多巴胺受体对大鼠DRG神经元ATP受体的调制作用
【摘要】 目的 研究多巴胺(DA)对ATP-激活电流(I ATP )的调制作用。方法 在大鼠新鲜分离的DRG神经元标本上应用全细胞膜片钳技术，记录DA对I ATP 的影响。结果大部分受检细胞(89.5%，77/86)对ATP敏感，10 -6 ～10 -3 mol/L ATP可引起剂量依赖性呈明显去敏感的内向电流。在此77个细胞中，预加DA对I ATP 的影响如下:在50.6%(39/77)的细胞产生抑制作用，28.6%(22/77)的细胞产生增强作用，其余的无明显作用(20.8%，16/77)。在浓度10 -7 ～10 -3 mol/L范围DA对I ATP 的抑制或增强作用依赖于多巴胺的浓度。胞内透析GDP-β-s，上述抑制或增强作用可完全被取消。结论 DA对I ATP 的抑制作用可能是由于多巴胺受体激活后经G蛋白耦联使ATP(P2X)受体磷酸化所致。
关键词 多巴胺 P2X受体 全细胞膜片钳 脊髓背根神经节 胞内透析
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)11-0964-03
, http://www.100md.com
Modulation by dopamine of ATP receptor function in the
membrane of rat dorsal root ganglion neurons
Li Guohua，Wang Xinjun，Wang Xingwen，et al.
Combined Medical Functional Laboratory，Yunyang Medical College，Shiyan442000.
【Abstract】 Objective The purpose of the present study was to explore whether Dopamine modulates the reˉsponse mediated by ATP(P2X)receptors.Methods Experiments were performed on neurons freshly isolated from rat DRG using whole-cell patch clamp techniques.Results The majority of the neurons examined were responsive to ATP(89.5%，77/86)in the concentration range from10 -6 to10 -3 mol/L with an inward current showing obvious desensitization.In the77ATP-sensitive cells，preapplication of Dopamine for30sec could potentiated(28.6%，22/77)or attenuated(50.6%，39/77)I ATP in diverse subsets of cells，except that in a small proportion of the cells it had no effect(20.8%，16/77).Enhancive and inhibitory effects of Dopamine(10 -7 ～10 -3 mol/L)were dose dependent.By intracellular dialysis of GDP-β-s enhancive and inhibitory effects of Dopamine could be
, 百拇医药
completely abolished.Conclusion Suggesting these modulation might be outcomes of the phosphory action of ATP(P2X)receptor resulting from intracellular signaltransduction.
Key words dopamine P2X receptor whole-cell patch clamp dorsal root ganglion intracellular dialysis
