大鼠脑组织mRNA在非洲爪蟾卵母细胞的表达———外源性GABA A 受体与内源性GABA A 和GABA B 受体的比较
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中华现代中西医杂志 2003年11月 第1卷 第10期
【摘要】 目的 本文利用在非洲爪蟾卵母细胞表达外源基因的技术，对比研究卵母细胞内源性GABA受体和表达的鼠脑GABA受体，为进一步进行递质与受体的研究奠定方法学基础。方法 实验采用Trazol试剂法及oligo-dt纤维素柱过柱法，从20只大鼠脑组织抽提多聚腺嘌呤mRNA，注入非洲爪蟾卵母细胞表达有功能的受体，并利用电压钳方法记录受体激活电流。结果 卵母细胞内源性GABA受体和表达的鼠脑GABA受体存在多方面的不同。结论 本实验建立的表达模型在研究递质与受体功能、结构、药理学特性等方面起到一定的参考作用。
关键词 卵母细胞 GABA受体 双电极电压钳
【文献标识码】 A 【文章编号】
Expression of mRNA from rat brain tissue in Xenopus oocytes
Nie Hui，Zhang Peihua，Wang Yubin，et al.
, 百拇医药
The Science and Technology University，Medicine College of Wuhan，Hubei430080.
【Abstract】 Objective To lay a methodological groundwork for studying the properties of transmitters and reˉceptors，this experiment aimed to compare the endogenous GABA receptors and exogenous GABA receptors from rat brain mRNA expression in Xenopus oocytes.Methods Poly(A)+mRNAs extracted from the brain tissue of twenty rats were microinjected into de folliculated Xenopus oocytes to express functional receptors，and voltage clamp recordˉing technique was used to record GABA-activated currents.Results The results were as follows:1)Different conˉcentrations of GABA evoked outward currents in follicular Xenopus oocytes without receiving microinjection;the curˉrents proved to be mediated by GABAb and GABAc receptors but not by GABAa recepter.2)Large，inward currents were evoked by different concentrations of GABA in those oocytes microinjected with mRNA from rat brain and were blocked by Bicuculline(a GABAa receptor antagonist).Conclusion The results suggest that there exist discrepancy between endogenous and expressed GABA receptors in oocytes in many aspects.The distinction between these two kinds of GABA recepters were compared and listed in a table.
, 百拇医药
Key words follicular Xenopus oocyte GABA receptor two-electrode voltage-clamp recording
非洲爪蟾卵母细胞是一种巨大细胞，直径可达1～1.2cm。自1971年Gurdon首先将兔的网织红细胞9SmRNA导入其中，成功地表达出珠蛋白后 [1] ，作为一种功能性表达系统，因其具有操作简单、易培养、表达稳定等优点，卵母细胞表达技术已被国外各实验室普遍应用 [2～4] 。我们的实验采用非洲爪蟾卵母细胞的受体移植法与双极电压钳技术相结合，研究大鼠脑组织mRNA表达的GABA受体的特性。
1 材料和方法
1.1 大鼠脑组织的取材 成年SD大鼠20只，2～3月龄，体重150～200g，雌雄不拘。击昏后断头，沿正中线剪开颅骨取出脑组织。用生理盐水小心冲净血液，去除结缔组织。
, 百拇医药
1.2 大鼠脑组织RNA抽提技术 (1)提取总RNA:提取总RNA采用Trazolo试剂法;(2)抽提mRNA:采用oligo-dt纤维素柱过柱法;制备的mRNA按实验要求使用一定量ddH 2 O溶解沉淀，-70℃或-20℃保存。
