超微量酶法检测血清总胆固醇的实验探讨
【摘要】 目的 用超微量血清在微孔板内进行酶法检测总胆固醇(TC)，分析其线性范围、准确度、精密度、回收率，并与日立7600型全自动生化分析仪进行测定比较，以探讨超微量酶法检测总胆固醇结果的可靠性。方法 采用超微量酶法，酶标生化多功能分析仪比色测定。结果 本法的线性范围达15.1mmol/L，批内变异系数(CV)为1.29%～2.45%，日间变异系数(CV)为1.95%～2.67%，回收率为99%～105%，平均102.8%，与全自动生化分析仪比较具有良好的相关性，y=1.112x-0.339，r=0.9839。结论 本法操作简单，血清、试剂用量少，检测快速，准确性及重复性好，结果可靠，利于微量检测血清总胆固醇的推广应用。
关键词 超微量血清 酶法 总胆固醇
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)09-0782-02
Examination of serum total cholesterol by super-microzymed method
, 百拇医药
Wu Bin，Zhang Chunni，Wang Zhijun，et al.
Outpatients of Nanjing Military Command，Nanjing210016.
【Abstract】 Objective To evaluate the reliability of super-micro-quantity
zymed method for determining the levels of serum total cholesterol.Methods Super-micro-zymed method was adopted，zyme-labelled biochemiˉcal multifunctional analyzer was used for colorimetric analysis.Results The linear scope was15.1mmol/L，inside CV1.29%～2.45%，daytime CV1.95%～2.67%，recovery rate99%～105%，mean102.8%.Itwas well correlations with the results from antomatic biochemistry analyzer，y=1.112x-0.339，r=0.9839.Conclusion The methods would be useful to determine the levels of serum total cholesterol.
, 百拇医药
Key words super-microserum zymed method total cholesterol
酶法检测血清总胆固醇是目前公认为最适于作血清总胆固醇测定的常规方法 [1] ，在各大中小医院实验室测定TC大多采用酶法，既可于作终点法手工操作，分光光度计比色测定，也可于半自动、全自动生化分析仪检测。它具有试剂单一、试验稳定、使用方便等优点。但手工法、分光光度计比色和半自动生化分析仪试剂消耗量大，成本高。我们采用超微量血清酶终点比色法，应用酶标生化多功能分析仪对TC进行了实验探讨，使试剂用量明显低于上述仪器的测试方法，且测得结果准确可靠，重复性好。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 仪器 酶标生化多功能分析仪(中国航天北京市新风机电技术公司生产);日立7600型全自动生化分析仪(日本日立公司生产);2μl超微量定量移液器(军工科技信息咨询服务部生产);50～250μl可调移液器(上海求精生化试剂仪器有限公司生产);96孔酶标板(华美生物工程公司生产)。
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1.2 试剂 酶标生化多功能分析仪应用试剂:总胆固醇(浙江东瓯生物工程有限公司生产);日立7600型全自动生化分析仪应用试剂:总胆固醇(RANDOX英国)。
1.3 样品 常规检验血标本。
1.4 方法 总胆固醇COD-PAP [2] 法。取96孔酶标板一块，用2μl超微定量移液器于测定孔内加待检血清2μl，标准孔内加标准液2μl，空白孔内加蒸馏水2μl(可加可不加，不影响测定结果)，各孔加酶应用液200μl，混匀，置37℃10min后，置酶标生化多功能分析仪测量室内，波长505nm/ 650nm，测量各孔总胆固醇含量。
2 结果
2.1 两机对比试验 用门诊常规检验的血标本20例分别于日立7600型全自动生化分析仪及酶标生化多功能分析仪检测。结果分别为日立7600型全自动生化分析仪的TC平均值4.80mmol/L，酶标生化多功能分析仪的TC平均值4.62mmol/L，回归及相关系数，TC a=1.112，b=-0.3