已有研究资料表明ATP(P2X)受体广泛分布于多种组织中 [1]。1983年Krishtal等在背根神经节(DRG)细胞证实了ATP受体的存在 [2] ，此后，对有关DRG细胞膜ATP受体的药理学性质 [3] 、ATP-激活电流的离子机制 [4] 、受体激活的动力学特性 [5] 及其调制 [6，7] 等进行了多方面的研究。我室也曾报道过在DRG细胞ATP受体与其它受体间的相互作用 [8～10] 。资料表明:脊髓内的多巴胺(DA)能神经纤维起源于脑干All细胞群 [11] 。另有报道:脊髓后角内存在有高密度的DA受体和含DA的神经末梢 [12] 。有人在大鼠DRG神经元的细胞内记录证明:DA可引起60%的受检细胞去极化，另15%为超极化，17%为双向反应 [13] 。为了探讨存在于初级感觉神经元膜的ATP受体及DA受体之间是否具有相互作用，本文主要观察DA对I ATP 的调制作用并探讨其可能的机制。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
有关大鼠DRG神经元标本的分离方法及全细胞膜片钳记录技术参见另文 [8，14，15] 。全细胞膜片钳记录所用仪器为EZ-2400(日本Nihon Kohdon生产)。所充内液成分为(mmol/L):KCl140，CaCl 2 1，MgCl 2 2，HEPES10，EGTA11，ATP4。电极电阻2～4MΩ。灌流用外液成分(mmol/L):NaCl150，KCl5，CaCl 2 2.5，MgCl 2 1，HEPES10，D-glucose10。在电极与细胞膜之间形成高阻(1～5GΩ)封接后，进一步将膜吸穿，调节电容和串联电阻补偿。置保持电压(H.P.)于-60mV，膜电流应用低通滤波(10kHz，-3dB)，所得资料直接描记于笔录仪上。
所用药物为ATP(Sigma)、Dopamin(Sigma)用外液配制，GDP-β-s(RBI)用内液配制，pH调至7.4。给药系通过微操纵器移动自制的快速换液装置的排管进行，排管每管的直径(O.D/I.D)为0.5/0.3mm，管口距所记录的细胞100μm。实验中需进行药物胞内透析时，系通过插入玻璃微电极里的微管注入药物 [16] 。
, 百拇医药
实验数据用SPSS统计软件包行统计分析，实验结果以ˉx±s表示，显著性检验采用配对t检验，ATP浓度-效应曲线按照下列公式由SigmaPlot软件非线性回归拟合绘制。I=I max /[1+(EC 50 /C) n ]式中C为ATP浓度，I为标准化后的ATP激活电流值，I max 为标准化后的ATP激活电流最大值，EC 50 为ATP产生最大效应的半效浓度，n为Hill系数(由Hill图求出)。
2 结果
2.1 ATP-激活电流及DA-激活电流 实验共检测了86 个细胞，其中大多数(89.5%，77/86)对ATP敏感。I ATP 为内向电流，具有明显的去敏感现象和浓度依赖性(10 -6 ～10 -3 mol/L)，I ATP 的完全恢复时间约为5min。这些特点与我室以往实验所得结果基本一致 [8～10] 。本文在所检测的对ATP敏感的77个细胞中，观察到DA引起的膜反应如下:(1)外向电流(7.8%，6/77);(2)内向电流(26.0%，20/77);(3)无反应(66.2%，51/77)。与ATP激活的内向电流相比，DA激活的电流幅度较小，去敏感现象亦不明显。
, http://www.100md.com
2.2 DA对I ATP 的抑制作用 预加DA30s后，大部分受检细胞可观察到对I ATP 具有明显的抑制作用(50.6%，39/77)。此种抑制效应与预加的DA本身是否引起膜电流以及所引起的电流为内向或是外向均无关。换言之，在DA本身无论是引起外向、内向、或不引起电流三种情况下对I ATP 均可产生抑制。此种抑制效应与DA的浓度有关。由图1可以看出DA从10 -7 mol/L开始，随着浓度的增加，抑制作用逐渐增强，在10 -5 mol/L时到达峰值。此后浓度继续增大(10 -4 、10 -3 mol/L)，抑制作用反而有所减小，这可能是高浓度的非特异效应的缘故(图1)。
2.3 DA抑制I ATP 的浓度-效应关系 图2为预加10 -5 mol/L DA30s后对ATP(10 -6 ～10 -3 mol/L)激活电流抑制的量-效曲线，从图上可以看出:(1)DA+ATP量-效曲线与对照ATP量-效曲线相比明显下移;(2)预加DA后，I ATP 的最大幅值被抑制达42.3%;(3)预加DA前后I ATP 的Kd值相近，分别为1.25×10 -4 mol/L和1.45×10 -4 mol/L;(4)二者阈浓度(10 -6 mol/L)一致。
, http://www.100md.com