1.3 卵母细胞的准备及微量注射 雌性非洲爪蟾15只，购自上海中国科学院细胞生物所。冰浴麻醉后通过外科手术取卵母细胞，去膜后在解剖显微镜下每个细胞注射50nl mRNA，然后将其置于Barth’s孵育液19～20℃孵育48～72h。
1.4 电生理记录 卵母细胞置于容积0.5ml的浴槽内，2.0～2.5ml/min Ringer’s液灌流。电流电极灌充3MKCl，阻抗1～10MΩ，电压电极灌充0.15M KCl，阻抗10～100MΩ。电压钳指令电位由0～725C卵母细胞电压钳放大器产生并连接四道仪记录电流反应。实验所用GABA，bicuculline，baˉclofen用Ringer’s配制，bicuculline，baclofen均为美国Sigma公司生产，GABA购自上海第一制药公司。给药采用吸管直接浴槽加药的方式。
, 百拇医药
1.5 资料分析 实验数据用Excel进行统计分析，实验结果以均数±标准误(ˉx±s)来表示，显著性检验采用配对t检验，统计图使用SigmaPlot软件绘制。
2 结果
2.1 卵母细胞内源性GABA受体激活电流 带有滤泡膜的卵母细胞上存在着乙酰胆碱 [5]、儿茶酚胺 [6] 、多巴胺 [7] 、嘌呤等 [8，9] 多种内源性受体，但一直没有GABA受体的记录。最近，有人应用双电极电压钳技术在具有滤泡膜的非洲爪蟾卵母细胞上记录到了内源性GABA受体激活电流 [10] 。本次实验中，用于表达的细胞未去膜参照组上应用GABA可记录到外向电流，具有明显的浓度依赖性(n=6，图1)。此电流已被证明为GABA B和GABA C 受体激活所引起的 [10] 。
, 百拇医药 2.2 去除滤泡膜的卵母细胞膜上应用GABA 为排除爪蟾卵母细胞内源性受体激活电流的干扰，实验中首先对50个去膜注射经DEPC10 -3 M处理过的三蒸水的细胞进行激活电流的分析。结果发现应用10 -7 ，10 -6 ，10 -5 ，10 -4 ，10 -3 M GABA均记
录不到电流(n=50)，与报道基本一致。
2.3 表达的GABA受体激活电流的特点 在实验组注射鼠脑mRNA的卵母细胞膜上，GABA可诱导一幅值很大的内向电流，具有明显的浓度依赖性(图2)。此内向电流应用bicuculline(GABA A 受体的特异性拮抗剂)可基本被抑制(图3)。应用GABA B 受体激动剂baclofen则不能诱导电流反应。说明表达的GABA受体源于鼠脑mRNA主要为GABA A 受体。
图1 爪蟾卵母细胞滤泡膜的GABA激活电流 略
, 百拇医药
图2 表达的卵母细胞的GABA-诱导电流 略
图3 Bicuculline对GABA诱导电流的拮抗效应 略
3 讨论
γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统的一种主要抑制性神经递质。GABA受体分3种类型:GABA A ，CABA B ，CABA C 。GABA A 受体自身构成通道，激活后可引起Cl - 通道开启，使突触后膜产生IPSP，引起神经元放电抑制，而在初级感觉神经元或突触前末梢则引起膜的内向电流或去极化，即初级传入去极化(PAD)。GABA B 受体属于代谢型受体，通过与G蛋白耦联，可引起外向的K + (中枢神经系统) [11] 或Ca 2+ 离子流(外周神经系统) [12] ，并证明有抑制GABA A 受体介导的Cl - 离子流的作用 [13] (Bormmann，1988;Inoue etal，1986;)。GABA C 受体同样为配基门控氯通道，因此有人将其归为GABA A 受体。1984年Desamenien等人证明成年大鼠背根神经节细胞上GABA A 和GABA B 共存 [14] 。 1997年Si etal和Xi etal利用细胞内记录及全细胞膜片钳技术证实大鼠DRG神经元膜上GABA B 受体激活抑制GABA A 受体所介导的反应 [15] 。脑内有20%～30%的突触以GABA为递质，由于神经元的电生理记录比较困难，本实验采用卵母细胞上表达的方法研究鼠脑mRNA表达的GABA受体。实验发现表达的GABA受体激活电流表现出快速激活、快速失活的特点，可被bicuculline(GABA A 受体的特异性拮抗剂)阻断，不能被GABA B 受体激动剂baclofen模拟，提示主要为GABA A 受体。
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为进一步将其与卵母细胞膜内源性GABA受体区分，列表比较见表1。
mRNA在麦胚提取物、网织红细胞提取物以及被注射的爪蟾卵母细胞中都能有效地翻译成蛋白质，相比较而言卵母细胞表达系统操作简单、表达稳定，在研究神经递质受体和离子通道的结构、功能、理化特性及药理作用方面起到了很大作用。表达能否成功关键取决于mRNA的质量，即是否被蛋白质、DNA以及RNA酶污染降解。抽提的总RNA及纯化的mRNA可通过紫外分光光度计测A 260 /A 280 比值判断是否有蛋白质污染，本实验中测值为2.0，表明基本无污染。实验中要特别注意减少RNA的降解，由于RNA酶广泛存在，其活性很难完成控制，而且变性后易复性，因此抽提纯化时必须注意所用器具、药品的处理，保证无污染。
表1 略
