5-Fu纳米胶囊的制备及兔体内释放度的研究
【摘要】 目的 探讨以两亲嵌段共聚物聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯(PEG-PBLG)为载体的5-氟尿嘧啶(5-Fu)核壳型纳米胶囊的制备、形态特征及体内释放特性。方法 以ω-NH 2-PEG为引发剂，在苯-二氧六环的混合溶剂中，与PBLG聚合形成PEG-PBLG聚合物;透析法制备5-Fu胶囊;透射电镜、扫描电镜观察形态;紫外分光光度法测定包封率;兔体内试验考察5-Fu纳米胶囊在体内释放特性。结果 PEG-PBLG包裹的5-Fu纳米胶囊呈圆形或椭圆形，平均粒径约为180～250nm，中间药库区大小约为200nm，周围亲水区厚度约为30nm，载药量为30.1%。5-Fu的PEG-PBLG纳米胶囊进入体内后，1h产生突释，平稳浓度可维持至48h。结论 PEG-PBLG可作为5-Fu的纳米胶囊新型的药物转运系统，具有良好的应用前景。
关键词 5-Fu 纳米胶囊 聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)11-0963-02
, http://www.100md.com
Preparation and characterization of5-Fluorouracil
coated PEG-PBLG copolymer micelles
Zhan Jing，Xu Kaifeng，Liao Hai，et al.
Medicine Department，Tumor Hospital，Zhongshan University，Guangdong510060.
【Abstract】 Objective To investigate the preparation technology of5-Fluorouracil(5-Fu)loaded core-shell type nanoparticles which were made by the biodegradable amphiphlic poly(ethylene glycol)-poly(γ-benzyle-L-glutamate)(PEG-PBLG)，and its shape and its releasing characteristics in vivo.Methods In Benzyle-Dioxˉane solution，ω-NH 2 -PEG as solicitation，was polymerized with PBLG for ming into PEG-PBLG.The micelles were prepared by the diafiltration method.Its morphology was observed by transmission electron microscope and scan elecˉtron microscope.Encapsulating efficiency of5-Fu was determined by ultraviolet spectrophoto assay.The5-Fu reˉleasing from micelles was investigated by rabbit experimentation in vivo.Results 5-Fu loaded PEG-PBLG copolyˉmer micelles is round or ellipse conformation.The mean diameters of the micelles were from180～250nm;the size of drug storeroom is about200nm and the thickness of hydrophilic layer is about30nm.The entrapment efficiencies is30.1%.After5-Fluorouracil coated PEG-PBLG copolymer micelles was injected into rabbits，5-Fu release abruptly at1hour and maintain stabilization concentration till48hour.Conclusion The nano-micelles of PEG-PBLG copolymer with core-shell structure can be used as a new sustained and controlled release systems for5-Fu，and has a good foreground.