2.4 DA对I ATP 的增强作用 预加DA30s后，小部分受检细胞可观察到对I ATP 具有明显的增强作用(28.6%，22/77)。此种增强效应与预加的DA本身是否引起膜电流以及所引起的电流为内向或是外向均无关，且该增强效应与DA的浓度有关。由图3可以看出DA从10 -7mol/L开始，随着浓度的增加，增强作用逐渐加大，在10 -5 mol/L时达峰值。此后浓度继续增大(10 -4 、10 -3 mol/L)，抑制作用反而有所减小，亦可能是高浓度的非特异效应的缘故(图3)。
2.5 DA增强I ATP 的浓度-效应关系 图4为预加10 -5 mol/L DA30s后对ATP(10 -6 ～10 -3 mol/L)激活电流增强的量-效曲线，从图上可以看出:(1)DA+ATP量-效曲线与对照ATP量-效曲线相比明显上移;(2)预加DA后，I ATP 的最大幅值增加达40.7%;(3)预加DA前后I ATP 的Kd值相近，分别为1.26×10 -4 mol/L和1.22×10 -4 mol/L;(4)二者阈浓度(10 -6 mol/L)一致。
, http://www.100md.com
2.6 DA抑制或增强ATP-激活电流的胞内转导机制分析 使用胞内透析技术 [16] ，通过微电极向胞内注入200μmol/L GDP-β-s(一种非水解的GDP类似物)，观察到DA对ATP-激活电流的抑制作用及增强作用均可完全被取消，与对照记录相比差异非常明显。(图5:n=6，ˇ P<0.01， # P>0.5)(图6:n=3)。
3 讨论
本实验可以看出DA对I ATP 具有增强或抑制的双重调制作用。
由图1和图3可以看出DA从10 -7 mol/L开始，随着浓度的增加，对I ATP 抑制或增强作用逐渐加强，在10-5 mol/L时调制作用达到峰值。说明该双重调制作用与DA呈浓度依赖性。
由图2可以看出预加DA(10 -5 mol/L)后ATP-激活电流量-效曲线与对照组曲线相比，两者阈浓度一致，Kd值相近，而ATP最大浓度时电流幅值明显降低(42.3%)，DA+ATP曲线下移这提示DA对I ATP 的抑制作用为非竞争性抑制，即DA并非由于竞争性地作用于ATP受体激动剂结合位点的结果。
, http://www.100md.com
从图4可以看出预加DA(10 -5 mol/L)后ATP-激活电流量-效曲线与对照曲线相比，两条曲线示阈浓度及Kd值也非常接近，而ATP最大浓度时电流幅值明显增强(40.7%)，这提示DA对I ATP 的增强作用亦非竞争性作用。众所周知，ATP作为一种兴奋性神经递质/调质普遍存在于外周及中枢神经系统，本文中所讲的ATP受体系指P2X嘌呤受体而言，后者属配基门控离子通道(ligand-gated ion channel)。目前已经成功地克隆了P2X1～7亚基。其分子包含有M 1 和M 2 两个跨膜结构域，连接M 1 和M 2 之间的为胞外环，而N和C末端则位于胞内。受体主要为同聚性的，但也有异聚性的。其胞内磷酸化位点系位于C末端[17] ，目前，通过基因克隆已证明多巴胺有五种受体亚型(D 1 ～D 5 )，按其结构和功能可区分为D 1-样和D 2 -样受体，前者包括D 1 和D 5 ，后者包括D 2 、D 3 和D 4 。每一类型均具有不同的药理和生化特性 [18] 。多巴胺受体属G蛋白耦联受体，由于D 1 和D 2 经G蛋白耦联到腺苷酸环化酶(AC)的效应是相反的，D 1 引起胞内cAMP增高，而D 2 则为减少。另外已有资料证明 [19] ;D 1 -样受体激活还可通过G蛋白耦联到磷酸肌醇转导系统，使胞内IP3 和DAG的产生增加。从图5和图6可以看出，使用胞内透析技术，通过微电极向胞内注入G蛋白抑制剂GDP-β-s，观察到DA对ATP-激活电流的抑制作用及增强作用均可完全被取消，与对照记录相比差异非常明显。由此可以看出DA对I ATP 的抑制或增强作用应该是通过膜上的G蛋白信号转导途径实现的，DA与膜上不同的受体亚型(D 1 ～D 5 )结合，可能兴奋不同类型的G蛋白，通过不同的蛋白激酶系统影响ATP(P2X)受体磷酸化产生本实验中出现的双重调制作用。
, 百拇医药
ATP可以作用于伤害性感受器产生去极化，引起初级感觉神经元的痛觉传入;也可以作用于脊髓背角初级感觉神经元引起膜的内向电流或去极化反应，有助于初级感觉传入末梢部位使突触前抑制的产生。从本文结果可以推知:由脑干下行纤维而来的DA能神经元释放的DA与初级感觉神经元膜上不同的DA受体亚型结合，通过减弱或者增强ATP受体功能，对初级感觉传入信息可能发挥调制作用。