我们实验的主要目的是建立组织mRNA在卵母细胞上表达的模型，为进一步研究各类受体的结构与功能打下基础，从实验结果上看达到了预期目的。
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参考文献
1 Gurdon J B，Lane c d，Wood H R，et al.Use of frog eggs and oocytes for the study of messager RNA and its translation in living cells.Nature(lond)，1971，233:177-182.
2 Dascal，N.The use of Xenopus oocytes for the study of ion channel.CBC Critical Reviews in Biochemistry，1987，22:317-387.
3 Qian H，Ripps H.Response kinetics and pharmacological properties of heteromeric receptors formed by coassembly of GABA rho-and gamma2-subunits.Proc R Soc Lond B Biol Sci，1999，266(1436):2419-2425.
, 百拇医药
4 Wolters M，Madeja M，Farrell AM，et al.Bacillus stearothermophilus lctB gene gives rise to functional K + channels in Escherichia coli and in Xenopus oocytes.Receptors Channels，1999，6(6):477-491.
5 Kassano k，Miledi R，Stinnakre J.Cholinergic and cate-cholaminergic receptors in the Xenopus oocytes membrane.J Physiol，1982，328:143-170.
6 Nara M，Dhulipala PD，Wang YX，et al.Reconstitution of beta-adrenˉergic modulation of large conductance，calcium-activated potassium(maxi-K)channels in Xenopus oocytes.Identification of the camp-dependent protein kinase phosphorylation site.J Biol Chem，1998，273(24):14920-14924.
, http://www.100md.com
7 Ni YG，Panicker MM，Miledi R.Efficient coupling of5-HTla receptors to the phospholipase C pathway in Xenopus oocytes.Brain Res Mol Brain Res，1997，51(1-2):115-122.
8 Lotan I，Dascal N，Cohen S，et al.ATP-evokde membrane resonses in Xenopus oocytes.Pflugers Arch，1986，406:158-162.
9 Ling BF，Wang S，Burnstock G.P2purinoceptor-activated currents in follicular oocytes of Xenopus laevis.J Physiol，1996，494:17-28.
, 百拇医药
10 Yang Qing(杨青)，Li Zhiwang(李之望)，Wei Jinbo(魏劲波).Curˉrent responses mediated by endogenous GABA B and GABA C receptors in Xenopus oocytes.Acta Physiologica Sinica，2001，53(4):311-315.
11 GU QB(顾全保)，Zhu H(朱辉)，LI W(李巍)，et al.The expression of kainate and GABA receptors in oocytes of Bufo bufo gargarizans.Acˉta Physiol Sin(生理学报)，1992，44(5):470-477.
12 Dutar P，Nicoll RA.A physiological role for GABA B receptors_in the central neurons system.Nature，1998，332:156-158.
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13 Dolphin AC，Scott RH.Comparison lf the action lf pocampus in vitro.J Physiol，1992，451:329-345.