, http://www.100md.com
Key words 5-Fluorouracil core-shell type nano-micelles poly(ethylene glycol)-poly(r-benzyle-L-glutamate)
5-Fu为抗代谢类的抗癌药，是多种肿瘤如头颈部肿瘤、胃肠道肿瘤、乳腺癌等的一线治疗药物，但其在体内代谢快，半衰期短仅为5～10min，因此常常用大剂量、长时间给药来达到5-Fu在体内的有效浓度及其维持时间。开发新型的缓释5-Fu制剂将可能提高5-Fu的疗效、降低毒性。聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯(PEG-PBLG)纳米聚合物胶囊是亲水和疏水链节组成的两亲嵌段共聚物，在水中可自组装形成纳米级大小的核壳型胶囊，核为疏水段形成的可包埋药物，而壳为亲水段形成的可掩蔽内壳，也能减少肝脏对药物的代谢，提高药物溶解度 [1～3] 。在本研究中，我们合成了PEG-PBLG两亲嵌段共聚物，制备了5-Fu的纳米 胶囊，并探讨其在体内的释放特性。
, http://www.100md.com 1 材料与方法
1.1 仪器与试药 DRX-400MHz核磁共振波谱仪(德国Bucker)，CM10透射电子显微镜(荷兰Philips);640UV双光束分光光度计(Beckman)，HITACH-600型扫描电子显微镜(日立)，HP1100高效液相色谱仪(美国Agilient公司)。
单甲氧端基聚乙二醇(MR=5000，Sigma)，5-Fu(Sigˉma)，L-谷氨酸(上海生化试剂厂)，苯甲醇(分析纯)，N，N-二甲基甲酰胺(分析纯)，三光气(江苏常德试剂公司)，透析袋(截留分子量3500～5000Spectrum Medical Industries，USA)，聚合反应所用的试剂均经严格无水处理。
1.2 实验方法 (1)PEG-PBLG两亲嵌段共聚物的合成:甲氧基聚乙二醇MEO-PEG在CH 2 C1 2 中与一倍过量的对甲苯磺酰氯溶液发生置换反应生成MEO-PEG-TS，再与浓氨水在120℃下密闭反应7h，生成MEO-PEG-NH 2 。(2)L-谷氨酸γ苄酯-N-羧酸(BLG-NCA)的合成:将L-谷氨酸与苯甲醇，在60%浓硫酸催化下酯化得谷氨酸苄酯(BLG)，与三光气在装有四氢呋喃溶剂密闭容皿中生成谷氨酸苄酯羧酸(BLG-NCA)。(3)PEG-PBLG嵌段共聚物的醇合成[4]:BLG-NCA单体4g溶解于80ml苯-二氧六环混合溶剂中(4∶1(v/v))，以MEO-PEG-NH2 为引发剂(摩尔比50/1)，室温反应72h，无水乙醇沉淀，干燥得PEG-PBLG共聚物，以共聚物摩尔比计算分子量。(4)PEG-PBLG包裹5-Fu纳米胶囊的制备:精密称取20mgPEG-PBLG，20mg5-Fu于10ml灭菌试管中，加入10ml N，N-二甲基甲酰胺，60℃温浴5min，溶解后置透析袋中透析，于2h、5h、8h和12h分别替换蒸馏水，24h后将透析袋中的液体沿0.45mm滤膜过滤，5-Fu纳米胶囊置4℃保存。(5)动物实验方法:取兔6只，实验前禁食12h，分为A、B两组，A组给予5-Fu纯品静注，B组给予5-Fu纳米胶囊，剂量均为30mg/kg(按5-Fu重量计)。在左耳静注给药后的0、5、15、30min、1、2、4、8、12、24、36、48h于右耳静脉取血1ml置干燥管中，2000rpm离心10min，-20℃保存待测。(6)药物浓度测定方法:取0.5ml血浆，加50ml氯仿搅拌3min，12000rpm离心10min，取上清液置含2g硫酸胺试管中，加入5ml乙酸乙酯:异丙醇(85∶15)混合液搅拌5min，2000rpm离心，上清液吹干，加入400μl流动相(0.01M，pH3.0磷酸盐缓冲液)经C 18 (300×4.6mm)色谱柱分离，在269nm，(流速1ml/min)测定，将样品的峰面积代入5-Fu标准曲线计算浓度，描绘浓度-时间曲线。
, 百拇医药
2 结果
