C肽对人脐静脉内皮细胞体外表达eNOS的影响
【摘要】 目的 探讨C肽对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)表达内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的影响。方法 将培养成功的HUVEC在不同浓度的C肽(0.1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml)下孵育48h，提取细胞总RNA，应用半定量逆转录聚合酶链反应(SQ-RT-PCR)法，检测eNOS表达的情况。结果 低浓度的C肽(1ng/ml)使eNOS的表达减弱(P<0.01);生理浓度的C肽(10ng/ml)和高浓度的C肽(100ng/ml)均可使eNOS的表达明显增强(P<0.01)。结论 HUVEC可以对C肽的刺激产生反应，说明它是C肽作用的靶细胞，这为体外研究C肽在糖尿病大血管病变中的作用创造了条件。
关键词 C肽 人脐静脉内皮细胞 内皮型一氧化氮合酶
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)11-0961-02
Effects of C-peptide on expression of eNOS in cultured
, 百拇医药
human umbilical vein endothelial cells
Meng Dong，Yu Demin，Chen Ying
Tianjin Medical University Metabolic Disease Hospital，Tianjin300070.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of C-peptide on expression of eNOS in cultured HUVECs.Methods Using semi-quantitative RT-PCR techniques，we measured the expression of eNOS mRNA in HUVECs incubated for48h at0，1，10，100ng/ml concentrations of C-peptide.Results The expression of eNOS mRNA at low concentration of C-peptide was lower than that of control group，the expressions of eNOS mRNAwere higher at physiˉological and higher concentration of C-peptide，but there was no difference between physiological and higher concenˉtration of C-peptide.Conclusion HUVECs are the perfect target cells of C-peptide study and may provide experiˉmental materials for study of C-peptide in vitro.
, 百拇医药
Key words C-peptide human umbilical vein endothelial cell(HUVEC) endothelial nitric oxide synthase(eNOS)
血管内皮细胞功能改变是糖尿病血管病变的始发事件 [1] ，如何改善糖尿病血管机能，成为许多学者研究的关键问题。近年来随着对C肽研究的不断深入，它所具有的生理作用已在人和动物实验中得到充分证实 [2] 。C肽是否能通过内皮型一氧化氮合酶(eNOS)途径对糖尿病血管病变产生影响，目前国内外还未见相关报道。本研究在成功建立人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell;HUVEC)体外培养的基础上，将传代培养的HUVEC分别在不同浓度的C肽中孵育48h，观察其eNOS表达情况，探讨C肽能否通过eNOS-NO途径对内皮细胞发生作用。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料
1.1.1 细胞分离和传代试剂 DMEM培养基(5.5mM葡萄糖)、青/链霉素(100×)、0.25%糜蛋白酶+1mM EDTA、10×PBS均为美国GIBCO公司产品，胎牛血清(FBS)为美国Hyˉclone公司产品，Ⅱ型胶原酶、DEPC、内皮细胞生长因子(ECGF)均为美国Sigma公司产品。
1.1.2 eNOS表达测定用试剂 TRIZOL总RNA分离试剂(美国Promega公司)，RT-PCR试剂盒(美国LIFE TECHˉNOLOGIES公司)，琼脂糖(上海生工公司)，PCR试剂盒(Preˉmix Taq)、125bp DNA Ladder Marker均为大连宝生物工程 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 人脐静脉内皮细胞的分离、传代培养 [3] 在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带。冲洗脐带至无血色液体流出。以0.1%的Ⅱ型胶原酶溶液，37℃水浴消化10min，收集消化细胞，移入培养皿中培养(37℃，5%CO 2 条件下)24h，然后洗去未贴壁细胞及杂质，加入细胞生长液(含有终浓度为200ng/ml的内皮细胞生长因子和终浓度为100μg/ml的肝素)，以后每隔3～4天换液一次。原代内皮细胞融合60%～80%后，加入0.25%胰蛋白酶+1mM EDTA溶液，500μl/培养皿，进行消化。收集、重悬细胞，反复吹打制成单细胞悬液，以血细胞计数板进行细胞计数，调整细胞浓度为2.0～5.0×10 5 /ml，以5.0×10 4 /cm 2的密度接种，继续培养。取3～4代细胞用于实验。传代细胞经倒置显微镜观察细胞的形态，Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测 [4] 鉴定为HUVEC。
, 百拇医药
