-80℃保存机采浓缩血小板的研究
【摘要】 目的 探讨-80℃冰冻保存机采浓缩血小板的功能及止血效果。方法 随机抽取冰冻保存3个月之内，3～6个月之间，6～9个月之间的冰冻血小板样品于42℃解冻后进行相关实验，比较不同保存时期冰冻血小板的功能及回收率;分血液病组和非血液病组观察患者输注冰冻血小板24h后出血症状的控制及校正血小板增高指数CCI值。结果 冻存3个月内，3～6个月的两组冰冻血小板的粘附功能、聚集功能与新鲜机采血小板相比差异均无显著性(P>0.05);而冻存6～9个月的冰冻血小板的粘附功能与新鲜机采血小板相比则差异有非常显著性(P<0.01)。三组冰冻血小板的第Ⅲ因子活性测定与正常对照相比，均在正常范围;平均回收率为85.2%。两组患者在输注冰冻血小板24h后能有效控制出血症状的比率平均为93.3%;而CCI值≥10000/μl的比率，非血液病组显著高于血液病组。结论 5%DMSO-80℃冰冻保存半年以内的机采浓缩血小板具有良好的止血功能。
关键词 -80℃ 二甲基亚枫 保存 机采 血小板
, 百拇医药
【文献标识码】 B 【文章编号】 1726-7587(2003)09-0819-03
血小板输注是治疗各种血小板减少或功能障碍导致出血的重要手段。由全自动细胞分离机制备的浓缩血小板，因其纯度高、疗效显著、白细胞污染少，同种免疫发生率低等优点，更为临床广泛应用[1，2] 。然而，血小板在22℃恒温条件下，用振荡或旋转式保存的时间仅5天;同时，其保存的温湿度条件也正是细菌繁殖的最适条件，因此易发生污染而导致严重的输注事故发生。目前，许多中小血站采用即采即供的方式提供机采血小板，而其整个采集程序从预约献血员、体检、二次检验到机器采集通常需要6～8h，难以满足临床突发性大出血的抢救而延误治疗时机。为此，笔者从1998年6月开始尝试国际普遍使用的生物冷冻保护剂二甲基亚枫(DMSO)对机采浓缩血小板进行深低温(-80℃)保存 [3] ，并对解冻后的血小板进行了一系列的功能检测和临床疗效的观察，现将研究结果报告如下。
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 主要仪器设备 CS-3000PLUS血细胞分离机;F-820血细胞计数仪;TYXN-91A智能血液凝集仪;局部100级净化间;-80℃深低温冰箱。
1.2 冰冻血小板的制备、保存与解冻 选择符合国家规定体检标准的献血员，依照CS-3000PLUS血细胞分离机中程序1即血小板采集程序，设置全血流速为50ml/min，ACD/全血比率为1:11，界面探测值(IDO值)为6～8，血小板终产量均≥3.0×10 11 ，容量为200ml。产品在100级净化间内，缓慢加入生物冷冻保护剂二甲基亚枫(DMSO)至终浓度 为(5.0±0.5)%，水平置-80℃冰箱保存，每袋产品同时留样4～5ml一并冻存。用时取出制品42℃解冻后立即输注给患者。
1.3 实验方法 随机抽取冰冻保存3个月之内，3～6个月之间，6～9个月之间的冰冻血小板样品于42℃解冻后进行以下实验:滴定法测定产品中DMSO含量;蝰蛇毒法测定血小板第Ⅲ因子活性;玻珠柱法测定血小板粘附功能;以花生四烯酸为诱导剂测定血小板聚集功能。同时还随机选择36例新鲜机采浓缩血小板进行以上实验，以实现在相同实验条件下与冰冻血小板之间的对比与分析。
, 百拇医药
1.4 临床资料来源 本文所观察的受者，均为本市各医院的患者，都有明确输注血小板的适应证，有肝、肾功能损害的患者禁用。我站在向临床提供冰冻血小板的同时发出“冰冻血小板临床输注观察表”，内容包括患者的一般情况、临床诊断，输前患者的症状、体征、血小板计数，输注后患者症状、体征的改善情况及血小板计数等，由主管医生填写后反馈给我站。
1.5 临床疗效观察指标 将输注冰冻血小板的病人，分为血液病组和非血液病组分别观察。凡符合下列两项指标中的一项视为有效:(1)输注冰冻血小板24h，临床出血情况得到明显控制;(2)输注冰冻血小板24h，校正血小板增高指数CCI值≥10000/μl。
