乙型肝炎患者外周血单核细胞穿孔素活性及其意义的探讨
【摘要】 目的 研究不同类型乙型肝炎患者外周血单核细胞(PBMC)穿孔素活性与肝损害以及HBV复制程度之间的关系，评价患者细胞免疫状态，为临床治疗提供指导。方法 将84例乙型肝炎患者根据临床分型分4组，即慢性乙肝轻度、中重度、重型及肝硬化，其中HBV-DNA(+)50例，HBV-DNA(-)34例，15例健康体检者作为正常对照。采用溶血法测定PBMC穿孔素活性，分析PBMC穿孔素活性与肝损害以及HBV复制程度之间的关系。结果 对照组、慢性乙肝轻度、中重度、重型及肝硬化组PBMC穿孔素活性分别为:35.3±7.46%，23.5±8.86%，48.4±13.2%，61.1±22.2%，27.1±12.3%，其中慢性乙肝轻度组低于正常对照组，差异有显著性，肝硬化组与正常对照组差异无显著性;慢性乙肝中重度、重型组高于正常对照组，差异有显著性。HBV-DNA(+)组穿孔素活性为41.7±21.1%，HBV-DNA(-)组为38.2±19.36%，阳性组高于正常对照组，差异有显著性;阴性组与对照组相比差异无显著性，阳性组与阴性组之间差异亦无显著性。同时将患者PBMC穿孔素活性、肝功能(TBil、ALT)进行相关分析，提示PBMC穿孔素活性与TBil、ALT呈显著正相关。结论 PBMC穿孔素活性与乙型肝炎肝损害密切相关，穿孔素参与了慢性乙肝的发病过程，乙肝病毒的复制可以激活CTL细胞毒性作用，通过穿孔素活性测定可以评估患者的细胞免疫状态，对临床治疗有一定的指导意义。
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关键词 乙型肝炎 PBMC 穿孔素
【文献标识码】 A 【文章编号】
Study of perforin competence of peripheral bood mononuclear
in patients with hepatitis B and it’s significance
Ai Yaowei，Cai Shuqing，Wang Yuan.
The Second People’s Hospital of Jingzhou，Hubei434000.
【Abstract】 Objective The purpose of this study is to explore the relatationship between hepatic injury，HBV duplication and perforin competece of peripheral blood mononuclear cells(PBMC)in patients with hepatitis B，so as to estimate cellular immunity of the patients and guide clinic treatment.Methods All84patients were devided into four groups:mild chronic hepatitis，moderate to severe chronic hepatitis，fulminate hepatitis，post-hepatitis cirrhosis.The objects were divided into two groups according to HBV-DNA，15healthy as normal control.Perforin competence of PBMC was detected by haemolysis.Results The level of perforin competence of normal control group，milde chronic hepatitis group，moderate to severe chronic hepatitis group，fulminate hepatitis group，post-hepatitis cirrhosis group were as follows:35.3±7.46%，23.5±8.86%，48.4±13.2%，61.1±22.2%，27.1±12.3%，among them，the mild chronic hepatitis group was significantly lower than that of controls，there were no difference between post-hepˉatitis cirrhosis group and normal controls，the level of perforin competence of the moderate to serve chronic hepatitis group and fulminate hepatitis group were much higher than that of controls.The level of perforin competence of HBV-DNA(+)group and HBV-DNA(-)group were as follows:41.7±21.1%，38.2±19.36%，the former was much highter than that of controls，but no difference with HBV-DNA(-)group，there were no differnce between HBV-DNA(-)group and normal controls either.Conclusion These results suggest that perforin is involved in the patholˉgeresis of liver cell injury of hepatitis B，HBV duplication can stimulate cytotoxicity of CTL，detecting perforin compeˉtence of PBMC could estimate the patients cellular immunityand guide clinic treatment.
