酶转化红细胞的研究进展
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)10-0891-03
安全输血的前提是同型相输，因此输血前的血型鉴定十分重要，但是，在战争、灾难以及突发事件等特殊情形下，如果按照常规方法先配血再输血，势必会贻误伤者的输血救治时机，因此，如何迅速、有效地实施输血救治，是挽救生命的关键。O型血是通用血，可以输给任何血型的伤员，但在随机人群中，O型血仅占1/3，无法满足突然的大量需求，最理想的解决办法就是通过生物医学的方法，将A、B和AB型血转化成通用的O型血，大量储存以备不时之需，这在国民经济建设和国防建设上具有重要意义。
目前国内外对于血型转变的研究主要有三条技术途径:一是“剃光头”，将红细胞表面的糖链统统去除;二是“理平头”，将A、B型红细胞表面糖链上比O型糖链多余的糖分子切掉，使得A、B、O糖链结构变为一致;三是“戴帽子”，用适当的物质将红细胞包裹起来，避免抗原接触造成的免疫排斥反应 [1] 。本文就“剃平头”，即酶转化红细胞(Enzyˉmatically Converted Group O Red Blood Cells，ECORBC)的研究概况进行综述。
, 百拇医药
1 红细胞表面的ABO抗原分子结构
人类ABO血型是由红细胞表面的糖链决定的，不同红细胞表面的糖链结构不同，分别由A、B、H基因决定。ABO 血型基因位于第9号染色体(9q34.1-q34.2)，基因编码区有7个外显子，其中最大的两个外显子Ⅵ和Ⅷ构成全部编码区的77%。A和B型cDNA有7个核苷酸不同，导致糖基转移酶多肽链上4个氨基酸不同，其中第266位和268位的2个氨基酸更能确定A或B的特异性;O型基因的cDNA与A型相似，只是在261位碱基上有一个碱基(G)缺失，引起读框移位(a shaft in the reading frame)，提前形成终止码，肽链合成在117位氨基酸终止，产生一条短肽链。
A、B、H血型基因直接编码特异性的糖基转移酶，进而由这些酶合成寡糖性质的ABO抗原。H基因编码岩藻糖苷转移酶，将一个岩藻糖分子(L-fucose，Fuc)连接到半乳糖(D-Galactose，Gal)上，形成H结构(Fuc-Gal)，即O型血抗原表位;A基因编码N-乙酰半乳糖胺转移酶，将N-乙酰半乳糖胺连接到H结构的外端(A1:Fuc-Gal-GalNAc)或转移到半乳糖上，再与H结构连接(A2:Fuc-Gal-GalNAc-Gal-GalNAc)，形成A型血抗原表位;B基因编码半乳糖苷酶，将半乳糖连接到H结构的最外端(Fuc-Gal-Gal)，形成B型血抗原表位(图1) [2] 。
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O基因通常被认为是一个沉默基因。
图1 A、B、O红细胞表面糖链结构简图略
红细胞表面的抗原结构特点，为血型转变研究提供了思路:只要将A、B型红细胞表面糖链上与O型红细胞糖链不同的部分酶解去除，就可以实现血型A、B、AB→O的转变，制备“通用型”血。
2 血型转变的工具酶
研究证明，α-半乳糖苷酶(α-Gal)可作用于糖链的两个半乳糖之间的1，3糖苷键，将最外端的半乳糖切除，完成B→O血型的改造;而α-N-乙酰半乳糖胺酶(α-GalNAc)则作用于半乳糖和N-乙酰半乳糖胺之间的糖苷键，将最外端的N-乙酰半乳糖胺切除，完成A→O血型的改造。这两种酶是目前国内外酶转化红细胞的工具酶。但由于A抗原结构比较复杂，一般认为有两类A型抗原，即A1与A2，其中A2抗原的末端比A1又多了一个N-乙酰半乳糖残基，不易被水解下来，加上自然界中的α-N-乙酰半乳糖胺酶要比α-半乳糖苷酶少得多，因此目前国内外研究较多的主要是B→O的血型转变 [3～5] 。
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用于B→O血型转变的α-半乳糖苷酶是一种专一性很强的外切糖苷酶类，并兼有糖基转移酶的活性。α-半乳糖苷酶属于糖蛋白，是广泛存在于人、动物、植物、真菌乃至原核生物体内的一种水解酶，但不同来源的α-半乳糖苷酶的理化特性相差很远，分离纯化方法各异，唯有能切断α-(1，3)连接的糖苷链的α-半乳糖苷酶，才能将B型血物质转化成H型物质，实现B型血向O型血的转变 [6] 。Harpaz [7] 早在1975年就从咖啡豆、大豆中制备了α-半乳糖苷酶，可以去除红细胞表面的B抗原，但由于找不到最适反应条件，引起红细胞的破坏，不利于临床输血;Hobbs等 [8] 从豆中提取半乳糖苷酶，并确立了最佳反应条件，但发现在不同的缓冲液中，其酶活性相差很远。1988年，Bakunˉina等 [9] 从海洋假互生单胞菌属(Pseudoalteromonas)中分离出的α-半乳糖苷酶，在20℃～24℃，pH值6.6～7.7条件下性质稳定，其活性较咖啡豆α-半乳糖苷酶高4倍。