14 Si JQ，Li ZW，Hu HZ，et al.Inhibitory effect of baclofen on GABA-induced depolarization and GABA-activated current in Primary Sensoˉry neurons.Neuroscience，1997，81:821-827.
15 Desarmenien M，Feltz P，Occhipinti G，et al.Coexistence of GABA A and GABA B recepters on Aδand Cprimary afferents.Br J Pharmac，1984，81:327-333.
作者单位:1 430080 武汉科技大学医学院
2 430030 华中科技大学同济医学院
(收稿日期:2003-09-03)
(编辑 李欣), 百拇医药(聂辉)
关键词 卵母细胞 GABA受体 双电极电压钳
【文献标识码】 A 【文章编号】
Expression of mRNA from rat brain tissue in Xenopus oocytes
Nie Hui，Zhang Peihua，Wang Yubin，et al.
, 百拇医药
The Science and Technology University，Medicine College of Wuhan，Hubei430080.
【Abstract】 Objective To lay a methodological groundwork for studying the properties of transmitters and reˉceptors，this experiment aimed to compare the endogenous GABA receptors and exogenous GABA receptors from rat brain mRNA expression in Xenopus oocytes.Methods Poly(A)+mRNAs extracted from the brain tissue of twenty rats were microinjected into de folliculated Xenopus oocytes to express functional receptors，and voltage clamp recordˉing technique was used to record GABA-activated currents.Results The results were as follows:1)Different conˉcentrations of GABA evoked outward currents in follicular Xenopus oocytes without receiving microinjection;the curˉrents proved to be mediated by GABAb and GABAc receptors but not by GABAa recepter.2)Large，inward currents were evoked by different concentrations of GABA in those oocytes microinjected with mRNA from rat brain and were blocked by Bicuculline(a GABAa receptor antagonist).Conclusion The results suggest that there exist discrepancy between endogenous and expressed GABA receptors in oocytes in many aspects.The distinction between these two kinds of GABA recepters were compared and listed in a table.
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Key words follicular Xenopus oocyte GABA receptor two-electrode voltage-clamp recording
非洲爪蟾卵母细胞是一种巨大细胞，直径可达1～1.2cm。自1971年Gurdon首先将兔的网织红细胞9SmRNA导入其中，成功地表达出珠蛋白后 [1] ，作为一种功能性表达系统，因其具有操作简单、易培养、表达稳定等优点，卵母细胞表达技术已被国外各实验室普遍应用 [2～4] 。我们的实验采用非洲爪蟾卵母细胞的受体移植法与双极电压钳技术相结合，研究大鼠脑组织mRNA表达的GABA受体的特性。
1 材料和方法
1.1 大鼠脑组织的取材 成年SD大鼠20只，2～3月龄，体重150～200g，雌雄不拘。击昏后断头，沿正中线剪开颅骨取出脑组织。用生理盐水小心冲净血液，去除结缔组织。