参考文献
1 Ralevic V，Burnstock G.Receptors for Purines and pyrimidines.Pharmaˉcol Rev，1998，50:413-492.
2 Krishtal OA，Marchenko SM，Pidoplichko VI.Receptor for ATP in the membrane of mammalian sensory neurons.Neurosci Lett，1983，35:41-45.
, http://www.100md.com
3 Krishtal OA，Marchenko SM.Pharmacological properties of the receptor for ATP in the sensory neurons of rats.Biomed Res，1986，7:79-81.4 Krishtal OA，Marchenko SM，Obukhov AG.Cationic channels activated by extracellular ATP in rat sensory neurons.Neurosci，1998，27:995-1000.
5 Bean BP.ATP-activated channels in rat and bullfog sensory neurons:concentration dependence and kinetics.J Neurosci，1990，10:1-10.
6 Ii C，Peoples RW，Li ZW，et al.Zn 2+ potentiates excitatory action of ATP on mammalian neurons.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90:8264-8267.
, 百拇医药
7 Ii C，Aguayo L，Peoples RW，et al.Ethanol inhibits a neuronal ATP-gated ion channel.Mol Pharmacol，1993，44871-44875.
8 Hu HZ，Li ZW.Substance P potentiates ATP-activated currents in rat primary sensory neurons.Brain Res，1996，739:163-168.
9 谷启海，李之望，樊友珍.缓激肽对大鼠背根神经节分离神经元ATP-激活电流的调制作用.生理学报，1998，50:37-42.
10 夏保芦，吴子桢，李肖，等.甲硫-脑啡肽对大鼠DRG分离神经元ATP激活内向电流的抑制.生理学报，2001，53:205-208.
, 百拇医药
11 Skagerberg G，Lindvall O.Organization of diencephalic dopamine neuˉrons projecting to the spinal cord in the rat.Brain Res，1985，342:340-351.
12 Scatton B，Dubioa A，Cudennec A.Autoradiographic localization of dopamine receptor in the spinal cord using 3 H-N-propylnocrapoˉmorphine.J Neural Transm，1984，59:251.
13 Molokanova EA，Tamarova ZA.The effect of dopamine and serotonin on rat dorsal root ganglion:an intracelluar study.Neuroscience，1995，65:859-867.
, 百拇医药
14 Hu HZ，Li ZW.Modulation by adenosine of GABA-activated current in rat dorsal root ganglion neurons.J Physiol，1997，501:67-75.
15 李国华，李之望，魏劲波，等.NPA抑制大鼠DRG分离神经元ATP-激活电流.郧阳医学院学报，2001，20(4):193-196.
16 李国华，李之望，王士端，等.通过膜片钳玻璃微电极内插管进行胞内透析.生理学报，2002，54(2):179-182.
17 North.RA，Surprenant A.Pharmacology of cloned P2X receptors.Annu Rev Pharmacol，2000，40:563-580.
18 Sokoloff P，Schwartz JC.Novel dopamine receptors half a decade later.Trans Pharmacol Sci，1995，16:270-275.
, 百拇医药
19 Wang H-Y，Undie AS，Friedman E.Evidence for the coupling of Gq protein to D1-like dopamine sites in rat striatum:possible role in dopamine-mediated inositol phosphate formation.Mol Pharmacol，1995，48:988-994.