2.1 PEG-PBLG共聚物的特性 PEG-PBLG的 1 H-NMR(CDC1 3 )δ3.65(乙氧基4H)峰，δ7.24(苯环5H)，δ2.30(主链β位2H)，而PBLG的 1 H-NMR(CDCl 3 )图谱无δ3.65(乙氧基4H)峰，后者是聚谷氧苄酯中-CH 2 -CH 2 -的特征峰，从而证实了PEG-PBLG共聚物的形成。
2.2 PEG-PBLG的5-Fu胶囊的形态 TEM观察聚化物形态:胶囊呈球形或类球形，边缘模糊，中间没被磷钼酸染色的白色区域为胶囊疏水性同模糊且被染色的亲水区域，SEM观察共聚物:如图1，胶囊呈球形或类球形，中部为截药体区，大小约为200nm，周围亲水区厚约为30nm。
2.3 5-Fu纳米胶囊体内实验结果 5-Fu保留时间为5.80min，兔血浆回收率56%～64%，标准曲线Y=3.47+0.24X，(r=0.9998)，最低检测限5μg/L。5-Fu注射剂，5-Fu纳米胶囊的药-时曲线如图2和图3，5-Fu进入体内后，迅速代谢，4h后基本已从体内消除，而5-Fu纳米胶
, 百拇医药
进入兔体内后，缓慢释放，1h时出现一个达1457.5μg/L的突释浓度，进而维持约80μg/L浓
度至48h。(图1～图3略)
3 讨论
纳米材料颗粒一般指粒径为10～1000nm的固态胶体颗粒，在体内不易作为异物受到排斥，加之可对纳米材料进 一步生物兼容性官能团化，从而更易满足药物载体在组织，血液，免疫等生物兼容性的要求 [4] 。5-Fu纳米胶囊是将5-Fu包裹吸附在纳米材料颗粒体的内部，使药物释放速度和方式等具有选择性和可控性，从而实现药物的缓释，更好的发挥药物治疗效率，我们制备的PEG-PBLG共聚物中，PEG是一种无毒和非免疫的水溶性大分子;对含药物的胶囊进行表面修饰，可以减少肝脏的吸收，而PBLG是与天然蛋白相似的一类可生物降解材料。
5-Fu和PEG-PBLG纳米胶囊在电镜下呈球形或椭圆形，中间为截药区，大小约为200nm，周围亲水区厚约为30nm。国内外学者研究认为若截药区内含有大小约为100nm的粒子，应加上5～10nm厚的PEG保护，且PEG厚度与保护作用似乎成正比关系，因此，PEG-PBLG包裹5-Fu后不但使其溶解度增加，而且能有效的减少肝脏的代谢 [5] 。
, 百拇医药
纳米胶囊在体内的释放包括突释和缓释，突释主要是由于吸附的纳米胶囊表面的药物的释放纳米胶囊溶解后，从胶囊渗透出来;缓释则由于药物骨架聚合氨酸肽键在体内蛋白酶的作用下断裂而释放。PEG具有保护纳米胶囊不被肝脏代谢，从而保护5-Fu不被其代谢物二氢尿嘧啶脱氢酶代谢达到长循环的目的。5-Fu纳米胶囊进入体内后，1h产生突释药物浓度为1457.5μg/L，随后维持约80μg/L的平稳浓度至48h。5-Fu的药代动力学研究表明，其纯品在进入体内后迅速代谢，半衰期仅为5～10min，因而5-Fu经PEG-PBLG纳米胶囊包裹，在体内能避免肝脏的代谢而达到长循环时间，从而可提高5-Fu的疗效。常规方法是用5-Fu的长时间静脉滴注，或静脉插管来维持其稳态浓度。经本实验观察，将5-Fu纳米化后，1h的突释即可达到推注效果，而且其长时间的药物总浓度类似长时间的静脉滴注，可能有利于5-Fu疗效的提高。制备的PEG-PBLG共聚物可在水中组装成核-壳胶囊，体内实验表明可以作为5-Fu的纳米胶囊新型的药物转运系统，具有良好的应用前景。
参考文献
, 百拇医药
1 Yasugi K，Nagasaki Y，Kato M，et al.Preparation and characterization of polymer micelles from poly(ethylene glycol)-poly(D，L-lactide)block copolymers as potential drug carrier.J Controlled Release，1999，62(1～2):89.
2 Kreuter J.Nanoparticles and microparticles for drug and vaccine delivˉery
.J Anat，1996，189(3):503-505.
3 Sharma D，Chelvi TP，Kaur J，et al.Novel taxol(R)formulation:polyvinylpyrrolidone nanoparticle-encapsulate taxol(R)for drug delivˉery in cancer therapy.Oncol Res，1996，8(7～8):281-286.