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39，r=0.9839。
2.2 线性分析 取一份外观正常高值TC15.1mmol/L标本，用生理盐水作梯度稀释，使理论值含TC分别为15.1、7.55、3.78、1.89、0.94mmol/L。按上法操作，每一浓度平行3孔，取平均值。其理论值与实验值直线回归方程和相关系数见表1。
表1 线性实验略
2.3 精密度实验 用常规检测标本高、中、低值各1份，批内重复测定20次，批间重复每日测定4次，共5天，结果见表2。
表2 重复性实验略
2.4 准确性实验 取宝灵曼公司定值质控血清，批号156448，TC3.98mmol/L;北京中生生物工程高技术公司定值质控血清，批号020414，TC3.88mmol/L。用上述试剂该酶标生化多功能分析仪，每一浓度平行3孔，取平均值。宝灵曼公司，其测定值为:TC3.93mmol/L，北京中生生物工程高技术公司，其测定值为:TC3.87mmol/L。
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2.5 回收试验 取一份定值质控物TC=3.98mmol/L，分别加入2.59、5.18、7.77、10.36mmol/L不同浓度标准液。其回收率分别为104%、103%、99%、105%，平均102.8%。
3 讨论
本法血清用量极微，2μl即可检验，所以操作技术要求精细。在使用微量定量移液器加样品或可调移液器加试剂前，吸嘴一定要用蒸馏水进行预洗2～3次，对检测结果的准确与否，除了试验方法可靠外，关键在于样品或试剂的加量，其中包括加入孔内的速度及移液器的角度应一致，对每次加试剂吸嘴内尚存的少量液体，可不加入孔内，依次类推到加完试剂后弃去吸嘴内的尚存液体，用此一致性的加样或加试剂的方法 [3] ，能明显提高结果的准确性。
应用96微孔板在孔内直接进行试验操作，只需微量定量移液器和可调移液器加样品和试剂，无需特殊器材，而且用血量、试剂量少，从样品及试剂用量比较，超微量法的样品用量为全自动、半自动生化分析仪的1/5，常规手工法的1/10，试剂用量和全自动生化分析仪相似、为半自动生化分析仪的1/3，常量手工法的1/10，显然节省了大量昂贵的酶试剂。
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用上述仪器测血清总胆固醇，测试速度快，在大批量标本检测比色中，96份样品30s内即可测试打印出结果报告，无需读取吸光度后再进行人工计算，提高了工作效率。以及其耗材少，操作简便，使用方便，重复性好，测试结果准确 等优点，特别适用于目前各中小医院实验室。
在实际工作中，我们发现随酶试剂盒配备的总胆固醇标准液问题较多，如保存不稳定，在使用中无水乙醇易挥发等，给实验室日常工作带来诸多不便。尤其在超微量试验加标准液时，因量少、挥发快，易使测定结果偏高。酶法测胆固醇最好用血清作标准，而不适于用纯胆固醇标准液 [1] 。若无血清胆固醇标准物质，可按下列操作，先加样品，最后加标准液，并立即在标准液孔内加入酶试剂，即可消除试验结果的误差。因此，加标准溶液是关键
步骤，须严格操作。
超微量酶法检测血清总胆固醇已有报道 [4] ，当时血清用量为4μl，比色为721分光光度计酶标比色配件上测试。后亦有人用酶标仪垂直光路比色测定生化项目在理论上也作过评价 [5] 。我们在应用酶标生化多功能分析仪和对该仪器测试应用评价的基础上 [6～8] ，与日立7600型、7170型、Olympus AU2700型、意大利216E型和Beckman CX4型全自动生化分析仪均作了两机对比试验，测试结果表明，应用超微量酶法检测血清总胆固醇其相应测定值与上述仪器均有良好的相关性，检测结果基本一致，用本法测定总胆固醇，线性可达15mmol/L，与文献报道基本一致 [1] ，线性范围能满足临床使用。
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参考文献
1 中华医学会检验学血脂测定推荐方法(二).血清总胆固醇酶法测定(草案).中华医学检验杂志，1995，18(3):183-186.
2 叶应妩，王毓三.全国临床检验操作常规.第二版.南京:东南大学出版社，1997，268-278.
3 吴斌，张春妮，王志军，等.酶标生化仪测定甘油三酯的实验研究与应用.中华临床医学研究杂志，2003，1(4):314-315.
4 郭春详，范基农，陈培声，等.超微量酶法检测血清总胆固醇的研究.中华医学检验杂志，1985，8(1):323.
5 王玉琛.垂直光路光度测定实验.中华医学检验杂志，1986，9(3):147-149.