1.6 统计学分析 本实验的所有数据均以均数±标准差表示(ˉx±s)。采用两样品均数的t检验分析来计算其差异的统计学意义，P值以95%的可信限表示。
2 结果
, 百拇医药
见表1，2，3，4，5。
表1 三组冰冻血小板与新鲜血小板功能检测结果 (略)
表2 三组冰冻血小板回收率 (略)
表3 输注冰冻血小板24h后临床效果 (略)
表4 输注前与输注24h血小板计数(略)
表5 DMSO化的血小板容积与DMSO输注量略
(1)笔者所制备的冰冻血小板制品于肉眼观察为均匀一致混悬液且无凝丝，每袋容积平均为(200±10)ml，DMSO含量测定均值为(4.82±0.32)%，保存期末pH值测定均值为(7.4±0.3)，以上结果显示在本实验条件下保存的冰冻血小板，无论冻存时间长短(最短1个月，最长9个月)均符合预定要求和标准。(2)由表1看出，冻存3个月之内，3～6个月之间、6～9个月之间的三组冰冻血小板，于42℃解冻后的聚集功能测定值分别为(37.7±17.4)、(40.6±16.2)、(53.3±18.0)，与新鲜机采血小板(44.2±16.8)相比差异均无显著性(P>0.05);冻存3个月内、3～6个月的两组冰冻血小板的粘附功能测定值分别为(35.6±8.2)、(33.0± 10.3)，与新鲜机采血小板(39.1±11.3)相比亦差异均无显著性(P>0.05);而冻存6～9个月的冰冻血小板的粘附功能(30.8±6.1)与新鲜机采血小板相比则差异有非常显著性(P<0.01)。三组冰冻血小板的第Ⅲ因子活性测定与正常对照相比，均在正常范围。(3)由表2看出，三组冰冻血小板冻存期由短至长的回收率分别为(85.8±9.8)%，(84.4±8.1)%，(84.7±6.9)%，平均回收率为85.2%。(4)表3显示，血液病组和非血液病组在输注冰冻血小板24h后能有效控制出血症状的比率分别为90.1%和96.4%，平均为92.5%。而CCI值(血小板校正计数增加值)≥10000//μl的比率分别为16.7%和62.5%，平均为35.8%，非血液病组显著高于血液病组。(5)各组患者输注冰冻血小板24h后的血小板平均值较输注前增加明显(见表4)，差异均有非常显著性(P<0.01)。非血液病组输注后血小板平均增加值(23.8±29.4)比血液病组(11.0±16.3)高，差异有非常显著性(P<0.01)。
, 百拇医药
3 讨论
(1)实验表明，冻存半年之内的机采浓缩血小板其各项功能指标均符合质量要求，未发生显著变化;而冻存半年以上(6～9个月)的冰冻血小板其粘附功能发生较显著的下降，但其它功能指标仍符合质量要求。从血小板回收率来看，其结果还是令人满意的，平均为85.2%。因此，笔者建议，冰冻血小板的冻存时间以半年为佳，冻存前应确保每袋新鲜采集的血小板数量≥3.0×10 11 个，从而才能保证经冰冻-复温程序后，每袋冰冻血小板含量≥2.5×10 11 个。(2)输注冰冻血小板能有效地控制血液病组与非血液病组患者的出血症状(平均有效率达93.3%)，但血液病组患者的CCI值≥10000μl的比率却显著低于非血液病组，这可能与血液病患者的骨髓造血功能受抑制、肿瘤细胞浸润、合并脾功能亢进以及长期反复输血易发生同种免疫等诸多因素有关，致使血小板输注效果不如非血液病患者显著。(3)本方法与同样方法保存的手工分血小板及富血小板血浆比较，同为一个治疗量，患者在获得相同数量的血小板时，本方法仅需一人提供，而且输入的容量最少(200ml)，输入DMSO的量也最少(10g)，从而减轻了患者的循环负担及输血不良反应，见表5。
, 百拇医药
综上所述，5%DMSO-80℃冰冻保存半年以内的机采浓缩血小板具有良好的止血功能，且在临床应用中得到了肯定。同时，因其输注前准备时间短，故在临床抢救各种大出血的“黄金时刻”能及时提供安全、有效的血小板制品，这正是本研究的目的所在。当然，由于我们实验样品的数量有限，对于冰存半年以上的机采浓缩血小板的临床应用价值还有待于进一步的研究和探讨。
参考文献
1 刘景汉.低温保存血小板在外科手术的应用.中国输血杂志，2001，14(3):139.