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Key words hepatitis B PBMC perforin
乙型肝炎病毒(HBV)感染时机体对病毒抗原的免疫应答不仅和发病机制有关而且与乙肝病毒清除有关，HBV特异性CTL对感染肝细胞的识别被认为是引起肝损害和清除病毒的中心机制 [1] 。CTL介导的细胞毒作用可以通过穿孔素途径引起靶细胞坏死或通过CD95途径引起靶细胞凋亡，CTL引起的肝细胞损伤常同时有这两种机制参与。Fas在肝炎发病中的作用已有较多的阐述，而穿孔素在肝损害中的临床研究尚未见报道。本研究旨在通过测定乙肝患者PBMC穿孔素活性了解不同类型乙型肝炎细胞免疫状况以及穿孔素与肝损害以及HBV复制程度之间的关系，探索穿孔素在慢性乙肝发病过程中的作用及其临床意义。
1 资料和方法
1.1 一般资料 84例乙型肝炎患者均来自我院肝病中心住院及门诊患者，诊断符合2000年(西安)第十次全国病毒性肝炎学术会议修订的病毒性肝炎的诊断标准 [2] 。其中男77例，女7例;平均年龄35.2岁，所有病例均常规检测肝功能、HBVM、HBV-DNA。所选择对象近2月未应用过免疫调节药物，并排除HAV、HCV、HDV、HEV等病毒的重叠感染，排除酒精性肝炎、血吸虫病、脂肪肝、药物型肝炎等。15例健康人为正常对照组，其中男10例，女5例，平均年龄36.7岁。所有标本均清晨空腹静脉取血，肝素抗凝，立即行PBMC分离，同时实验家兔心脏取血，RBC分离，整个操作过程在室温、无菌的条件下进行。
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1.2 主要试剂和材料 淋巴细胞分离液(上海试剂二厂);Hank’s液(无Ca 2+ 、Mg 2+ );小牛血清及RPMI1640(GIBCO公司);0.1mol/L的CaCl 2 ;OPD-H 2 O 2 片剂及PBS缓冲液(上海太阳生物试剂公司);实验家兔。
1.3 PBMC穿孔素活性测定方法 [3] 取3根试管分别加入兔RBC100μl，分别命名为测定管、全溶血管和对照管。测定管和对照管分别加入PBMC100μl，全溶血管加入DH 2 O100μl，另外测定管加入0.1mol/L CaCl 2 10μl。3根试管同时置于5%CO 2 37℃的温箱反应16h后取出离心2000r/min，20min后取上清10μl。以OPD-H 2 O 2 系统显色，37℃，15min。加终止液(2mol/L H 2 SO 4 )1～2滴。在∑-960型全自动酶标仪上测490nm处吸光度值(A)。计算溶血率，计算公式为:穿孔素溶血活性(%)=(测定管A值-对照管A值)÷全溶血管A值×100%。
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1.4 统计学处理 [4] 所测数据采用微机全部输入SPSS10.0数据库中，采用方差分析，相关分析，回归分析及配对t检验多种统计分析方法。
2 结果
2.1 不同临床类型乙型肝炎PBMC穿孔素溶血活性比较 见表1。
表1 不同临床类型乙型肝炎PBMC穿孔素溶血活性 略
同对照组相比较，慢性乙肝轻度组PBMC穿孔素溶血 活性低于正常对照组，慢性乙肝中重度，重型组高于正常对照组，差异有显著性(P<0.05)。
2.2 HBV-DNA(+)组与HBV-DNA(-)组PBMC穿孔素溶血活性与正常对照组之间的比较 见表2。
表2 HBV-DNA(+)组与HBV-DNA(-)组PBMC穿孔素溶血活性比较 略
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表2显示，HBV-DNA(+)组与HBV-DNA(-)组PBMC穿孔素溶血活性均高于正常对照组，经过样本均数t检验，HBV-DNA(+)组与正常对照组之间差异有显著性(P<0.05)，而阴性组与正常对照组相比差异无显著性(P>0.05)，HBV-DNA(+)组与HBV-DNA(-)组之间比较差异无显著性(P>0.05)。
2.3 穿孔素与TBil、ALT的相关分析 见表3。
表3 84例乙型肝炎PBMC穿孔素活性与TBil、ALT的相关分析 略
以上分析表明TBil与穿孔素活性之间的Pearson相关系数为0.433，双侧显著性检验P<0.01，ALT与穿孔素活性之间的Pearson相关系数为0.347，双侧显著性检验P<0.01，均存在显著性相关。
2.4 穿孔素和TBil、ALT之间的多元回归分析 见表4。
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表4 回归方程的回归系数分析 略
此表中所反映的回归模型为:Y=穿孔素，X 1 =TBil，X 2 =ALT，第一列为Y=34.556+0.055X 1 ，回归系数为0.055，表示穿孔素活性与TBil成正相关，即TBil越高，反映该患者的穿孔素的活性越高;第二列为Y=25.988+0.065X 1 +0.0256X 2 ，表示穿孔素活性与TBil、ALT均呈正相关，即TBil、ALT越高，反映该患者的穿孔素的活性越高。