6 吴斌，张军，黄易，等.用酶标生化分析仪测试无机离子的临床应用与评价.医疗装备，2001，14(8):14-16.
7 吴斌，崔云龙.应用酶标生化仪微量测试血清葡萄糖的评价.医疗装备，2002，15(12):5-6.
8 吴斌，谭军，韩明伦.使用国产酶标生化多功能快速分析仪的评价.医疗装备，2000，13(9):31.
作者单位:1 210016南京军区门诊部检验科
2 南京军区南京总医院全军医学检验中心
(收稿日期:2003-09-19)
(编辑 刘娜), http://www.100md.com
关键词 超微量血清 酶法 总胆固醇
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2003)09-0782-02
Examination of serum total cholesterol by super-microzymed method
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Wu Bin，Zhang Chunni，Wang Zhijun，et al.
Outpatients of Nanjing Military Command，Nanjing210016.
【Abstract】 Objective To evaluate the reliability of super-micro-quantity
zymed method for determining the levels of serum total cholesterol.Methods Super-micro-zymed method was adopted，zyme-labelled biochemiˉcal multifunctional analyzer was used for colorimetric analysis.Results The linear scope was15.1mmol/L，inside CV1.29%～2.45%，daytime CV1.95%～2.67%，recovery rate99%～105%，mean102.8%.Itwas well correlations with the results from antomatic biochemistry analyzer，y=1.112x-0.339，r=0.9839.Conclusion The methods would be useful to determine the levels of serum total cholesterol.
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Key words super-microserum zymed method total cholesterol
酶法检测血清总胆固醇是目前公认为最适于作血清总胆固醇测定的常规方法 [1] ，在各大中小医院实验室测定TC大多采用酶法，既可于作终点法手工操作，分光光度计比色测定，也可于半自动、全自动生化分析仪检测。它具有试剂单一、试验稳定、使用方便等优点。但手工法、分光光度计比色和半自动生化分析仪试剂消耗量大，成本高。我们采用超微量血清酶终点比色法，应用酶标生化多功能分析仪对TC进行了实验探讨，使试剂用量明显低于上述仪器的测试方法，且测得结果准确可靠，重复性好。现报告如下。
1 材料与方法
1.1 仪器 酶标生化多功能分析仪(中国航天北京市新风机电技术公司生产);日立7600型全自动生化分析仪(日本日立公司生产);2μl超微量定量移液器(军工科技信息咨询服务部生产);50～250μl可调移液器(上海求精生化试剂仪器有限公司生产);96孔酶标板(华美生物工程公司生产)。
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1.2 试剂 酶标生化多功能分析仪应用试剂:总胆固醇(浙江东瓯生物工程有限公司生产);日立7600型全自动生化分析仪应用试剂:总胆固醇(RANDOX英国)。
1.3 样品 常规检验血标本。
1.4 方法 总胆固醇COD-PAP [2] 法。取96孔酶标板一块，用2μl超微定量移液器于测定孔内加待检血清2μl，标准孔内加标准液2μl，空白孔内加蒸馏水2μl(可加可不加，不影响测定结果)，各孔加酶应用液200μl，混匀，置37℃10min后，置酶标生化多功能分析仪测量室内，波长505nm/ 650nm，测量各孔总胆固醇含量。
2 结果
2.1 两机对比试验 用门诊常规检验的血标本20例分别于日立7600型全自动生化分析仪及酶标生化多功能分析仪检测。结果分别为日立7600型全自动生化分析仪的TC平均值4.80mmol/L，酶标生化多功能分析仪的TC平均值4.62mmol/L，回归及相关系数，TC a=1.112，b=-0.3
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39，r=0.9839。
