形成分的70%以上，且特化为抗拉结构。仅有少量纤细的弹力纤维夹杂在胶原纤维之间。而真皮除有胶原纤维束交织成网外，还有许多弹力纤维赋予皮肤较大的韧性和弹性。
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胶原纤维是构成肌腱组织的主要成分，呈束状排列，新鲜状态下，大体观呈银白色。光镜观察，在组织中呈平行波浪状，横断面近似椭圆形。肌腱胶原纤维的抗拉性能极强，可承受6kg/mm 2 的拉力。一般认为肌腱胶原纤维的排列与受力方向平行，但还有部分纤维束呈扭转或交错排列，防止纤维分离，同时也有利于对来自不同方向的力的缓冲。而真皮组织的胶原纤维排列杂乱无章，向不同方向伸展。肌腱细胞的胞外基
质主要由不溶性胶原蛋白、弹性蛋白、原纤维和可溶性蛋白聚糖构成，可有效地分散肌腱组织的张力和重力，维持肌腱结构的正常形态，为包埋在基质中的肌腱细胞提供适宜的物理和化学环境。肌腱细胞合成的蛋白聚糖有透明质酸、装饰蛋白(decorin)、粘胶蛋白(tenascin)和纤维调节素(fibromodulin)等，并可形成多孔的分子筛，营养物质和代谢产物可自由通过。Decorin可以阻止胶原原纤维形成，通过下调decorin的表达，可在兔韧带瘢痕中重建粗大纤维 [4] 。Tenascin-c能使肌腱细胞适应压力
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。Fibromodulin起稳定纤维中成熟的原纤维的作用。Maria等 [7] 研究与胶原原纤维生长有关的26个的cDNA片段，发现上游结构蛋白α 1 (Ⅰ)collagen、α 2 (Ⅰ)collagen、α 1 (Ⅺ)collagen、α 1 (Ⅵ)collagen和fibromodulin表达增加。
4 肌腱组织中的胶原类型
根据编码基因和肽链组合的不同，目前至少有20型胶原完成了物理或化学定性。每一种又根据其一级结构分为许多亚型，它们的分子结构、组织分布和物理性能均有差异。不同类型的胶原的α链由各自独立的基因编码。已经明确肌腱组织中含有的胶原有Ⅰ型、Ⅴ型 [8] 、Ⅵ型 [9] 、Ⅷ型、Ⅺ型 [10] 、Ⅻ型 [11] 、ⅩⅣ型 [12] 和ⅩⅩ [13] 型。其中，Ⅰ型胶原是肌腱组织的主要纤维性胶原，较粗大，起稳定组织的作用。它在肌腱中形成绳索样结构，在皮肤中则形成片状结构。Ⅻ型、ⅩⅣ型和ⅩⅩ型胶原是装配在原纤维表面上的胶原，是原纤维结合胶原 [13] ，其作用是将原纤维结合起来，参与调节和控制原纤维的形状，使之适应肌腱组织的功能需要。当肌腱受到损伤进行修复时，会出现Ⅲ型胶原的暂时表达 [14] 。
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5 胶原纤维的合成和重塑
胶原纤维是经多步骤过程装配而成，包括胶原分子的合成、分泌和修饰等步骤。胶原分子的多肽链是在内质网膜结合的核糖体上合成的，最初合成的多肽链为前α链。在内质网腔中，前α链与其他两条前α链通过氢键相互结合，构成了三股螺旋的前胶原分子。此分子的装配起始于内质网，后经高尔基体装配完成，被包装到分泌泡中，分泌到细胞外。前胶原分子分泌到细胞外之后，前肽序列被专一的蛋白水解酶切除，于是前胶原转变成了胶原分子。相邻的胶原分子在细胞外经赖氨酸残基横联成共价键，相互以四分之一错位排列的方式 [15] 装配成了胶原原纤维。如果横键的建立受阻，则原纤维的张力强度大大下降。跟腱中横键特别丰富，具有很强的抗张能力，适应于支撑体重和进行剧烈运动。
6 胶原原纤维的组成
胶原纤维的直径以其中所含胶原原纤维的多少、粗细而定。原纤维的直径随其所在组织的不同而异。肌腱的原纤维可比角膜中的原纤维粗约20倍。高负荷力的组织中原纤维比较粗，其负荷力的大小与原纤维粗细成正相关。另外，影响原纤维粗细的因素还有糖基化程度(越细的原纤维其糖基化程度越高)、原纤维表面是否存在较小的胶原分子、胶原分子末端是否存在较长的肽链、周围蛋白多糖的类型和浓度。
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肌腱细胞胶原纤维的组成需经过三个过程:胶原原纤维阶段、原纤维束阶段、组织特异性