1.2.2 实验分组 实验分为对照组(C0)、低于基础生理浓度组(C1)、正常生理浓度组(C10)和高于基础生理浓度组(C100)，C肽终浓度分别为0、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml。将生长良好的内皮细胞以2.5×10 5 /ml接种于6孔板，2ml/孔，待细胞形成单层近融合后，换以细胞维持液培养24h，然后加入实验用液刺激48h。每组设平行孔3孔。
1.2.3 eNOS表达测定 用TRIZOL总RNA分离试剂提取细胞RNA，用SQ-RT-PCR法 [5] 对eNOS表达进行检测(美国LIFE TECHNOLOGIES公司RT-PCR试剂盒进行逆转录，大连宝生物工程公司Premix Taq PCR试剂盒扩增DNA，以GAPDH为内参照，见表1)。eNOS表达产物电泳结果用紫外凝胶摄像分析仪(UVPGDS-8000)进行观察，拍照后分析反应结果。
表1 扩增基因的引物序列
, http://www.100md.com
1.2.4 统计学方法 以SPSS10.0软件进行统计学分析。组间的两两比较用SNK-q检验。所有数据均以ˉx±s表示，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
3组实验组及对照组eNOS表达产物电泳结果见图1，半定量分析结果见表2。
图1 4组HUVEC表达eNOS的电泳结果略
表2 不同浓度4组C肽影响HUVEC表达eNOS的结果比较略
3 讨论
近年来，一系列基础与临床研究都显示了C肽具有重要的生理功能 [2] 。但是C肽对靶细胞发挥作用的机制尚不清楚。有研究发现:内皮型eNOS介导了C肽的某些作用 [6] ，而eNOS是血管内皮细胞产生NO的主要限速因素。 另据报道 [7] :糖尿病患者大血管内皮eNOS表达及活性的异常，是导致糖尿病大血管病变的重要原因。
, 百拇医药
我们选择HUVEC为研究对象，是因为HUVEC在某些方面尚具有与动脉生物学特征相似的优点，而且与动物血管内皮细胞相比，可使实验条件和所获结果更符合人体情况。我们在实验中发现:低于生理浓度的C肽使eNOS的表达减弱。作为NO的主要限速酶，eNOS表达的减弱使NO产生减少，正常情况下，内皮细胞释放的NO具有重要的血管保护作用，这意味着低浓度的C肽削弱了NO的血管保护作用。在1型糖尿病患者中，血浆C肽水平的下降是否与1型糖尿病的血管损伤有关，还有待进一步证实。
作为一种生物活性物质，C肽具有与特异性受体结合的特点 [8] 。但有学者在C肽与细胞膜结合的研究中发现，HUVEC不与C肽结合，这意味着HUVEC表面没有C肽的受体，因而推测HUVEC对C肽的刺激没有反应。我们实验显示:C肽能够引起HUVEC表达eNOS的变化，说明HUVEC对C肽的刺激有反应，推测C肽的这种作用可能是通过非受体机制实现的。Schlesinger等的研究表明C-肽可能通过形成离子通道，改变细胞内的离子稳态发挥效应 [9] 。
, 百拇医药
本研究在成功建立HUVEC体外培养方法的基础上，证实了HUVEC可以对C肽的刺激产生反应，说明它是C肽作用的靶细胞，这为进一步研究C肽在糖尿病大血管病变中的作用创造了条件。
参考文献
1 Calles-Escandon J，Cipolla M.Diabetes and endothelial dysfunction:a clinical perspective.Endocr Rev，2001，22(1):36-52.
2 Wahren J.Role of C-peptide in human physiology.Am J Physiol Enˉdocrinol Metab，2000，278:759-768.
3 Lorenzi M，Cadliero E，Markey B，et al.Interation of human endothelial cells with elevated glucose concentrations and native and plycosylated low density lipoprotein.Diabetologia，1984，26:218.
, 百拇医药
4 Q R Yang，D Vanden Berghe.Effect of temperature on in vitro proliferaˉtive of human umbilical vein endothelial cells.Experientia，1995，51:126-132.
5 S Santagati，M Garnier，P Carlo，et al.Quantitation of low abundence mRNAs
in glial cells using different polymerase chain reaction(PCR-base methods.Brain Research Protocol，1997，217-223.
6 Lindon H Yong，Yasuhiko Ikeda，Rosario Scalia，et al.C-peptide exerts card
, http://www.100md.com
ioprotective effects in myocardial ischemia-reperfusion.Am J Physˉiol Heart Circ Physiol，2000，279:1453-1459.
7 Yaoxian Ding，Nosratola D Vaziri，Richard Coulson，et al.Effects of stimulated hyperglycemia，insulin，and glucagon on endothelial nitric oxˉide synthase expression.Am J Endocrinol Metab，2000，279:11-17.
8 T Kitamura，K Kimura，BD Jung，et al.Proinsulin C-peptide rapidly stimulates mitogen-activated protein kinases in Swiss3T3fibroblasts:requirement of protein kinase C，phosphoinostitide3-kinase and pertusˉsis toxin-sensitive G-protein.Biochem J，2001，355:123-129.
9 Schlesinger PH.Conductive channel properties of human C-peptide inˉcorporated into planar lipid bilayers.Diabetes，1998，47(1):29.