基金项目:国家自然科学基金(No.39970240)、湖北省教育厅研究基金(2002X96)资助项目
作者单位:1 442000 湖北十堰郧阳医学院机能实验室
2 430030 武汉华中科技大学同济医学院实验医学研究中心
(收稿日期:2003-09-11)
(编辑 曲全), 百拇医药
关键词 多巴胺 P2X受体 全细胞膜片钳 脊髓背根神经节 胞内透析
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)11-0964-03
, http://www.100md.com
Modulation by dopamine of ATP receptor function in the
membrane of rat dorsal root ganglion neurons
Li Guohua，Wang Xinjun，Wang Xingwen，et al.
Combined Medical Functional Laboratory，Yunyang Medical College，Shiyan442000.
【Abstract】 Objective The purpose of the present study was to explore whether Dopamine modulates the reˉsponse mediated by ATP(P2X)receptors.Methods Experiments were performed on neurons freshly isolated from rat DRG using whole-cell patch clamp techniques.Results The majority of the neurons examined were responsive to ATP(89.5%，77/86)in the concentration range from10 -6 to10 -3 mol/L with an inward current showing obvious desensitization.In the77ATP-sensitive cells，preapplication of Dopamine for30sec could potentiated(28.6%，22/77)or attenuated(50.6%，39/77)I ATP in diverse subsets of cells，except that in a small proportion of the cells it had no effect(20.8%，16/77).Enhancive and inhibitory effects of Dopamine(10 -7 ～10 -3 mol/L)were dose dependent.By intracellular dialysis of GDP-β-s enhancive and inhibitory effects of Dopamine could be
, 百拇医药
completely abolished.Conclusion Suggesting these modulation might be outcomes of the phosphory action of ATP(P2X)receptor resulting from intracellular signaltransduction.
Key words dopamine P2X receptor whole-cell patch clamp dorsal root ganglion intracellular dialysis
已有研究资料表明ATP(P2X)受体广泛分布于多种组织中 [1]。1983年Krishtal等在背根神经节(DRG)细胞证实了ATP受体的存在 [2] ，此后，对有关DRG细胞膜ATP受体的药理学性质 [3] 、ATP-激活电流的离子机制 [4] 、受体激活的动力学特性 [5] 及其调制 [6，7] 等进行了多方面的研究。我室也曾报道过在DRG细胞ATP受体与其它受体间的相互作用 [8～10] 。资料表明:脊髓内的多巴胺(DA)能神经纤维起源于脑干All细胞群 [11] 。另有报道:脊髓后角内存在有高密度的DA受体和含DA的神经末梢 [12] 。有人在大鼠DRG神经元的细胞内记录证明:DA可引起60%的受检细胞去极化，另15%为超极化，17%为双向反应 [13] 。为了探讨存在于初级感觉神经元膜的ATP受体及DA受体之间是否具有相互作用，本文主要观察DA对I ATP 的调制作用并探讨其可能的机制。