3 讨论
正常人在感染病毒以后，病毒经血进入肝内，被抗原呈递细胞(巨噬细胞、树突细胞、B细胞)处理后与HLA-Ⅱ分子结构形成复合体，再与CD4 + T细胞上TCR受体特异性结合，并在CD28/CD80，CD40/CD40L等协同因子的作用下，将抗原信号经磷脂酰醇、蛋白激酶等多种途径传递到CD4 + T细胞核内，激活核内因子，引起核内IL-2mRNA转录生成大量的IL-2，IL-2使CD4 + ，CD8 + T淋巴细胞、巨噬细胞及NK细胞发生增殖，这些细胞又释放出大量细胞因子(IL-12，IFN-γ，TNF-α等)进一步使这些细胞发生增殖，最终CD8 + T淋巴细胞(CTL)、巨噬细胞及NK细胞通过穿孔素作用或凋亡途径破坏感染病毒的细胞，从而清除病毒 [5，6] 。CTL细胞是在MHC-Ⅰ类抗原制约下识别靶细胞，通过抗原受体和抗原紧密结合，并从胞浆颗粒中释出穿孔素，在Ca 2+ 的存在下，穿孔素单体可迅速附着于靶细胞膜，嵌入细胞膜的双层磷脂中，多个单体聚合形成打孔聚合物，在靶细胞膜上形成不同孔径(50～160nm)的跨膜孔道，从而导致靶细胞膜去极化，使细胞外水分进入胞内，一些电解质和大分子物质流出胞外，最终引起靶细胞渗透性死亡。丝氨酸酯酶也可经穿孔通道进入细胞而促进杀伤作用。基于穿孔素的细胞毒活性在多个水平上都是Ca 2+ 依赖的，如受体转导的CTL激活、穿孔素和颗粒酶的分泌、靶细胞膜的损伤等。HBV特异性CTL对感染肝细胞的识别被认为是引起肝损害和清除病毒的中心机制，作为免疫应答主要的效应细胞，在HBV免疫学中有极其重要的作用，病毒感染短暂或持续、肝细胞损伤轻微或严重主要取决于CTL应答的广度和力度 [1] 。
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PBMC主要为T细胞，也包括B、NK、K、单核细胞等免疫活性细胞，PBMC在机体的细胞免疫反应中起重要作用。CTL是细胞免疫杀伤效应的主要效应细胞，而穿孔素是CTL杀伤靶细胞的重要效应分子，有研究证实穿孔素介导的杀伤性T细胞细胞毒作用在慢性乙肝肝损害中发挥了重要的作用。有肝组织学研究表明，慢性乙型肝炎的肝活检组织中可见大量淋巴细胞浸润，其中CD 8 细胞主要分布在伴有碎屑样坏死的汇管周围区和伴有灶性坏死的肝实质区，而CD 4主要见于汇管区中央，CD 8 细胞肝内浸润随肝脏病变程度的加重而增加 [7] 。Balkow[8] 等通过淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染Fas-FasL及穿孔素-颗粒酶A和B中一种或两种自发突变，或靶基因缺失的小鼠来了解Fas-FasL及穿孔素-颗粒酶A和B途径在病毒性肝炎发病过程中的作用，结果发现，病毒的清除只是依赖穿孔素，但是只有在Fas-FasL及穿孔素途径同时发挥作用时才引起肝损害。这些结果表明穿孔素和Fas/Fas-L系统与慢性乙肝肝细胞损伤机制有关。本研究发现，不同类型乙型肝炎PBMC穿孔素活性随着肝损害的程度加重逐渐升高，顺序为:慢性乙肝轻度、肝硬化最低，中重度次之，重型最高，组间差异具有显著性(P<0.05)，表明PBMC穿孔素活性与乙 肝患者肝脏的炎症活动程度密切相关，这一点与有关的文献报道相一致。Tagashira [9] 等研究了15例慢性乙肝肝组织穿孔素和Fas-L mRNA的表达，结果表明:所有病例穿孔素和Fas-L mRNA均呈阳性，而对照组没有，经过半定量分析显示，组织炎症活动程度、血清ALT与穿孔素和Fas-L mRˉNA的表达呈正相关。本研究通过PBMC穿孔素与肝功能TBil、ALT的相关性分析及多因素的回归分析，显示出PBMC穿孔素活性与TBil、ALT密切相关(P<0.01)，进一步揭示了3者之间的密切联系，通过该回归方程可以由TBil、ALT来评估患者的穿孔素活性，可进一步了解患者的细胞免疫状况是增强还是减弱，由此指导临床治疗，而通过穿孔素活性测定对了解患者肝功能损害趋势及炎症活动的程度也有一定的帮助，可为临床治疗提供依据。慢性乙肝轻度、肝硬化组PBMC穿孔素活性低于正常对照组，考虑是由于该两组病人肝组织的炎症活动相对较轻，其组织炎症活动的改变在PBMC表达不明所致，而该类患者血清中TH 2 类细胞因子占优势，TH 2 类细胞因子对细胞免疫的负调节作用致使PBMC穿孔素活性反而降低。