基金项目:天津医科大学基金资助项目(编号:2002KY28)
作者单位:300070天津医科大学代谢病医院
(收稿日期:2003-08-03)
(编辑 李年令), http://www.100md.com(孟东)
关键词 C肽 人脐静脉内皮细胞 内皮型一氧化氮合酶
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)11-0961-02
Effects of C-peptide on expression of eNOS in cultured
, 百拇医药
human umbilical vein endothelial cells
Meng Dong，Yu Demin，Chen Ying
Tianjin Medical University Metabolic Disease Hospital，Tianjin300070.
【Abstract】 Objective To investigate the effects of C-peptide on expression of eNOS in cultured HUVECs.Methods Using semi-quantitative RT-PCR techniques，we measured the expression of eNOS mRNA in HUVECs incubated for48h at0，1，10，100ng/ml concentrations of C-peptide.Results The expression of eNOS mRNA at low concentration of C-peptide was lower than that of control group，the expressions of eNOS mRNAwere higher at physiˉological and higher concentration of C-peptide，but there was no difference between physiological and higher concenˉtration of C-peptide.Conclusion HUVECs are the perfect target cells of C-peptide study and may provide experiˉmental materials for study of C-peptide in vitro.
, 百拇医药
Key words C-peptide human umbilical vein endothelial cell(HUVEC) endothelial nitric oxide synthase(eNOS)
血管内皮细胞功能改变是糖尿病血管病变的始发事件 [1] ，如何改善糖尿病血管机能，成为许多学者研究的关键问题。近年来随着对C肽研究的不断深入，它所具有的生理作用已在人和动物实验中得到充分证实 [2] 。C肽是否能通过内皮型一氧化氮合酶(eNOS)途径对糖尿病血管病变产生影响，目前国内外还未见相关报道。本研究在成功建立人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cell;HUVEC)体外培养的基础上，将传代培养的HUVEC分别在不同浓度的C肽中孵育48h，观察其eNOS表达情况，探讨C肽能否通过eNOS-NO途径对内皮细胞发生作用。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 材料
1.1.1 细胞分离和传代试剂 DMEM培养基(5.5mM葡萄糖)、青/链霉素(100×)、0.25%糜蛋白酶+1mM EDTA、10×PBS均为美国GIBCO公司产品，胎牛血清(FBS)为美国Hyˉclone公司产品，Ⅱ型胶原酶、DEPC、内皮细胞生长因子(ECGF)均为美国Sigma公司产品。
1.1.2 eNOS表达测定用试剂 TRIZOL总RNA分离试剂(美国Promega公司)，RT-PCR试剂盒(美国LIFE TECHˉNOLOGIES公司)，琼脂糖(上海生工公司)，PCR试剂盒(Preˉmix Taq)、125bp DNA Ladder Marker均为大连宝生物工程 公司产品。
1.2 方法
1.2.1 人脐静脉内皮细胞的分离、传代培养 [3] 在无菌条件下，于健康产妇分娩后立即取新生胎儿脐带。冲洗脐带至无血色液体流出。以0.1%的Ⅱ型胶原酶溶液，37℃水浴消化10min，收集消化细胞，移入培养皿中培养(37℃，5%CO 2 条件下)24h，然后洗去未贴壁细胞及杂质，加入细胞生长液(含有终浓度为200ng/ml的内皮细胞生长因子和终浓度为100μg/ml的肝素)，以后每隔3～4天换液一次。原代内皮细胞融合60%～80%后，加入0.25%胰蛋白酶+1mM EDTA溶液，500μl/培养皿，进行消化。收集、重悬细胞，反复吹打制成单细胞悬液，以血细胞计数板进行细胞计数，调整细胞浓度为2.0～5.0×10 5 /ml，以5.0×10 4 /cm 2的密度接种，继续培养。取3～4代细胞用于实验。传代细胞经倒置显微镜观察细胞的形态，Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测 [4] 鉴定为HUVEC。
, 百拇医药
1.2.2 实验分组 实验分为对照组(C0)、低于基础生理浓度组(C1)、正常生理浓度组(C10)和高于基础生理浓度组(C100)，C肽终浓度分别为0、1ng/ml、10ng/ml、100ng/ml。将生长良好的内皮细胞以2.5×10 5 /ml接种于6孔板，2ml/孔，待细胞形成单层近融合后，换以细胞维持液培养24h，然后加入实验用液刺激48h。每组设平行孔3孔。
1.2.3 eNOS表达测定 用TRIZOL总RNA分离试剂提取细胞RNA，用SQ-RT-PCR法 [5] 对eNOS表达进行检测(美国LIFE TECHNOLOGIES公司RT-PCR试剂盒进行逆转录，大连宝生物工程公司Premix Taq PCR试剂盒扩增DNA，以GAPDH为内参照，见表1)。eNOS表达产物电泳结果用紫外凝胶摄像分析仪(UVPGDS-8000)进行观察，拍照后分析反应结果。