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3 基因工程法制备α-半乳糖苷酶
一般情况下，从50磅桑托斯咖啡豆中仅能提取出约1.75g的α-半乳糖苷酶。而血型转变所用酶量相当大，每一单位浓缩红细胞大约需1.5g纯化的咖啡豆α-半乳糖苷酶，大大制约了血型转化技术的发展，因此利用基因工程技术制备高效、高纯度、高特异性的工具酶是科学家们感兴趣的课题。1986年，Bishop等 [10] 从λgt11表达文库中分离出人α-半乳糖苷酶cDNA(λ-AG18)，并对其核苷酸序列进行测定，发现其含1226bp阅读框架，编码398个氨基酸。1992年，DenHerder等 [11] 从黑曲霉培养液中提取出具有α-半乳糖苷酶活性的酶，此酶蛋白的N端序列与从其他种属中提取的α-半乳糖苷酶具有同源序列。同年，Loannou等[12] 将人α-半乳糖苷酶基因进行克隆，并在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达。1994年，Alex Zhu等 [13] 用PCR及cDNA末端快速扩增法(rapid Amplification of cDNA ends，RACF)从咖啡豆中克隆了α-半乳糖苷酶全长cDNA，并进行序列分析，1.4kb的cDNA含有单一开放阅读框架，编码378个氨基酸，其氨基酸编码序列与天然咖啡豆提取的α-半乳糖苷酶完全一致。次年，Zhu[14] 把从咖啡豆中克隆得到的α-半乳糖苷酶cDNA克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)表达载体pPIc9的EcoRI位点上，筛选出高表达的转化子，发酵、纯化后得到咖啡豆的α-半乳糖苷酶，纯化产物在SDS-PAGE电泳中呈现4.1kD的条带，N端测序证明确为α-半乳糖苷酶。我国军事医学科学院输血研究所章阳培 [15，16] 等利用中国海南兴隆咖啡豆，参照Zhu等报道的序列，用反转录PCR(RT-PCR)扩增编码区，得到1.1kb的片段。多个克隆的重复测序证实，中国海南兴隆咖啡豆的α-半乳糖苷酶cDNA序列与桑托斯咖啡豆相比，在798bp处的碱基由T→C，但编码的氨基酸相同(Leu)，在912bp处的改变为G→A，编码的氨基酸由Ala变为Thr，其余序列一 致。将α-半乳糖苷酶重组质粒以电穿孔技术导入毕赤酵母中，经甲醇诱导表达并筛选高表达活性的表达子，经PharmaciaAK-TA-FPLC层析系统纯化，获得了可用于B→O血型转化的α-半乳糖苷酶。
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4 B→O血型转变的体内、体外实验
美国纽约血液中心的J Glodstein等 [17～19] 于上世纪九十年代初期率先开展了应用α-半乳糖苷酶进行人血红细胞B→O的转变研究，他们用生物化学的方法从桑托斯咖啡豆中提取出α-半乳糖苷酶，首先集中进行酶转化红细胞的体外实验，在pH为5.5～5.6的条件下，从全血中分离红细胞，加入一定量的α-半乳糖苷酶进行酶解，酶解后的红细胞称为酶转化红细胞(ECORBC)。ECORBC分别与抗-B与抗-H试剂反应的结果表明，经α-半乳糖苷酶酶解后的B型红细胞的抗原活性丧失，呈H抗原活性，说明血型已经从B型转化为O型。实验还进一步证明，在血型转化的过程中，不到1%的红细胞被裂解，红细胞渗透脆性、乙酰胆碱酶、胆固醇、高铁血红蛋白、ATP、2，3-DPG及P50等均与正常红细胞差异无显著性。α-半乳糖苷酶酶解仅引起B抗原与PI抗原的丢失，而对于Rh、MN、P1、Kell、Duffy、Kidd等其它血型系统的抗原活性无影响。在体外实验的基础上，Goldstein等选用长臂猿作为动物实验模型，以α-半乳糖苷酶处理长臂猿红细胞，然后进行回输，重复3次，以 51 Cr标记红细胞并监测其成活率，发现与正常红细胞相同，也没有出现新的免疫原性证明。Lenny [20，21] 等利用基因重组的咖啡豆α-半乳糖苷酶各转化三个单位即600ml ECORBC，分别输给3个A型及3个O型志愿者，其中O型受者在首次输血数月后再次输注酶转化红细胞，其临床观察及血清学检测无任何急性、亚急性溶血发生，抗-B滴度亦无显著升高，ECORBC在受者血循环中保持正常存活率。Vosnidon [22] 1998年用他们研制的重组α-半乳糖苷酶各转化4位供者的B型红细胞，对ECORBC的结构功能指标进行检测并与正常红细胞比较，结果无显著差异，证明了经α-半乳糖苷酶酶解的B型红细胞在受试者体内是安全的。目前，J Glodstein正在组织Ⅱ期临床实验，观察ECORBC治疗镰刀型贫血和地中海贫血的有效性。