, http://www.100md.com
1 材料与方法
有关大鼠DRG神经元标本的分离方法及全细胞膜片钳记录技术参见另文 [8，14，15] 。全细胞膜片钳记录所用仪器为EZ-2400(日本Nihon Kohdon生产)。所充内液成分为(mmol/L):KCl140，CaCl 2 1，MgCl 2 2，HEPES10，EGTA11，ATP4。电极电阻2～4MΩ。灌流用外液成分(mmol/L):NaCl150，KCl5，CaCl 2 2.5，MgCl 2 1，HEPES10，D-glucose10。在电极与细胞膜之间形成高阻(1～5GΩ)封接后，进一步将膜吸穿，调节电容和串联电阻补偿。置保持电压(H.P.)于-60mV，膜电流应用低通滤波(10kHz，-3dB)，所得资料直接描记于笔录仪上。
所用药物为ATP(Sigma)、Dopamin(Sigma)用外液配制，GDP-β-s(RBI)用内液配制，pH调至7.4。给药系通过微操纵器移动自制的快速换液装置的排管进行，排管每管的直径(O.D/I.D)为0.5/0.3mm，管口距所记录的细胞100μm。实验中需进行药物胞内透析时，系通过插入玻璃微电极里的微管注入药物 [16] 。
, 百拇医药
实验数据用SPSS统计软件包行统计分析，实验结果以ˉx±s表示，显著性检验采用配对t检验，ATP浓度-效应曲线按照下列公式由SigmaPlot软件非线性回归拟合绘制。I=I max /[1+(EC 50 /C) n ]式中C为ATP浓度，I为标准化后的ATP激活电流值，I max 为标准化后的ATP激活电流最大值，EC 50 为ATP产生最大效应的半效浓度，n为Hill系数(由Hill图求出)。
2 结果
2.1 ATP-激活电流及DA-激活电流 实验共检测了86 个细胞，其中大多数(89.5%，77/86)对ATP敏感。I ATP 为内向电流，具有明显的去敏感现象和浓度依赖性(10 -6 ～10 -3 mol/L)，I ATP 的完全恢复时间约为5min。这些特点与我室以往实验所得结果基本一致 [8～10] 。本文在所检测的对ATP敏感的77个细胞中，观察到DA引起的膜反应如下:(1)外向电流(7.8%，6/77);(2)内向电流(26.0%，20/77);(3)无反应(66.2%，51/77)。与ATP激活的内向电流相比，DA激活的电流幅度较小，去敏感现象亦不明显。
, http://www.100md.com
2.2 DA对I ATP 的抑制作用 预加DA30s后，大部分受检细胞可观察到对I ATP 具有明显的抑制作用(50.6%，39/77)。此种抑制效应与预加的DA本身是否引起膜电流以及所引起的电流为内向或是外向均无关。换言之，在DA本身无论是引起外向、内向、或不引起电流三种情况下对I ATP 均可产生抑制。此种抑制效应与DA的浓度有关。由图1可以看出DA从10 -7 mol/L开始，随着浓度的增加，抑制作用逐渐增强，在10 -5 mol/L时到达峰值。此后浓度继续增大(10 -4 、10 -3 mol/L)，抑制作用反而有所减小，这可能是高浓度的非特异效应的缘故(图1)。
2.3 DA抑制I ATP 的浓度-效应关系 图2为预加10 -5 mol/L DA30s后对ATP(10 -6 ～10 -3 mol/L)激活电流抑制的量-效曲线，从图上可以看出:(1)DA+ATP量-效曲线与对照ATP量-效曲线相比明显下移;(2)预加DA后，I ATP 的最大幅值被抑制达42.3%;(3)预加DA前后I ATP 的Kd值相近，分别为1.25×10 -4 mol/L和1.45×10 -4 mol/L;(4)二者阈浓度(10 -6 mol/L)一致。
, http://www.100md.com
2.4 DA对I ATP 的增强作用 预加DA30s后，小部分受检细胞可观察到对I ATP 具有明显的增强作用(28.6%，22/77)。此种增强效应与预加的DA本身是否引起膜电流以及所引起的电流为内向或是外向均无关，且该增强效应与DA的浓度有关。由图3可以看出DA从10 -7mol/L开始，随着浓度的增加，增强作用逐渐加大，在10 -5 mol/L时达峰值。此后浓度继续增大(10 -4 、10 -3 mol/L)，抑制作用反而有所减小，亦可能是高浓度的非特异效应的缘故(图3)。