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PBMC按其表面的分化抗原(cluster of differentiation，CD)可分为功能不同的若干亚群，其中主要是CD3 + 、CD4 + 、CD 8+ 。在生理状况下各T细胞亚群间通过分泌相应的细胞因子而相互作用、相互协调以有效地清除抗原异物，完成免疫应答效应，达到免疫平衡。当HBV感染时，T细胞可通过其表面的T细胞受体(T cell receptor，TCR)与HBV或被HBV感染的细胞特异性结合，发挥免疫杀伤作用。但CD +3 、CD +4 、CD 8+ 等T细胞亚群对HBV易感，被感染的T细胞亚群可呈现不同形式的改变，其对T细胞亚群的作用主要表现为CD +3 、CD+4 百分率下降，CD +8 百分率升高，CD +4 /CD +8 比值降低，CD +4 为Th/Ti细胞亚群，具有诱导B细胞产生抗体、诱导抑制性T细胞产生和分泌IL-2的功能;CD +4 减少可能与机体不能及时清除乙肝病毒感染有关。CD +8 为Ts和Tc细胞亚群，具有抑制B细胞产生抗体、对Ⅰ类MHC抗原的靶细胞产生细胞毒作用。CD +4 、CD +8 的比例关系是机体免疫调控网络的重要枢纽。生理状况下，二者相互协调、相互制约，处于动态平衡。CD +4 、CD +8 比例失衡是免疫调控紊乱的结果，也是乙肝患者病情迁延反复的重要原因之一。从各组PBMC穿孔素活性与正常组比较来看，慢性乙肝轻度组及肝硬化组比正常组低，CTL杀伤活性下降，提示轻度慢性乙肝及肝硬化患者可能存在细胞免疫功能不足 [10] ，考虑这类患者由于CD +4 T细胞下降，其产生的IL-2减少，肝细胞HLA-Ⅰ的表达下降，同时激活CTL的能力也下降，另外，CD +8 细胞的上升可能是以抑制性T细胞(Ts)升高为主，Ts通过直接对抗原提呈细胞(APC)产生细胞毒效应，或分泌抑制因子(TsF)介导抑制效应，或通过独特型网络而发挥抑制效应。Ts细胞作用的靶细胞主要是抗原特异性的辅助T细胞和B细胞，进一步抑制CD +4 T细胞的功能，导致CTL的杀伤活性下降，致病毒感染持续。本研究结果显示慢性乙肝轻度PBMC穿孔素活性与肝硬化组之间差异无显著性，反映这两类患者肝脏炎症活动方面有一定的共性，即炎症活动相对较轻，病情迁延，进展缓慢。乙型肝炎中重度以及重型组PBMC穿孔素活性上升，肝功能损害越重穿孔素活性越高，考虑这类患者CD +8 T细胞增加也可能主要是以杀伤性T淋巴细胞(TC)为主，CTL活性越高，肝脏炎症活动越强。Hasegawa [11] 利用双色荧光细胞分离仪对重型肝炎外周血T淋巴细胞做了进一步的分离，结果也发现细胞毒性T细胞(CTL)功能显著增强，而抑制性T细胞(Ts)功能减低，病情好转后Ts功能逐渐上升，CTL功能逐步下降。细胞因子的检测也证明在病情活动期以Th1类细胞因子升高为主，缓解期以Th2类细胞因子升高为主，在慢性肝炎持续期IL-2、IFN-γ减少，CTL应答低下，而在急性再活动期IL-2、IFN-γ增加，CTL的细胞毒性增加 [1] 。
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HBV-DNA直接反映HBV的复制程度，HBV不仅可以在肝细胞中复制，而且可以感染PBMC，血清HBV-DNA水平与胞核HBcAg的表达程度呈显著的正相关 [12] ，HBV复制越活跃，HBcAg的表达程度越高。HBV感染可以影响慢性乙肝患者T细胞亚群变化，刘映霞等 [13] 对HBV-DNA阳性与阴性患者的T细胞亚群进行了检测，结果示前者CD 8+ 细胞增加，CD +4/CD +8 比值下降，两组间差异有显著性，提示HBV感染PBMC确能影响T细胞亚群的变化，主要是对CD 8+ 细胞的影响。HBV感染的肝细胞或PBMC可以被HLA-Ⅰ类分子限制的CTL所识别，进而激活CTL，引起炎症反应并清除病毒。本研究提示HBV-DNA阳性组穿孔素活性高于对照组，表明HBV的复制有激活CTL的作用。而HBV-DNA阴性组穿孔素活性与对照组差异无显著性，考虑是由于患者虽然感染HBV，但是无病毒复制，不能表达HBcAg，抗原提呈细胞(APC)不能向CTL提呈抗原，CTL不能被激活，故HBV-DNA阴性对PBMC穿孔素活性变化不大。但HBV-DNA阳性组虽然有CTL的激活，但阳性组PBMC穿孔素活性与阴性组差异亦无显著性，表明CTL的穿孔素途径在抑制乙肝病毒复制方面的作用有限。本研究中HBV-DNA阳性组中重度及重型组所占比例与轻度及肝硬化组差异无显著性，由此表明乙肝病毒的清除可能是CTL的穿孔素途径和其它的途径共同作用的结果，如CD95途径、细胞因子非细胞损伤机制等，说明乙肝病毒清除机制 的复杂性。
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参考文献
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8 Balkow S，Kersten A，Tran T T，et al.Concerted action of the Fasl/Fas and perforin/Gramzyme A and B pathurags Is mandatory for the denelˉopment of early viral hepatitis but mot recovery from viral infection.JViˉrol，2001，75(18):8781-8791.