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参考文献
1 章阳培，季守军，杨军，等.血型转换.中国实用血液学杂志，1998，6(2):91-97.
2 Fricker J.Conversion of red blood cells to group O.Lancet，1996，347:680.
3 李勇，杨贵贞.人类红细胞血型学实用理论与实验技术.北京:中国科学技术出版社，1999，1133-1147.
4 Lenny L L，Goldstien J.The production of group O cells.Biotechnology of Blood，1991，19:75-100.
5 Clausen H，Levery SB，Nudelman E，te al.repetitive A epitope definedby blood group A1specific monoclonal antibody TH-1:Chemical basis of qualitative A1 and
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A2 distinction.Proc Natl Acad Sci USA，1985，82:1199.
6 高新.α-半乳糖苷酶及其在输血等方面的应用.中国实验血液学杂志，2000，8(3):236-238.
7 Harpaz N，Flowers HM，Sharon N.Studies on B-antigenic sites of huˉman erythrocytes by use of coffee beanα-galactosidase.Arch Biochen Biophys，1975，70:
676.
8 Hobbs L，Mitra M，Philips R，et al.The activity of a blood type B specifˉic exoglycosidase from glycine max.Clinical Chimica Acta，1996，247:7.
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9 Bakunina IY，Sova VV，Nedashkovskaya OI，et al.Alpha-galactosidase of the marine bacterium Pseudoalteromonas sp KMM701.Biochem Mosc，1998，63(10):1209.
10 Bishop DF，Calhoun DH，Bernstein HS，et al.Humanα-galactosidase A:nucleotide sequence of a cDNA clone encoding the metureenzyme.Proc Natl Acad Sci USA，1986，83:4859.
11 Den herder IF，Rosell AM，Van Zuilen CMV，et al.Cloning and expresˉsion of a member of the Aspergillus niger gene family encodingα-galactosidase.Mol GenGenet，1992，233:404.
, 百拇医药
12 Ionannou YA，Bishop DF，Desninck RJ.Overexpression of humanα-galactosidase A results in its intracellular aggregation，crystallization in lysosomes，and
selective secretion.J Cell Bio，1992，119:1137.
13 Zhu A，Goldstein J.Cloning and functional expression of a cDNA enˉcoding
coffee beanα-galactosidase.Gene，1994，140:227-231.