2.2 线性分析 取一份外观正常高值TC15.1mmol/L标本，用生理盐水作梯度稀释，使理论值含TC分别为15.1、7.55、3.78、1.89、0.94mmol/L。按上法操作，每一浓度平行3孔，取平均值。其理论值与实验值直线回归方程和相关系数见表1。
表1 线性实验略
2.3 精密度实验 用常规检测标本高、中、低值各1份，批内重复测定20次，批间重复每日测定4次，共5天，结果见表2。
表2 重复性实验略
2.4 准确性实验 取宝灵曼公司定值质控血清，批号156448，TC3.98mmol/L;北京中生生物工程高技术公司定值质控血清，批号020414，TC3.88mmol/L。用上述试剂该酶标生化多功能分析仪，每一浓度平行3孔，取平均值。宝灵曼公司，其测定值为:TC3.93mmol/L，北京中生生物工程高技术公司，其测定值为:TC3.87mmol/L。
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2.5 回收试验 取一份定值质控物TC=3.98mmol/L，分别加入2.59、5.18、7.77、10.36mmol/L不同浓度标准液。其回收率分别为104%、103%、99%、105%，平均102.8%。
3 讨论
本法血清用量极微，2μl即可检验，所以操作技术要求精细。在使用微量定量移液器加样品或可调移液器加试剂前，吸嘴一定要用蒸馏水进行预洗2～3次，对检测结果的准确与否，除了试验方法可靠外，关键在于样品或试剂的加量，其中包括加入孔内的速度及移液器的角度应一致，对每次加试剂吸嘴内尚存的少量液体，可不加入孔内，依次类推到加完试剂后弃去吸嘴内的尚存液体，用此一致性的加样或加试剂的方法 [3] ，能明显提高结果的准确性。
应用96微孔板在孔内直接进行试验操作，只需微量定量移液器和可调移液器加样品和试剂，无需特殊器材，而且用血量、试剂量少，从样品及试剂用量比较，超微量法的样品用量为全自动、半自动生化分析仪的1/5，常规手工法的1/10，试剂用量和全自动生化分析仪相似、为半自动生化分析仪的1/3，常量手工法的1/10，显然节省了大量昂贵的酶试剂。
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用上述仪器测血清总胆固醇，测试速度快，在大批量标本检测比色中，96份样品30s内即可测试打印出结果报告，无需读取吸光度后再进行人工计算，提高了工作效率。以及其耗材少，操作简便，使用方便，重复性好，测试结果准确 等优点，特别适用于目前各中小医院实验室。
在实际工作中，我们发现随酶试剂盒配备的总胆固醇标准液问题较多，如保存不稳定，在使用中无水乙醇易挥发等，给实验室日常工作带来诸多不便。尤其在超微量试验加标准液时，因量少、挥发快，易使测定结果偏高。酶法测胆固醇最好用血清作标准，而不适于用纯胆固醇标准液 [1] 。若无血清胆固醇标准物质，可按下列操作，先加样品，最后加标准液，并立即在标准液孔内加入酶试剂，即可消除试验结果的误差。因此，加标准溶液是关键
步骤，须严格操作。
超微量酶法检测血清总胆固醇已有报道 [4] ，当时血清用量为4μl，比色为721分光光度计酶标比色配件上测试。后亦有人用酶标仪垂直光路比色测定生化项目在理论上也作过评价 [5] 。我们在应用酶标生化多功能分析仪和对该仪器测试应用评价的基础上 [6～8] ，与日立7600型、7170型、Olympus AU2700型、意大利216E型和Beckman CX4型全自动生化分析仪均作了两机对比试验，测试结果表明，应用超微量酶法检测血清总胆固醇其相应测定值与上述仪器均有良好的相关性，检测结果基本一致，用本法测定总胆固醇，线性可达15mmol/L，与文献报道基本一致 [1] ，线性范围能满足临床使用。
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参考文献
1 中华医学会检验学血脂测定推荐方法(二).血清总胆固醇酶法测定(草案).中华医学检验杂志，1995，18(3):183-186.
2 叶应妩，王毓三.全国临床检验操作常规.第二版.南京:东南大学出版社，1997，268-278.
3 吴斌，张春妮，王志军，等.酶标生化仪测定甘油三酯的实验研究与应用.中华临床医学研究杂志，2003，1(4):314-315.
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6 吴斌，张军，黄易，等.用酶标生化分析仪测试无机离子的临床应用与评价.医疗装备，2001，14(8):14-16.
7 吴斌，崔云龙.应用酶标生化仪微量测试血清葡萄糖的评价.医疗装备，2002，15(12):5-6.
8 吴斌，谭军，韩明伦.使用国产酶标生化多功能快速分析仪的评价.医疗装备，2000，13(9):31.
作者单位:1 210016南京军区门诊部检验科
2 南京军区南京总医院全军医学检验中心
(收稿日期:2003-09-19)
(编辑 刘娜), http://www.100md.com