, http://www.100md.com
4 Torchilin，Vladimir P.Drug targeting.Eur J Pharm Sci，2000，11(2):81-91.
5 Perez SR，Shin DM，Siddik ZH，et al.Phase I clinical and pharmacologiˉcal
study of liposome-encapsulated form.Cancer Lett，1998，134(2):121.
作者单位:1 510060广州中山大学肿瘤防治中心内科实验室
2 广州医学院附属荔湾医院放射科
3 广东药学院药物研究所
(收稿日期:2003-08-10)
(编辑 李年令), 百拇医药(詹靖)
关键词 5-Fu 纳米胶囊 聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)11-0963-02
, http://www.100md.com
Preparation and characterization of5-Fluorouracil
coated PEG-PBLG copolymer micelles
Zhan Jing，Xu Kaifeng，Liao Hai，et al.
Medicine Department，Tumor Hospital，Zhongshan University，Guangdong510060.
【Abstract】 Objective To investigate the preparation technology of5-Fluorouracil(5-Fu)loaded core-shell type nanoparticles which were made by the biodegradable amphiphlic poly(ethylene glycol)-poly(γ-benzyle-L-glutamate)(PEG-PBLG)，and its shape and its releasing characteristics in vivo.Methods In Benzyle-Dioxˉane solution，ω-NH 2 -PEG as solicitation，was polymerized with PBLG for ming into PEG-PBLG.The micelles were prepared by the diafiltration method.Its morphology was observed by transmission electron microscope and scan elecˉtron microscope.Encapsulating efficiency of5-Fu was determined by ultraviolet spectrophoto assay.The5-Fu reˉleasing from micelles was investigated by rabbit experimentation in vivo.Results 5-Fu loaded PEG-PBLG copolyˉmer micelles is round or ellipse conformation.The mean diameters of the micelles were from180～250nm;the size of drug storeroom is about200nm and the thickness of hydrophilic layer is about30nm.The entrapment efficiencies is30.1%.After5-Fluorouracil coated PEG-PBLG copolymer micelles was injected into rabbits，5-Fu release abruptly at1hour and maintain stabilization concentration till48hour.Conclusion The nano-micelles of PEG-PBLG copolymer with core-shell structure can be used as a new sustained and controlled release systems for5-Fu，and has a good foreground.
, http://www.100md.com