14 Zhu A，Monahan C，Zhang Z.High-level expression and purification of coffee beanα-galactosidase produced in the yeast Pichia Pastoris.Arch Biochen Biophys，1995，324:65-70.
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15 章阳培，杨军，季守平，等.血型转变.现代科学仪器，2000，1:8-11.
16 宫锋，季守平，杨军，等.海南咖啡豆α-半乳糖苷酶cDNA克隆与序列测定.军事医学科学院院刊，1999，23(3):217-219.
17 Lenny L L，Goldstein J.Biotechnology of Blood.Boston:Butterworth-Hemeinann，1991，76-94.
18 Lenney L L，Hurst R，Goldstein J.Single-unit transfusions of RBC enzymatically converted from group B to group O and A to O normal volunteers.Blood，1991，77(6):1383-1388.
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19 Lenny L L，Hurst R，Goldstein J.Galbraith RA.Tansfusion to group O subjects of2units of red cell enzymatically converted from group B to A.Transfusion，1994，34(3):209-214.
20 Lenny L L，Harst R，Goldstein J，et al.Mutiple-unit nd second transˉfusion of red cells enzymtically converted from group B to group O reˉport on the end of phase I trial.Transfusion，1995，35(11):899.
21 Zhu A，Leng L，Monahan C.Charactrization of recombinant alpha-galactosidase for use in seroconversion from blood group B to O of huˉman erythrocytes.Arch Biochem Biophys，1996，327:324-329.
22 Vosnidou NC，Johnson SA，Mitra MM，et al.Seroconversion of type B to erythrocytes using recombinant Glycine max alpha-D-galactosidase from pinto bean.Biochem Mol Biol Int，1998，46(1):175.
作者单位:510515广州第一军医大学南方医院输血科
(收稿日期:2003-09-03)
(编辑 秋实), 百拇医药(曹琼(综述))
安全输血的前提是同型相输，因此输血前的血型鉴定十分重要，但是，在战争、灾难以及突发事件等特殊情形下，如果按照常规方法先配血再输血，势必会贻误伤者的输血救治时机，因此，如何迅速、有效地实施输血救治，是挽救生命的关键。O型血是通用血，可以输给任何血型的伤员，但在随机人群中，O型血仅占1/3，无法满足突然的大量需求，最理想的解决办法就是通过生物医学的方法，将A、B和AB型血转化成通用的O型血，大量储存以备不时之需，这在国民经济建设和国防建设上具有重要意义。
目前国内外对于血型转变的研究主要有三条技术途径:一是“剃光头”，将红细胞表面的糖链统统去除;二是“理平头”，将A、B型红细胞表面糖链上比O型糖链多余的糖分子切掉，使得A、B、O糖链结构变为一致;三是“戴帽子”，用适当的物质将红细胞包裹起来，避免抗原接触造成的免疫排斥反应 [1] 。本文就“剃平头”，即酶转化红细胞(Enzyˉmatically Converted Group O Red Blood Cells，ECORBC)的研究概况进行综述。