2.5 DA增强I ATP 的浓度-效应关系 图4为预加10 -5 mol/L DA30s后对ATP(10 -6 ～10 -3 mol/L)激活电流增强的量-效曲线，从图上可以看出:(1)DA+ATP量-效曲线与对照ATP量-效曲线相比明显上移;(2)预加DA后，I ATP 的最大幅值增加达40.7%;(3)预加DA前后I ATP 的Kd值相近，分别为1.26×10 -4 mol/L和1.22×10 -4 mol/L;(4)二者阈浓度(10 -6 mol/L)一致。
, http://www.100md.com
2.6 DA抑制或增强ATP-激活电流的胞内转导机制分析 使用胞内透析技术 [16] ，通过微电极向胞内注入200μmol/L GDP-β-s(一种非水解的GDP类似物)，观察到DA对ATP-激活电流的抑制作用及增强作用均可完全被取消，与对照记录相比差异非常明显。(图5:n=6，ˇ P<0.01， # P>0.5)(图6:n=3)。
3 讨论
本实验可以看出DA对I ATP 具有增强或抑制的双重调制作用。
由图1和图3可以看出DA从10 -7 mol/L开始，随着浓度的增加，对I ATP 抑制或增强作用逐渐加强，在10-5 mol/L时调制作用达到峰值。说明该双重调制作用与DA呈浓度依赖性。
由图2可以看出预加DA(10 -5 mol/L)后ATP-激活电流量-效曲线与对照组曲线相比，两者阈浓度一致，Kd值相近，而ATP最大浓度时电流幅值明显降低(42.3%)，DA+ATP曲线下移这提示DA对I ATP 的抑制作用为非竞争性抑制，即DA并非由于竞争性地作用于ATP受体激动剂结合位点的结果。
, http://www.100md.com
从图4可以看出预加DA(10 -5 mol/L)后ATP-激活电流量-效曲线与对照曲线相比，两条曲线示阈浓度及Kd值也非常接近，而ATP最大浓度时电流幅值明显增强(40.7%)，这提示DA对I ATP 的增强作用亦非竞争性作用。众所周知，ATP作为一种兴奋性神经递质/调质普遍存在于外周及中枢神经系统，本文中所讲的ATP受体系指P2X嘌呤受体而言，后者属配基门控离子通道(ligand-gated ion channel)。目前已经成功地克隆了P2X1～7亚基。其分子包含有M 1 和M 2 两个跨膜结构域，连接M 1 和M 2 之间的为胞外环，而N和C末端则位于胞内。受体主要为同聚性的，但也有异聚性的。其胞内磷酸化位点系位于C末端[17] ，目前，通过基因克隆已证明多巴胺有五种受体亚型(D 1 ～D 5 )，按其结构和功能可区分为D 1-样和D 2 -样受体，前者包括D 1 和D 5 ，后者包括D 2 、D 3 和D 4 。每一类型均具有不同的药理和生化特性 [18] 。多巴胺受体属G蛋白耦联受体，由于D 1 和D 2 经G蛋白耦联到腺苷酸环化酶(AC)的效应是相反的，D 1 引起胞内cAMP增高，而D 2 则为减少。另外已有资料证明 [19] ;D 1 -样受体激活还可通过G蛋白耦联到磷酸肌醇转导系统，使胞内IP3 和DAG的产生增加。从图5和图6可以看出，使用胞内透析技术，通过微电极向胞内注入G蛋白抑制剂GDP-β-s，观察到DA对ATP-激活电流的抑制作用及增强作用均可完全被取消，与对照记录相比差异非常明显。由此可以看出DA对I ATP 的抑制或增强作用应该是通过膜上的G蛋白信号转导途径实现的，DA与膜上不同的受体亚型(D 1 ～D 5 )结合，可能兴奋不同类型的G蛋白，通过不同的蛋白激酶系统影响ATP(P2X)受体磷酸化产生本实验中出现的双重调制作用。
, 百拇医药
ATP可以作用于伤害性感受器产生去极化，引起初级感觉神经元的痛觉传入;也可以作用于脊髓背角初级感觉神经元引起膜的内向电流或去极化反应，有助于初级感觉传入末梢部位使突触前抑制的产生。从本文结果可以推知:由脑干下行纤维而来的DA能神经元释放的DA与初级感觉神经元膜上不同的DA受体亚型结合，通过减弱或者增强ATP受体功能，对初级感觉传入信息可能发挥调制作用。
参考文献
1 Ralevic V，Burnstock G.Receptors for Purines and pyrimidines.Pharmaˉcol Rev，1998，50:413-492.
2 Krishtal OA，Marchenko SM，Pidoplichko VI.Receptor for ATP in the membrane of mammalian sensory neurons.Neurosci Lett，1983，35:41-45.