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10 王剑虹，吴建波.肝硬变患者的细胞免疫状态研究.世界华人消化杂志，2000，8(10):1178-1180.
11 Hasegawa K.Dual color florescence analysis of peripheral T cell subˉsets in hepatitis B induced liver disease.Hepatology，1987，8:1134-1137.
12 Chu CM，Yeh CT，Chien RN，et al.The degree of hepatocyte nuclear but not cytoplasmic expression of hepatitis B core antigen reflect the lever of viral replication in chronic hepatitis B virus infection.J Clin Microbil，1997，35:102-105.
13 刘映霞，胡国龄，何淑雅，等.慢性乙肝患者PBMC中HBV感染及其对T细胞亚群的影响.中国现代医学杂志，2002，12(8):70-73.
作者单位:434000湖北省荆州市第二人民医院
(收稿日期:2003-09-26)
(编辑 夫凡), http://www.100md.com(艾耀伟)
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关键词 乙型肝炎 PBMC 穿孔素
【文献标识码】 A 【文章编号】
Study of perforin competence of peripheral bood mononuclear
in patients with hepatitis B and it’s significance
Ai Yaowei，Cai Shuqing，Wang Yuan.
The Second People’s Hospital of Jingzhou，Hubei434000.
【Abstract】 Objective The purpose of this study is to explore the relatationship between hepatic injury，HBV duplication and perforin competece of peripheral blood mononuclear cells(PBMC)in patients with hepatitis B，so as to estimate cellular immunity of the patients and guide clinic treatment.Methods All84patients were devided into four groups:mild chronic hepatitis，moderate to severe chronic hepatitis，fulminate hepatitis，post-hepatitis cirrhosis.The objects were divided into two groups according to HBV-DNA，15healthy as normal control.Perforin competence of PBMC was detected by haemolysis.Results The level of perforin competence of normal control group，milde chronic hepatitis group，moderate to severe chronic hepatitis group，fulminate hepatitis group，post-hepatitis cirrhosis group were as follows:35.3±7.46%，23.5±8.86%，48.4±13.2%，61.1±22.2%，27.1±12.3%，among them，the mild chronic hepatitis group was significantly lower than that of controls，there were no difference between post-hepˉatitis cirrhosis group and normal controls，the level of perforin competence of the moderate to serve chronic hepatitis group and fulminate hepatitis group were much higher than that of controls.The level of perforin competence of HBV-DNA(+)group and HBV-DNA(-)group were as follows:41.7±21.1%，38.2±19.36%，the former was much