2 杨春森.低温-80℃保存浓缩血小板及临床应用.深圳医学，1998，11(4):4.
3 Angelini-A.Evaluation of four different methods for platelet freezing.In vitro and in vivo studies.Vox-Sang，1992，62(3):146.
(收稿日期:2003-09-04)
(编辑 刘娜), 百拇医药(吴晓燕)
关键词 -80℃ 二甲基亚枫 保存 机采 血小板
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【文献标识码】 B 【文章编号】 1726-7587(2003)09-0819-03
血小板输注是治疗各种血小板减少或功能障碍导致出血的重要手段。由全自动细胞分离机制备的浓缩血小板，因其纯度高、疗效显著、白细胞污染少，同种免疫发生率低等优点，更为临床广泛应用[1，2] 。然而，血小板在22℃恒温条件下，用振荡或旋转式保存的时间仅5天;同时，其保存的温湿度条件也正是细菌繁殖的最适条件，因此易发生污染而导致严重的输注事故发生。目前，许多中小血站采用即采即供的方式提供机采血小板，而其整个采集程序从预约献血员、体检、二次检验到机器采集通常需要6～8h，难以满足临床突发性大出血的抢救而延误治疗时机。为此，笔者从1998年6月开始尝试国际普遍使用的生物冷冻保护剂二甲基亚枫(DMSO)对机采浓缩血小板进行深低温(-80℃)保存 [3] ，并对解冻后的血小板进行了一系列的功能检测和临床疗效的观察，现将研究结果报告如下。
, 百拇医药 1 材料和方法
1.1 主要仪器设备 CS-3000PLUS血细胞分离机;F-820血细胞计数仪;TYXN-91A智能血液凝集仪;局部100级净化间;-80℃深低温冰箱。
1.2 冰冻血小板的制备、保存与解冻 选择符合国家规定体检标准的献血员，依照CS-3000PLUS血细胞分离机中程序1即血小板采集程序，设置全血流速为50ml/min，ACD/全血比率为1:11，界面探测值(IDO值)为6～8，血小板终产量均≥3.0×10 11 ，容量为200ml。产品在100级净化间内，缓慢加入生物冷冻保护剂二甲基亚枫(DMSO)至终浓度 为(5.0±0.5)%，水平置-80℃冰箱保存，每袋产品同时留样4～5ml一并冻存。用时取出制品42℃解冻后立即输注给患者。
1.3 实验方法 随机抽取冰冻保存3个月之内，3～6个月之间，6～9个月之间的冰冻血小板样品于42℃解冻后进行以下实验:滴定法测定产品中DMSO含量;蝰蛇毒法测定血小板第Ⅲ因子活性;玻珠柱法测定血小板粘附功能;以花生四烯酸为诱导剂测定血小板聚集功能。同时还随机选择36例新鲜机采浓缩血小板进行以上实验，以实现在相同实验条件下与冰冻血小板之间的对比与分析。
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1.4 临床资料来源 本文所观察的受者，均为本市各医院的患者，都有明确输注血小板的适应证，有肝、肾功能损害的患者禁用。我站在向临床提供冰冻血小板的同时发出“冰冻血小板临床输注观察表”，内容包括患者的一般情况、临床诊断，输前患者的症状、体征、血小板计数，输注后患者症状、体征的改善情况及血小板计数等，由主管医生填写后反馈给我站。
1.5 临床疗效观察指标 将输注冰冻血小板的病人，分为血液病组和非血液病组分别观察。凡符合下列两项指标中的一项视为有效:(1)输注冰冻血小板24h，临床出血情况得到明显控制;(2)输注冰冻血小板24h，校正血小板增高指数CCI值≥10000/μl。
1.6 统计学分析 本实验的所有数据均以均数±标准差表示(ˉx±s)。采用两样品均数的t检验分析来计算其差异的统计学意义，P值以95%的可信限表示。
2 结果
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见表1，2，3，4，5。
表1 三组冰冻血小板与新鲜血小板功能检测结果 (略)
表2 三组冰冻血小板回收率 (略)
表3 输注冰冻血小板24h后临床效果 (略)
表4 输注前与输注24h血小板计数(略)
表5 DMSO化的血小板容积与DMSO输注量略