Key words 5-Fluorouracil core-shell type nano-micelles poly(ethylene glycol)-poly(r-benzyle-L-glutamate)
5-Fu为抗代谢类的抗癌药，是多种肿瘤如头颈部肿瘤、胃肠道肿瘤、乳腺癌等的一线治疗药物，但其在体内代谢快，半衰期短仅为5～10min，因此常常用大剂量、长时间给药来达到5-Fu在体内的有效浓度及其维持时间。开发新型的缓释5-Fu制剂将可能提高5-Fu的疗效、降低毒性。聚乙二醇-聚谷氨酸苄酯(PEG-PBLG)纳米聚合物胶囊是亲水和疏水链节组成的两亲嵌段共聚物，在水中可自组装形成纳米级大小的核壳型胶囊，核为疏水段形成的可包埋药物，而壳为亲水段形成的可掩蔽内壳，也能减少肝脏对药物的代谢，提高药物溶解度 [1～3] 。在本研究中，我们合成了PEG-PBLG两亲嵌段共聚物，制备了5-Fu的纳米 胶囊，并探讨其在体内的释放特性。
, http://www.100md.com 1 材料与方法
1.1 仪器与试药 DRX-400MHz核磁共振波谱仪(德国Bucker)，CM10透射电子显微镜(荷兰Philips);640UV双光束分光光度计(Beckman)，HITACH-600型扫描电子显微镜(日立)，HP1100高效液相色谱仪(美国Agilient公司)。
单甲氧端基聚乙二醇(MR=5000，Sigma)，5-Fu(Sigˉma)，L-谷氨酸(上海生化试剂厂)，苯甲醇(分析纯)，N，N-二甲基甲酰胺(分析纯)，三光气(江苏常德试剂公司)，透析袋(截留分子量3500～5000Spectrum Medical Industries，USA)，聚合反应所用的试剂均经严格无水处理。
1.2 实验方法 (1)PEG-PBLG两亲嵌段共聚物的合成:甲氧基聚乙二醇MEO-PEG在CH 2 C1 2 中与一倍过量的对甲苯磺酰氯溶液发生置换反应生成MEO-PEG-TS，再与浓氨水在120℃下密闭反应7h，生成MEO-PEG-NH 2 。(2)L-谷氨酸γ苄酯-N-羧酸(BLG-NCA)的合成:将L-谷氨酸与苯甲醇，在60%浓硫酸催化下酯化得谷氨酸苄酯(BLG)，与三光气在装有四氢呋喃溶剂密闭容皿中生成谷氨酸苄酯羧酸(BLG-NCA)。(3)PEG-PBLG嵌段共聚物的醇合成[4]:BLG-NCA单体4g溶解于80ml苯-二氧六环混合溶剂中(4∶1(v/v))，以MEO-PEG-NH2 为引发剂(摩尔比50/1)，室温反应72h，无水乙醇沉淀，干燥得PEG-PBLG共聚物，以共聚物摩尔比计算分子量。(4)PEG-PBLG包裹5-Fu纳米胶囊的制备:精密称取20mgPEG-PBLG，20mg5-Fu于10ml灭菌试管中，加入10ml N，N-二甲基甲酰胺，60℃温浴5min，溶解后置透析袋中透析，于2h、5h、8h和12h分别替换蒸馏水，24h后将透析袋中的液体沿0.45mm滤膜过滤，5-Fu纳米胶囊置4℃保存。(5)动物实验方法:取兔6只，实验前禁食12h，分为A、B两组，A组给予5-Fu纯品静注，B组给予5-Fu纳米胶囊，剂量均为30mg/kg(按5-Fu重量计)。在左耳静注给药后的0、5、15、30min、1、2、4、8、12、24、36、48h于右耳静脉取血1ml置干燥管中，2000rpm离心10min，-20℃保存待测。(6)药物浓度测定方法:取0.5ml血浆，加50ml氯仿搅拌3min，12000rpm离心10min，取上清液置含2g硫酸胺试管中，加入5ml乙酸乙酯:异丙醇(85∶15)混合液搅拌5min，2000rpm离心，上清液吹干，加入400μl流动相(0.01M，pH3.0磷酸盐缓冲液)经C 18 (300×4.6mm)色谱柱分离，在269nm，(流速1ml/min)测定，将样品的峰面积代入5-Fu标准曲线计算浓度，描绘浓度-时间曲线。
, 百拇医药
2 结果
2.1 PEG-PBLG共聚物的特性 PEG-PBLG的 1 H-NMR(CDC1 3 )δ3.65(乙氧基4H)峰，δ7.24(苯环5H)，δ2.30(主链β位2H)，而PBLG的 1 H-NMR(CDCl 3 )图谱无δ3.65(乙氧基4H)峰，后者是聚谷氧苄酯中-CH 2 -CH 2 -的特征峰，从而证实了PEG-PBLG共聚物的形成。
2.2 PEG-PBLG的5-Fu胶囊的形态 TEM观察聚化物形态:胶囊呈球形或类球形，边缘模糊，中间没被磷钼酸染色的白色区域为胶囊疏水性同模糊且被染色的亲水区域，SEM观察共聚物:如图1，胶囊呈球形或类球形，中部为截药体区，大小约为200nm，周围亲水区厚约为30nm。