highter than that of controls，but no difference with HBV-DNA(-)group，there were no differnce between HBV-DNA(-)group and normal controls either.Conclusion These results suggest that perforin is involved in the patholˉgeresis of liver cell injury of hepatitis B，HBV duplication can stimulate cytotoxicity of CTL，detecting perforin compeˉtence of PBMC could estimate the patients cellular immunityand guide clinic treatment.
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Key words hepatitis B PBMC perforin
乙型肝炎病毒(HBV)感染时机体对病毒抗原的免疫应答不仅和发病机制有关而且与乙肝病毒清除有关，HBV特异性CTL对感染肝细胞的识别被认为是引起肝损害和清除病毒的中心机制 [1] 。CTL介导的细胞毒作用可以通过穿孔素途径引起靶细胞坏死或通过CD95途径引起靶细胞凋亡，CTL引起的肝细胞损伤常同时有这两种机制参与。Fas在肝炎发病中的作用已有较多的阐述，而穿孔素在肝损害中的临床研究尚未见报道。本研究旨在通过测定乙肝患者PBMC穿孔素活性了解不同类型乙型肝炎细胞免疫状况以及穿孔素与肝损害以及HBV复制程度之间的关系，探索穿孔素在慢性乙肝发病过程中的作用及其临床意义。
1 资料和方法
1.1 一般资料 84例乙型肝炎患者均来自我院肝病中心住院及门诊患者，诊断符合2000年(西安)第十次全国病毒性肝炎学术会议修订的病毒性肝炎的诊断标准 [2] 。其中男77例，女7例;平均年龄35.2岁，所有病例均常规检测肝功能、HBVM、HBV-DNA。所选择对象近2月未应用过免疫调节药物，并排除HAV、HCV、HDV、HEV等病毒的重叠感染，排除酒精性肝炎、血吸虫病、脂肪肝、药物型肝炎等。15例健康人为正常对照组，其中男10例，女5例，平均年龄36.7岁。所有标本均清晨空腹静脉取血，肝素抗凝，立即行PBMC分离，同时实验家兔心脏取血，RBC分离，整个操作过程在室温、无菌的条件下进行。
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1.2 主要试剂和材料 淋巴细胞分离液(上海试剂二厂);Hank’s液(无Ca 2+ 、Mg 2+ );小牛血清及RPMI1640(GIBCO公司);0.1mol/L的CaCl 2 ;OPD-H 2 O 2 片剂及PBS缓冲液(上海太阳生物试剂公司);实验家兔。
1.3 PBMC穿孔素活性测定方法 [3] 取3根试管分别加入兔RBC100μl，分别命名为测定管、全溶血管和对照管。测定管和对照管分别加入PBMC100μl，全溶血管加入DH 2 O100μl，另外测定管加入0.1mol/L CaCl 2 10μl。3根试管同时置于5%CO 2 37℃的温箱反应16h后取出离心2000r/min，20min后取上清10μl。以OPD-H 2 O 2 系统显色，37℃，15min。加终止液(2mol/L H 2 SO 4 )1～2滴。在∑-960型全自动酶标仪上测490nm处吸光度值(A)。计算溶血率，计算公式为:穿孔素溶血活性(%)=(测定管A值-对照管A值)÷全溶血管A值×100%。
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1.4 统计学处理 [4] 所测数据采用微机全部输入SPSS10.0数据库中，采用方差分析，相关分析，回归分析及配对t检验多种统计分析方法。
2 结果
2.1 不同临床类型乙型肝炎PBMC穿孔素溶血活性比较 见表1。
表1 不同临床类型乙型肝炎PBMC穿孔素溶血活性 略
同对照组相比较，慢性乙肝轻度组PBMC穿孔素溶血 活性低于正常对照组，慢性乙肝中重度，重型组高于正常对照组，差异有显著性(P<0.05)。
2.2 HBV-DNA(+)组与HBV-DNA(-)组PBMC穿孔素溶血活性与正常对照组之间的比较 见表2。
表2 HBV-DNA(+)组与HBV-DNA(-)组PBMC穿孔素溶血活性比较 略
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表2显示，HBV-DNA(+)组与HBV-DNA(-)组PBMC穿孔素溶血活性均高于正常对照组，经过样本均数t检验，HBV-DNA(+)组与正常对照组之间差异有显著性(P<0.05)，而阴性组与正常对照组相比差异无显著性(P>0.05)，HBV-DNA(+)组与HBV-DNA(-)组之间比较差异无显著性(P>0.05)。
2.3 穿孔素与TBil、ALT的相关分析 见表3。
表3 84例乙型肝炎PBMC穿孔素活性与TBil、ALT的相关分析 略