表1 扩增基因的引物序列
, http://www.100md.com
1.2.4 统计学方法 以SPSS10.0软件进行统计学分析。组间的两两比较用SNK-q检验。所有数据均以ˉx±s表示，以P<0.05为差异有显著性。
2 结果
3组实验组及对照组eNOS表达产物电泳结果见图1，半定量分析结果见表2。
图1 4组HUVEC表达eNOS的电泳结果略
表2 不同浓度4组C肽影响HUVEC表达eNOS的结果比较略
3 讨论
近年来，一系列基础与临床研究都显示了C肽具有重要的生理功能 [2] 。但是C肽对靶细胞发挥作用的机制尚不清楚。有研究发现:内皮型eNOS介导了C肽的某些作用 [6] ，而eNOS是血管内皮细胞产生NO的主要限速因素。 另据报道 [7] :糖尿病患者大血管内皮eNOS表达及活性的异常，是导致糖尿病大血管病变的重要原因。
, 百拇医药
我们选择HUVEC为研究对象，是因为HUVEC在某些方面尚具有与动脉生物学特征相似的优点，而且与动物血管内皮细胞相比，可使实验条件和所获结果更符合人体情况。我们在实验中发现:低于生理浓度的C肽使eNOS的表达减弱。作为NO的主要限速酶，eNOS表达的减弱使NO产生减少，正常情况下，内皮细胞释放的NO具有重要的血管保护作用，这意味着低浓度的C肽削弱了NO的血管保护作用。在1型糖尿病患者中，血浆C肽水平的下降是否与1型糖尿病的血管损伤有关，还有待进一步证实。
作为一种生物活性物质，C肽具有与特异性受体结合的特点 [8] 。但有学者在C肽与细胞膜结合的研究中发现，HUVEC不与C肽结合，这意味着HUVEC表面没有C肽的受体，因而推测HUVEC对C肽的刺激没有反应。我们实验显示:C肽能够引起HUVEC表达eNOS的变化，说明HUVEC对C肽的刺激有反应，推测C肽的这种作用可能是通过非受体机制实现的。Schlesinger等的研究表明C-肽可能通过形成离子通道，改变细胞内的离子稳态发挥效应 [9] 。
, 百拇医药
本研究在成功建立HUVEC体外培养方法的基础上，证实了HUVEC可以对C肽的刺激产生反应，说明它是C肽作用的靶细胞，这为进一步研究C肽在糖尿病大血管病变中的作用创造了条件。
参考文献
1 Calles-Escandon J，Cipolla M.Diabetes and endothelial dysfunction:a clinical perspective.Endocr Rev，2001，22(1):36-52.
2 Wahren J.Role of C-peptide in human physiology.Am J Physiol Enˉdocrinol Metab，2000，278:759-768.
3 Lorenzi M，Cadliero E，Markey B，et al.Interation of human endothelial cells with elevated glucose concentrations and native and plycosylated low density lipoprotein.Diabetologia，1984，26:218.
, 百拇医药
4 Q R Yang，D Vanden Berghe.Effect of temperature on in vitro proliferaˉtive of human umbilical vein endothelial cells.Experientia，1995，51:126-132.
5 S Santagati，M Garnier，P Carlo，et al.Quantitation of low abundence mRNAs
in glial cells using different polymerase chain reaction(PCR-base methods.Brain Research Protocol，1997，217-223.
6 Lindon H Yong，Yasuhiko Ikeda，Rosario Scalia，et al.C-peptide exerts card
, http://www.100md.com
ioprotective effects in myocardial ischemia-reperfusion.Am J Physˉiol Heart Circ Physiol，2000，279:1453-1459.
7 Yaoxian Ding，Nosratola D Vaziri，Richard Coulson，et al.Effects of stimulated hyperglycemia，insulin，and glucagon on endothelial nitric oxˉide synthase expression.Am J Endocrinol Metab，2000，279:11-17.
8 T Kitamura，K Kimura，BD Jung，et al.Proinsulin C-peptide rapidly stimulates mitogen-activated protein kinases in Swiss3T3fibroblasts:requirement of protein kinase C，phosphoinostitide3-kinase and pertusˉsis toxin-sensitive G-protein.Biochem J，2001，355:123-129.
9 Schlesinger PH.Conductive channel properties of human C-peptide inˉcorporated into planar lipid bilayers.Diabetes，1998，47(1):29.
基金项目:天津医科大学基金资助项目(编号:2002KY28)
作者单位:300070天津医科大学代谢病医院
(收稿日期:2003-08-03)
(编辑 李年令), http://www.100md.com(孟东)