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1 红细胞表面的ABO抗原分子结构
人类ABO血型是由红细胞表面的糖链决定的，不同红细胞表面的糖链结构不同，分别由A、B、H基因决定。ABO 血型基因位于第9号染色体(9q34.1-q34.2)，基因编码区有7个外显子，其中最大的两个外显子Ⅵ和Ⅷ构成全部编码区的77%。A和B型cDNA有7个核苷酸不同，导致糖基转移酶多肽链上4个氨基酸不同，其中第266位和268位的2个氨基酸更能确定A或B的特异性;O型基因的cDNA与A型相似，只是在261位碱基上有一个碱基(G)缺失，引起读框移位(a shaft in the reading frame)，提前形成终止码，肽链合成在117位氨基酸终止，产生一条短肽链。
A、B、H血型基因直接编码特异性的糖基转移酶，进而由这些酶合成寡糖性质的ABO抗原。H基因编码岩藻糖苷转移酶，将一个岩藻糖分子(L-fucose，Fuc)连接到半乳糖(D-Galactose，Gal)上，形成H结构(Fuc-Gal)，即O型血抗原表位;A基因编码N-乙酰半乳糖胺转移酶，将N-乙酰半乳糖胺连接到H结构的外端(A1:Fuc-Gal-GalNAc)或转移到半乳糖上，再与H结构连接(A2:Fuc-Gal-GalNAc-Gal-GalNAc)，形成A型血抗原表位;B基因编码半乳糖苷酶，将半乳糖连接到H结构的最外端(Fuc-Gal-Gal)，形成B型血抗原表位(图1) [2] 。
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O基因通常被认为是一个沉默基因。
图1 A、B、O红细胞表面糖链结构简图略
红细胞表面的抗原结构特点，为血型转变研究提供了思路:只要将A、B型红细胞表面糖链上与O型红细胞糖链不同的部分酶解去除，就可以实现血型A、B、AB→O的转变，制备“通用型”血。
2 血型转变的工具酶
研究证明，α-半乳糖苷酶(α-Gal)可作用于糖链的两个半乳糖之间的1，3糖苷键，将最外端的半乳糖切除，完成B→O血型的改造;而α-N-乙酰半乳糖胺酶(α-GalNAc)则作用于半乳糖和N-乙酰半乳糖胺之间的糖苷键，将最外端的N-乙酰半乳糖胺切除，完成A→O血型的改造。这两种酶是目前国内外酶转化红细胞的工具酶。但由于A抗原结构比较复杂，一般认为有两类A型抗原，即A1与A2，其中A2抗原的末端比A1又多了一个N-乙酰半乳糖残基，不易被水解下来，加上自然界中的α-N-乙酰半乳糖胺酶要比α-半乳糖苷酶少得多，因此目前国内外研究较多的主要是B→O的血型转变 [3～5] 。
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用于B→O血型转变的α-半乳糖苷酶是一种专一性很强的外切糖苷酶类，并兼有糖基转移酶的活性。α-半乳糖苷酶属于糖蛋白，是广泛存在于人、动物、植物、真菌乃至原核生物体内的一种水解酶，但不同来源的α-半乳糖苷酶的理化特性相差很远，分离纯化方法各异，唯有能切断α-(1，3)连接的糖苷链的α-半乳糖苷酶，才能将B型血物质转化成H型物质，实现B型血向O型血的转变 [6] 。Harpaz [7] 早在1975年就从咖啡豆、大豆中制备了α-半乳糖苷酶，可以去除红细胞表面的B抗原，但由于找不到最适反应条件，引起红细胞的破坏，不利于临床输血;Hobbs等 [8] 从豆中提取半乳糖苷酶，并确立了最佳反应条件，但发现在不同的缓冲液中，其酶活性相差很远。1988年，Bakunˉina等 [9] 从海洋假互生单胞菌属(Pseudoalteromonas)中分离出的α-半乳糖苷酶，在20℃～24℃，pH值6.6～7.7条件下性质稳定，其活性较咖啡豆α-半乳糖苷酶高4倍。
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3 基因工程法制备α-半乳糖苷酶