以上分析表明TBil与穿孔素活性之间的Pearson相关系数为0.433，双侧显著性检验P<0.01，ALT与穿孔素活性之间的Pearson相关系数为0.347，双侧显著性检验P<0.01，均存在显著性相关。
2.4 穿孔素和TBil、ALT之间的多元回归分析 见表4。
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表4 回归方程的回归系数分析 略
此表中所反映的回归模型为:Y=穿孔素，X 1 =TBil，X 2 =ALT，第一列为Y=34.556+0.055X 1 ，回归系数为0.055，表示穿孔素活性与TBil成正相关，即TBil越高，反映该患者的穿孔素的活性越高;第二列为Y=25.988+0.065X 1 +0.0256X 2 ，表示穿孔素活性与TBil、ALT均呈正相关，即TBil、ALT越高，反映该患者的穿孔素的活性越高。
3 讨论
正常人在感染病毒以后，病毒经血进入肝内，被抗原呈递细胞(巨噬细胞、树突细胞、B细胞)处理后与HLA-Ⅱ分子结构形成复合体，再与CD4 + T细胞上TCR受体特异性结合，并在CD28/CD80，CD40/CD40L等协同因子的作用下，将抗原信号经磷脂酰醇、蛋白激酶等多种途径传递到CD4 + T细胞核内，激活核内因子，引起核内IL-2mRNA转录生成大量的IL-2，IL-2使CD4 + ，CD8 + T淋巴细胞、巨噬细胞及NK细胞发生增殖，这些细胞又释放出大量细胞因子(IL-12，IFN-γ，TNF-α等)进一步使这些细胞发生增殖，最终CD8 + T淋巴细胞(CTL)、巨噬细胞及NK细胞通过穿孔素作用或凋亡途径破坏感染病毒的细胞，从而清除病毒 [5，6] 。CTL细胞是在MHC-Ⅰ类抗原制约下识别靶细胞，通过抗原受体和抗原紧密结合，并从胞浆颗粒中释出穿孔素，在Ca 2+ 的存在下，穿孔素单体可迅速附着于靶细胞膜，嵌入细胞膜的双层磷脂中，多个单体聚合形成打孔聚合物，在靶细胞膜上形成不同孔径(50～160nm)的跨膜孔道，从而导致靶细胞膜去极化，使细胞外水分进入胞内，一些电解质和大分子物质流出胞外，最终引起靶细胞渗透性死亡。丝氨酸酯酶也可经穿孔通道进入细胞而促进杀伤作用。基于穿孔素的细胞毒活性在多个水平上都是Ca 2+ 依赖的，如受体转导的CTL激活、穿孔素和颗粒酶的分泌、靶细胞膜的损伤等。HBV特异性CTL对感染肝细胞的识别被认为是引起肝损害和清除病毒的中心机制，作为免疫应答主要的效应细胞，在HBV免疫学中有极其重要的作用，病毒感染短暂或持续、肝细胞损伤轻微或严重主要取决于CTL应答的广度和力度 [1] 。
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PBMC主要为T细胞，也包括B、NK、K、单核细胞等免疫活性细胞，PBMC在机体的细胞免疫反应中起重要作用。CTL是细胞免疫杀伤效应的主要效应细胞，而穿孔素是CTL杀伤靶细胞的重要效应分子，有研究证实穿孔素介导的杀伤性T细胞细胞毒作用在慢性乙肝肝损害中发挥了重要的作用。有肝组织学研究表明，慢性乙型肝炎的肝活检组织中可见大量淋巴细胞浸润，其中CD 8 细胞主要分布在伴有碎屑样坏死的汇管周围区和伴有灶性坏死的肝实质区，而CD 4主要见于汇管区中央，CD 8 细胞肝内浸润随肝脏病变程度的加重而增加 [7] 。Balkow[8] 等通过淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒感染Fas-FasL及穿孔素-颗粒酶A和B中一种或两种自发突变，或靶基因缺失的小鼠来了解Fas-FasL及穿孔素-颗粒酶A和B途径在病毒性肝炎发病过程中的作用，结果发现，病毒的清除只是依赖穿孔素，但是只有在Fas-FasL及穿孔素途径同时发挥作用时才引起肝损害。这些结果表明穿孔素和Fas/Fas-L系统与慢性乙肝肝细胞损伤机制有关。本研究发现，不同类型乙型肝炎PBMC穿孔素活性随着肝损害的程度加重逐渐升高，顺序为:慢性乙肝轻度、肝硬化最低，中重度次之，重型最高，组间差异具有显著性(P<0.05)，表明PBMC穿孔素活性与乙 肝患者肝脏的炎症活动程度密切相关，这一点与有关的文献报道相一致。Tagashira [9] 等研究了15例慢性乙肝肝组织穿孔素和Fas-L mRNA的表达，结果表明:所有病例穿孔素和Fas-L mRNA均呈阳性，而对照组没有，经过半定量分析显示，组织炎症活动程度、血清ALT与穿孔素和Fas-L mRˉNA的表达呈正相关。本研究通过PBMC穿孔素与肝功能TBil、ALT的相关性分析及多因素的回归分析，显示出PBMC穿孔素活性与TBil、ALT密切相关(P<0.01)，进一步揭示了3者之间的密切联系，通过该回归方程可以由TBil、ALT来评估患者的穿孔素活性，可进一步了解患者的细胞免疫状况是增强还是减弱，由此指导临床治疗，而通过穿孔素活性测定对了解患者肝功能损害趋势及炎症活动的程度也有一定的帮助，可为临床治疗提供依据。慢性乙肝轻度、肝硬化组PBMC穿孔素活性低于正常对照组，考虑是由于该两组病人肝组织的炎症活动相对较轻，其组织炎症活动的改变在PBMC表达不明所致，而该类患者血清中TH 2 类细胞因子占优势，TH 2 类细胞因子对细胞免疫的负调节作用致使PBMC穿孔素活性反而降低。