聚合体阶段 [16] 。在肌腱的形成过程中，细胞外部按不同等级分成了许多胞外分 隔，它代表了胞质成分向胞外空间的延伸。原纤维的组装发生在细胞表面的胞外分隔中。初级分隔是一系列较窄的通道，包含单根或成组的原纤维。这些原纤维被胞膜包绕且深入胞浆内部，远端与胞外区域相通。这些较窄的通道相互从侧面融合形成第二级划定分隔。在第二级分隔中，原纤维单体相互以添加融合或相似融合的方式 [15] 形成原纤维束。这种排列方式的形成原因在于:只有如此程度的重叠才能使相邻胶原分子的氨基酸相互作用而形成稳定状态。在电镜下明显可见64～70nm左右的周期性横纹结构。从横切面看是圆形结构，从纵切面看为两端逐渐变细的尾状结构。Scott(1984)提出通过decorin的表面包被可以促使原纤维融合过程发生。第三级分
隔是由并联的两个或三个细胞来确定界限。在其中，原纤维束相互之间以融合或接合方式聚合成聚合体。第三级分隔相互交叉，部分区域相邻，部分区域相通。
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7 生长因子及其受体表达对肌腱细胞的影响
生长因子是由细胞产生的，能调节自身和其它细胞功能小分子可溶性蛋白质或多肽，通过与受体特异性的结合启动其效应作用。它可以调节细胞的增殖、分化过程并改变细胞产物的合成。
Murphy [17] 研究发现肌腱细胞的增殖在一定范围内与IGF-1的浓度呈量效关系，同时发现IGF-1对肌腱细胞的胶原合成有促进作用。Klein [18] 应用TGF-β后发现肌腱细胞的胶原产量明显增加，细胞数量变化不明显。Barbara等 [19] 对bFGF研究后发现，bFGF参与肌腱愈合的早期修复过程，能够促进肌腱细胞增殖，提高Ⅲ型胶原的表达。Molˉloy [20] 研究认为bFGF在体内可促进肌腱细胞增殖及胶原合成。Haydon [21] 把BMP-13、14直接注射到大鼠肌腱损伤部位，可使修复后的肌腱最大张力提高39%，而把BMP-12用于鸡的肌腱损伤部位后，其最大张力也有所提高。Rodeo [22] 认为BMP-2有利于肌腱的愈合。Fu [23] 研究BMP-12可以促进肌腱细胞的增殖和基质生成。
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8 生物力学对肌腱细胞的影响
肌腱是连接骨骼肌肌腹与骨骼之间的单轴致密胶原纤维结缔组织束，是弹性小、寡血管的组织，用于传导肌腹收缩所产生的力，牵引骨骼使之产生运动。肌腱本身不具有收缩能力，但具有很强的耐压抗张力和抗摩擦的能力。因此，力学刺激必然对肌腱细胞的生物学特性产生很大的影响。力学信号可刺激细胞表面的牵张受体和粘附位点，导致一系列瀑布效应，从而改变细胞周围的营养成分、氧气等 [24] 。还可改变细胞内的第二信使NO或Ca 2+ 浓度，直接或间接影响细胞因子mRNA的表达，从而影响基质蛋白的合成。有人 [5，6] 研究tenascin-C mRNA和蛋白质水平在牛的屈肌肌腱远端(受力大)含量比近端(受力小)大。在受力条件下，肌腱细胞之间相互连接紧密，组合更多的胞质actin进入有原肌球蛋白的张力纤维 [25] 。局部给予兔韧带一定的张力可增加胶原原纤维D周期的长度 [26] 。Carina [27] 发现注入CDMP-2，在不受力的条件下可向骨的方向转化，在受静态力的条件下可向软骨方向转化，而在受周期性牵张力的条件下则会向肌腱方向转化。Hannafin等 [28] 则对狗的肌腱进行了研究，发现若不施以应力，则8周后细胞的数目、细胞合成胶原的量明显减少。但若施以周围性张力，仅4周即可发现细胞数目、细胞合成胶原数量有明显的增加。Skutek [29] 发现周期性张力促进肌腱愈合的机制主要是通过提高各类生长因子的含量，如TGF-B、PDGF、bFGF，从而促进细胞增殖、分化及基质形成。他还认为 [30] 当肌腱受外力作用后，IL-6分泌增多，IL-6参与炎症反应，同时也能修复肌腱。组织工程化肌腱使人类在体外预制有生命的肌腱组织以替代病损肌腱成为可能。而构建组织工程化肌腱需要快速扩增的大量种子细胞，肌腱细胞的来源受到了一定条件的制约，这限制了肌腱组织工程学的进展。组织工程化肌腱要想产业化生产，就不能只限于自体肌腱细胞作为种子细胞的唯一来源。因此，研究组织工程化肌腱的种子细胞来源问题极其重要。
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基金项目:国家高科技研究“863”计划资助项目(2002AA205031)
作者单位: 200011 上海第二医科大学附属第九人民医院整形外科、上海第二医科大学组织工程研究中心
(收稿日期:2003-08-14)
(编辑 曲全), 百拇医药(许锋)