一般情况下，从50磅桑托斯咖啡豆中仅能提取出约1.75g的α-半乳糖苷酶。而血型转变所用酶量相当大，每一单位浓缩红细胞大约需1.5g纯化的咖啡豆α-半乳糖苷酶，大大制约了血型转化技术的发展，因此利用基因工程技术制备高效、高纯度、高特异性的工具酶是科学家们感兴趣的课题。1986年，Bishop等 [10] 从λgt11表达文库中分离出人α-半乳糖苷酶cDNA(λ-AG18)，并对其核苷酸序列进行测定，发现其含1226bp阅读框架，编码398个氨基酸。1992年，DenHerder等 [11] 从黑曲霉培养液中提取出具有α-半乳糖苷酶活性的酶，此酶蛋白的N端序列与从其他种属中提取的α-半乳糖苷酶具有同源序列。同年，Loannou等[12] 将人α-半乳糖苷酶基因进行克隆，并在中华仓鼠卵巢细胞(CHO)中表达。1994年，Alex Zhu等 [13] 用PCR及cDNA末端快速扩增法(rapid Amplification of cDNA ends，RACF)从咖啡豆中克隆了α-半乳糖苷酶全长cDNA，并进行序列分析，1.4kb的cDNA含有单一开放阅读框架，编码378个氨基酸，其氨基酸编码序列与天然咖啡豆提取的α-半乳糖苷酶完全一致。次年，Zhu[14] 把从咖啡豆中克隆得到的α-半乳糖苷酶cDNA克隆到巴斯德毕赤酵母(Pichia Pastoris)表达载体pPIc9的EcoRI位点上，筛选出高表达的转化子，发酵、纯化后得到咖啡豆的α-半乳糖苷酶，纯化产物在SDS-PAGE电泳中呈现4.1kD的条带，N端测序证明确为α-半乳糖苷酶。我国军事医学科学院输血研究所章阳培 [15，16] 等利用中国海南兴隆咖啡豆，参照Zhu等报道的序列，用反转录PCR(RT-PCR)扩增编码区，得到1.1kb的片段。多个克隆的重复测序证实，中国海南兴隆咖啡豆的α-半乳糖苷酶cDNA序列与桑托斯咖啡豆相比，在798bp处的碱基由T→C，但编码的氨基酸相同(Leu)，在912bp处的改变为G→A，编码的氨基酸由Ala变为Thr，其余序列一 致。将α-半乳糖苷酶重组质粒以电穿孔技术导入毕赤酵母中，经甲醇诱导表达并筛选高表达活性的表达子，经PharmaciaAK-TA-FPLC层析系统纯化，获得了可用于B→O血型转化的α-半乳糖苷酶。
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4 B→O血型转变的体内、体外实验
美国纽约血液中心的J Glodstein等 [17～19] 于上世纪九十年代初期率先开展了应用α-半乳糖苷酶进行人血红细胞B→O的转变研究，他们用生物化学的方法从桑托斯咖啡豆中提取出α-半乳糖苷酶，首先集中进行酶转化红细胞的体外实验，在pH为5.5～5.6的条件下，从全血中分离红细胞，加入一定量的α-半乳糖苷酶进行酶解，酶解后的红细胞称为酶转化红细胞(ECORBC)。ECORBC分别与抗-B与抗-H试剂反应的结果表明，经α-半乳糖苷酶酶解后的B型红细胞的抗原活性丧失，呈H抗原活性，说明血型已经从B型转化为O型。实验还进一步证明，在血型转化的过程中，不到1%的红细胞被裂解，红细胞渗透脆性、乙酰胆碱酶、胆固醇、高铁血红蛋白、ATP、2，3-DPG及P50等均与正常红细胞差异无显著性。α-半乳糖苷酶酶解仅引起B抗原与PI抗原的丢失，而对于Rh、MN、P1、Kell、Duffy、Kidd等其它血型系统的抗原活性无影响。在体外实验的基础上，Goldstein等选用长臂猿作为动物实验模型，以α-半乳糖苷酶处理长臂猿红细胞，然后进行回输，重复3次，以 51 Cr标记红细胞并监测其成活率，发现与正常红细胞相同，也没有出现新的免疫原性证明。Lenny [20，21] 等利用基因重组的咖啡豆α-半乳糖苷酶各转化三个单位即600ml ECORBC，分别输给3个A型及3个O型志愿者，其中O型受者在首次输血数月后再次输注酶转化红细胞，其临床观察及血清学检测无任何急性、亚急性溶血发生，抗-B滴度亦无显著升高，ECORBC在受者血循环中保持正常存活率。Vosnidon [22] 1998年用他们研制的重组α-半乳糖苷酶各转化4位供者的B型红细胞，对ECORBC的结构功能指标进行检测并与正常红细胞比较，结果无显著差异，证明了经α-半乳糖苷酶酶解的B型红细胞在受试者体内是安全的。目前，J Glodstein正在组织Ⅱ期临床实验，观察ECORBC治疗镰刀型贫血和地中海贫血的有效性。
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17 Lenny L L，Goldstein J.Biotechnology of Blood.Boston:Butterworth-Hemeinann，1991，76-94.
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作者单位:510515广州第一军医大学南方医院输血科
(收稿日期:2003-09-03)
(编辑 秋实), 百拇医药(曹琼(综述))