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PBMC按其表面的分化抗原(cluster of differentiation，CD)可分为功能不同的若干亚群，其中主要是CD3 + 、CD4 + 、CD 8+ 。在生理状况下各T细胞亚群间通过分泌相应的细胞因子而相互作用、相互协调以有效地清除抗原异物，完成免疫应答效应，达到免疫平衡。当HBV感染时，T细胞可通过其表面的T细胞受体(T cell receptor，TCR)与HBV或被HBV感染的细胞特异性结合，发挥免疫杀伤作用。但CD +3 、CD +4 、CD 8+ 等T细胞亚群对HBV易感，被感染的T细胞亚群可呈现不同形式的改变，其对T细胞亚群的作用主要表现为CD +3 、CD+4 百分率下降，CD +8 百分率升高，CD +4 /CD +8 比值降低，CD +4 为Th/Ti细胞亚群，具有诱导B细胞产生抗体、诱导抑制性T细胞产生和分泌IL-2的功能;CD +4 减少可能与机体不能及时清除乙肝病毒感染有关。CD +8 为Ts和Tc细胞亚群，具有抑制B细胞产生抗体、对Ⅰ类MHC抗原的靶细胞产生细胞毒作用。CD +4 、CD +8 的比例关系是机体免疫调控网络的重要枢纽。生理状况下，二者相互协调、相互制约，处于动态平衡。CD +4 、CD +8 比例失衡是免疫调控紊乱的结果，也是乙肝患者病情迁延反复的重要原因之一。从各组PBMC穿孔素活性与正常组比较来看，慢性乙肝轻度组及肝硬化组比正常组低，CTL杀伤活性下降，提示轻度慢性乙肝及肝硬化患者可能存在细胞免疫功能不足 [10] ，考虑这类患者由于CD +4 T细胞下降，其产生的IL-2减少，肝细胞HLA-Ⅰ的表达下降，同时激活CTL的能力也下降，另外，CD +8 细胞的上升可能是以抑制性T细胞(Ts)升高为主，Ts通过直接对抗原提呈细胞(APC)产生细胞毒效应，或分泌抑制因子(TsF)介导抑制效应，或通过独特型网络而发挥抑制效应。Ts细胞作用的靶细胞主要是抗原特异性的辅助T细胞和B细胞，进一步抑制CD +4 T细胞的功能，导致CTL的杀伤活性下降，致病毒感染持续。本研究结果显示慢性乙肝轻度PBMC穿孔素活性与肝硬化组之间差异无显著性，反映这两类患者肝脏炎症活动方面有一定的共性，即炎症活动相对较轻，病情迁延，进展缓慢。乙型肝炎中重度以及重型组PBMC穿孔素活性上升，肝功能损害越重穿孔素活性越高，考虑这类患者CD +8 T细胞增加也可能主要是以杀伤性T淋巴细胞(TC)为主，CTL活性越高，肝脏炎症活动越强。Hasegawa [11] 利用双色荧光细胞分离仪对重型肝炎外周血T淋巴细胞做了进一步的分离，结果也发现细胞毒性T细胞(CTL)功能显著增强，而抑制性T细胞(Ts)功能减低，病情好转后Ts功能逐渐上升，CTL功能逐步下降。细胞因子的检测也证明在病情活动期以Th1类细胞因子升高为主，缓解期以Th2类细胞因子升高为主，在慢性肝炎持续期IL-2、IFN-γ减少，CTL应答低下，而在急性再活动期IL-2、IFN-γ增加，CTL的细胞毒性增加 [1] 。
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HBV-DNA直接反映HBV的复制程度，HBV不仅可以在肝细胞中复制，而且可以感染PBMC，血清HBV-DNA水平与胞核HBcAg的表达程度呈显著的正相关 [12] ，HBV复制越活跃，HBcAg的表达程度越高。HBV感染可以影响慢性乙肝患者T细胞亚群变化，刘映霞等 [13] 对HBV-DNA阳性与阴性患者的T细胞亚群进行了检测，结果示前者CD 8+ 细胞增加，CD +4/CD +8 比值下降，两组间差异有显著性，提示HBV感染PBMC确能影响T细胞亚群的变化，主要是对CD 8+ 细胞的影响。HBV感染的肝细胞或PBMC可以被HLA-Ⅰ类分子限制的CTL所识别，进而激活CTL，引起炎症反应并清除病毒。本研究提示HBV-DNA阳性组穿孔素活性高于对照组，表明HBV的复制有激活CTL的作用。而HBV-DNA阴性组穿孔素活性与对照组差异无显著性，考虑是由于患者虽然感染HBV，但是无病毒复制，不能表达HBcAg，抗原提呈细胞(APC)不能向CTL提呈抗原，CTL不能被激活，故HBV-DNA阴性对PBMC穿孔素活性变化不大。但HBV-DNA阳性组虽然有CTL的激活，但阳性组PBMC穿孔素活性与阴性组差异亦无显著性，表明CTL的穿孔素途径在抑制乙肝病毒复制方面的作用有限。本研究中HBV-DNA阳性组中重度及重型组所占比例与轻度及肝硬化组差异无显著性，由此表明乙肝病毒的清除可能是CTL的穿孔素途径和其它的途径共同作用的结果，如CD95途径、细胞因子非细胞损伤机制等，说明乙肝病毒清除机制 的复杂性。
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13 刘映霞，胡国龄，何淑雅，等.慢性乙肝患者PBMC中HBV感染及其对T细胞亚群的影响.中国现代医学杂志，2002，12(8):70-73.
作者单位:434000湖北省荆州市第二人民医院
(收稿日期:2003-09-26)
(编辑 夫凡), http://www.100md.com(艾耀伟)