2.3 5-Fu纳米胶囊体内实验结果 5-Fu保留时间为5.80min，兔血浆回收率56%～64%，标准曲线Y=3.47+0.24X，(r=0.9998)，最低检测限5μg/L。5-Fu注射剂，5-Fu纳米胶囊的药-时曲线如图2和图3，5-Fu进入体内后，迅速代谢，4h后基本已从体内消除，而5-Fu纳米胶
, 百拇医药
进入兔体内后，缓慢释放，1h时出现一个达1457.5μg/L的突释浓度，进而维持约80μg/L浓
度至48h。(图1～图3略)
3 讨论
纳米材料颗粒一般指粒径为10～1000nm的固态胶体颗粒，在体内不易作为异物受到排斥，加之可对纳米材料进 一步生物兼容性官能团化，从而更易满足药物载体在组织，血液，免疫等生物兼容性的要求 [4] 。5-Fu纳米胶囊是将5-Fu包裹吸附在纳米材料颗粒体的内部，使药物释放速度和方式等具有选择性和可控性，从而实现药物的缓释，更好的发挥药物治疗效率，我们制备的PEG-PBLG共聚物中，PEG是一种无毒和非免疫的水溶性大分子;对含药物的胶囊进行表面修饰，可以减少肝脏的吸收，而PBLG是与天然蛋白相似的一类可生物降解材料。
5-Fu和PEG-PBLG纳米胶囊在电镜下呈球形或椭圆形，中间为截药区，大小约为200nm，周围亲水区厚约为30nm。国内外学者研究认为若截药区内含有大小约为100nm的粒子，应加上5～10nm厚的PEG保护，且PEG厚度与保护作用似乎成正比关系，因此，PEG-PBLG包裹5-Fu后不但使其溶解度增加，而且能有效的减少肝脏的代谢 [5] 。
, 百拇医药
纳米胶囊在体内的释放包括突释和缓释，突释主要是由于吸附的纳米胶囊表面的药物的释放纳米胶囊溶解后，从胶囊渗透出来;缓释则由于药物骨架聚合氨酸肽键在体内蛋白酶的作用下断裂而释放。PEG具有保护纳米胶囊不被肝脏代谢，从而保护5-Fu不被其代谢物二氢尿嘧啶脱氢酶代谢达到长循环的目的。5-Fu纳米胶囊进入体内后，1h产生突释药物浓度为1457.5μg/L，随后维持约80μg/L的平稳浓度至48h。5-Fu的药代动力学研究表明，其纯品在进入体内后迅速代谢，半衰期仅为5～10min，因而5-Fu经PEG-PBLG纳米胶囊包裹，在体内能避免肝脏的代谢而达到长循环时间，从而可提高5-Fu的疗效。常规方法是用5-Fu的长时间静脉滴注，或静脉插管来维持其稳态浓度。经本实验观察，将5-Fu纳米化后，1h的突释即可达到推注效果，而且其长时间的药物总浓度类似长时间的静脉滴注，可能有利于5-Fu疗效的提高。制备的PEG-PBLG共聚物可在水中组装成核-壳胶囊，体内实验表明可以作为5-Fu的纳米胶囊新型的药物转运系统，具有良好的应用前景。
参考文献
, 百拇医药
1 Yasugi K，Nagasaki Y，Kato M，et al.Preparation and characterization of polymer micelles from poly(ethylene glycol)-poly(D，L-lactide)block copolymers as potential drug carrier.J Controlled Release，1999，62(1～2):89.
2 Kreuter J.Nanoparticles and microparticles for drug and vaccine delivˉery
.J Anat，1996，189(3):503-505.
3 Sharma D，Chelvi TP，Kaur J，et al.Novel taxol(R)formulation:polyvinylpyrrolidone nanoparticle-encapsulate taxol(R)for drug delivˉery in cancer therapy.Oncol Res，1996，8(7～8):281-286.
, http://www.100md.com
4 Torchilin，Vladimir P.Drug targeting.Eur J Pharm Sci，2000，11(2):81-91.
5 Perez SR，Shin DM，Siddik ZH，et al.Phase I clinical and pharmacologiˉcal
study of liposome-encapsulated form.Cancer Lett，1998，134(2):121.
作者单位:1 510060广州中山大学肿瘤防治中心内科实验室
2 广州医学院附属荔湾医院放射科
3 广东药学院药物研究所
(收稿日期:2003-08-10)
(编辑 李年令), 百拇医药(詹靖)