(1)笔者所制备的冰冻血小板制品于肉眼观察为均匀一致混悬液且无凝丝，每袋容积平均为(200±10)ml，DMSO含量测定均值为(4.82±0.32)%，保存期末pH值测定均值为(7.4±0.3)，以上结果显示在本实验条件下保存的冰冻血小板，无论冻存时间长短(最短1个月，最长9个月)均符合预定要求和标准。(2)由表1看出，冻存3个月之内，3～6个月之间、6～9个月之间的三组冰冻血小板，于42℃解冻后的聚集功能测定值分别为(37.7±17.4)、(40.6±16.2)、(53.3±18.0)，与新鲜机采血小板(44.2±16.8)相比差异均无显著性(P>0.05);冻存3个月内、3～6个月的两组冰冻血小板的粘附功能测定值分别为(35.6±8.2)、(33.0± 10.3)，与新鲜机采血小板(39.1±11.3)相比亦差异均无显著性(P>0.05);而冻存6～9个月的冰冻血小板的粘附功能(30.8±6.1)与新鲜机采血小板相比则差异有非常显著性(P<0.01)。三组冰冻血小板的第Ⅲ因子活性测定与正常对照相比，均在正常范围。(3)由表2看出，三组冰冻血小板冻存期由短至长的回收率分别为(85.8±9.8)%，(84.4±8.1)%，(84.7±6.9)%，平均回收率为85.2%。(4)表3显示，血液病组和非血液病组在输注冰冻血小板24h后能有效控制出血症状的比率分别为90.1%和96.4%，平均为92.5%。而CCI值(血小板校正计数增加值)≥10000//μl的比率分别为16.7%和62.5%，平均为35.8%，非血液病组显著高于血液病组。(5)各组患者输注冰冻血小板24h后的血小板平均值较输注前增加明显(见表4)，差异均有非常显著性(P<0.01)。非血液病组输注后血小板平均增加值(23.8±29.4)比血液病组(11.0±16.3)高，差异有非常显著性(P<0.01)。
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3 讨论
(1)实验表明，冻存半年之内的机采浓缩血小板其各项功能指标均符合质量要求，未发生显著变化;而冻存半年以上(6～9个月)的冰冻血小板其粘附功能发生较显著的下降，但其它功能指标仍符合质量要求。从血小板回收率来看，其结果还是令人满意的，平均为85.2%。因此，笔者建议，冰冻血小板的冻存时间以半年为佳，冻存前应确保每袋新鲜采集的血小板数量≥3.0×10 11 个，从而才能保证经冰冻-复温程序后，每袋冰冻血小板含量≥2.5×10 11 个。(2)输注冰冻血小板能有效地控制血液病组与非血液病组患者的出血症状(平均有效率达93.3%)，但血液病组患者的CCI值≥10000μl的比率却显著低于非血液病组，这可能与血液病患者的骨髓造血功能受抑制、肿瘤细胞浸润、合并脾功能亢进以及长期反复输血易发生同种免疫等诸多因素有关，致使血小板输注效果不如非血液病患者显著。(3)本方法与同样方法保存的手工分血小板及富血小板血浆比较，同为一个治疗量，患者在获得相同数量的血小板时，本方法仅需一人提供，而且输入的容量最少(200ml)，输入DMSO的量也最少(10g)，从而减轻了患者的循环负担及输血不良反应，见表5。
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综上所述，5%DMSO-80℃冰冻保存半年以内的机采浓缩血小板具有良好的止血功能，且在临床应用中得到了肯定。同时，因其输注前准备时间短，故在临床抢救各种大出血的“黄金时刻”能及时提供安全、有效的血小板制品，这正是本研究的目的所在。当然，由于我们实验样品的数量有限，对于冰存半年以上的机采浓缩血小板的临床应用价值还有待于进一步的研究和探讨。
参考文献
1 刘景汉.低温保存血小板在外科手术的应用.中国输血杂志，2001，14(3):139.
2 杨春森.低温-80℃保存浓缩血小板及临床应用.深圳医学，1998，11(4):4.
3 Angelini-A.Evaluation of four different methods for platelet freezing.In vitro and in vivo studies.Vox-Sang，1992，62(3):146.
(收稿日期:2003-09-04)
(编辑 刘娜), 百拇医药(吴晓燕)