, http://www.100md.com
3 Krishtal OA，Marchenko SM.Pharmacological properties of the receptor for ATP in the sensory neurons of rats.Biomed Res，1986，7:79-81.4 Krishtal OA，Marchenko SM，Obukhov AG.Cationic channels activated by extracellular ATP in rat sensory neurons.Neurosci，1998，27:995-1000.
5 Bean BP.ATP-activated channels in rat and bullfog sensory neurons:concentration dependence and kinetics.J Neurosci，1990，10:1-10.
6 Ii C，Peoples RW，Li ZW，et al.Zn 2+ potentiates excitatory action of ATP on mammalian neurons.Proc Natl Acad Sci USA，1993，90:8264-8267.
, 百拇医药
7 Ii C，Aguayo L，Peoples RW，et al.Ethanol inhibits a neuronal ATP-gated ion channel.Mol Pharmacol，1993，44871-44875.
8 Hu HZ，Li ZW.Substance P potentiates ATP-activated currents in rat primary sensory neurons.Brain Res，1996，739:163-168.
9 谷启海，李之望，樊友珍.缓激肽对大鼠背根神经节分离神经元ATP-激活电流的调制作用.生理学报，1998，50:37-42.
10 夏保芦，吴子桢，李肖，等.甲硫-脑啡肽对大鼠DRG分离神经元ATP激活内向电流的抑制.生理学报，2001，53:205-208.
, 百拇医药
11 Skagerberg G，Lindvall O.Organization of diencephalic dopamine neuˉrons projecting to the spinal cord in the rat.Brain Res，1985，342:340-351.
12 Scatton B，Dubioa A，Cudennec A.Autoradiographic localization of dopamine receptor in the spinal cord using 3 H-N-propylnocrapoˉmorphine.J Neural Transm，1984，59:251.
13 Molokanova EA，Tamarova ZA.The effect of dopamine and serotonin on rat dorsal root ganglion:an intracelluar study.Neuroscience，1995，65:859-867.
, 百拇医药
14 Hu HZ，Li ZW.Modulation by adenosine of GABA-activated current in rat dorsal root ganglion neurons.J Physiol，1997，501:67-75.
15 李国华，李之望，魏劲波，等.NPA抑制大鼠DRG分离神经元ATP-激活电流.郧阳医学院学报，2001，20(4):193-196.
16 李国华，李之望，王士端，等.通过膜片钳玻璃微电极内插管进行胞内透析.生理学报，2002，54(2):179-182.
17 North.RA，Surprenant A.Pharmacology of cloned P2X receptors.Annu Rev Pharmacol，2000，40:563-580.
18 Sokoloff P，Schwartz JC.Novel dopamine receptors half a decade later.Trans Pharmacol Sci，1995，16:270-275.
, 百拇医药
19 Wang H-Y，Undie AS，Friedman E.Evidence for the coupling of Gq protein to D1-like dopamine sites in rat striatum:possible role in dopamine-mediated inositol phosphate formation.Mol Pharmacol，1995，48:988-994.
基金项目:国家自然科学基金(No.39970240)、湖北省教育厅研究基金(2002X96)资助项目
作者单位:1 442000 湖北十堰郧阳医学院机能实验室
2 430030 武汉华中科技大学同济医学院实验医学研究中心
(收稿日期:2003-09-11)
(编辑 曲全), 百拇医药