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1.2 大鼠脑组织RNA抽提技术 (1)提取总RNA:提取总RNA采用Trazolo试剂法;(2)抽提mRNA:采用oligo-dt纤维素柱过柱法;制备的mRNA按实验要求使用一定量ddH 2 O溶解沉淀，-70℃或-20℃保存。
1.3 卵母细胞的准备及微量注射 雌性非洲爪蟾15只，购自上海中国科学院细胞生物所。冰浴麻醉后通过外科手术取卵母细胞，去膜后在解剖显微镜下每个细胞注射50nl mRNA，然后将其置于Barth’s孵育液19～20℃孵育48～72h。
1.4 电生理记录 卵母细胞置于容积0.5ml的浴槽内，2.0～2.5ml/min Ringer’s液灌流。电流电极灌充3MKCl，阻抗1～10MΩ，电压电极灌充0.15M KCl，阻抗10～100MΩ。电压钳指令电位由0～725C卵母细胞电压钳放大器产生并连接四道仪记录电流反应。实验所用GABA，bicuculline，baˉclofen用Ringer’s配制，bicuculline，baclofen均为美国Sigma公司生产，GABA购自上海第一制药公司。给药采用吸管直接浴槽加药的方式。
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1.5 资料分析 实验数据用Excel进行统计分析，实验结果以均数±标准误(ˉx±s)来表示，显著性检验采用配对t检验，统计图使用SigmaPlot软件绘制。
2 结果
2.1 卵母细胞内源性GABA受体激活电流 带有滤泡膜的卵母细胞上存在着乙酰胆碱 [5]、儿茶酚胺 [6] 、多巴胺 [7] 、嘌呤等 [8，9] 多种内源性受体，但一直没有GABA受体的记录。最近，有人应用双电极电压钳技术在具有滤泡膜的非洲爪蟾卵母细胞上记录到了内源性GABA受体激活电流 [10] 。本次实验中，用于表达的细胞未去膜参照组上应用GABA可记录到外向电流，具有明显的浓度依赖性(n=6，图1)。此电流已被证明为GABA B和GABA C 受体激活所引起的 [10] 。
, 百拇医药 2.2 去除滤泡膜的卵母细胞膜上应用GABA 为排除爪蟾卵母细胞内源性受体激活电流的干扰，实验中首先对50个去膜注射经DEPC10 -3 M处理过的三蒸水的细胞进行激活电流的分析。结果发现应用10 -7 ，10 -6 ，10 -5 ，10 -4 ，10 -3 M GABA均记
录不到电流(n=50)，与报道基本一致。
2.3 表达的GABA受体激活电流的特点 在实验组注射鼠脑mRNA的卵母细胞膜上，GABA可诱导一幅值很大的内向电流，具有明显的浓度依赖性(图2)。此内向电流应用bicuculline(GABA A 受体的特异性拮抗剂)可基本被抑制(图3)。应用GABA B 受体激动剂baclofen则不能诱导电流反应。说明表达的GABA受体源于鼠脑mRNA主要为GABA A 受体。
图1 爪蟾卵母细胞滤泡膜的GABA激活电流 略
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图2 表达的卵母细胞的GABA-诱导电流 略
图3 Bicuculline对GABA诱导电流的拮抗效应 略
3 讨论
γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统的一种主要抑制性神经递质。GABA受体分3种类型:GABA A ，CABA B ，CABA C 。GABA A 受体自身构成通道，激活后可引起Cl - 通道开启，使突触后膜产生IPSP，引起神经元放电抑制，而在初级感觉神经元或突触前末梢则引起膜的内向电流或去极化，即初级传入去极化(PAD)。GABA B 受体属于代谢型受体，通过与G蛋白耦联，可引起外向的K + (中枢神经系统) [11] 或Ca 2+ 离子流(外周神经系统) [12] ，并证明有抑制GABA A 受体介导的Cl - 离子流的作用 [13] (Bormmann，1988;Inoue etal，1986;)。GABA C 受体同样为配基门控氯通道，因此有人将其归为GABA A 受体。1984年Desamenien等人证明成年大鼠背根神经节细胞上GABA A 和GABA B 共存 [14] 。 1997年Si etal和Xi etal利用细胞内记录及全细胞膜片钳技术证实大鼠DRG神经元膜上GABA B 受体激活抑制GABA A 受体所介导的反应 [15] 。脑内有20%～30%的突触以GABA为递质，由于神经元的电生理记录比较困难，本实验采用卵母细胞上表达的方法研究鼠脑mRNA表达的GABA受体。实验发现表达的GABA受体激活电流表现出快速激活、快速失活的特点，可被bicuculline(GABA A 受体的特异性拮抗剂)阻断，不能被GABA B 受体激动剂baclofen模拟，提示主要为GABA A 受体。
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为进一步将其与卵母细胞膜内源性GABA受体区分，列表比较见表1。
mRNA在麦胚提取物、网织红细胞提取物以及被注射的爪蟾卵母细胞中都能有效地翻译成蛋白质，相比较而言卵母细胞表达系统操作简单、表达稳定，在研究神经递质受体和离子通道的结构、功能、理化特性及药理作用方面起到了很大作用。表达能否成功关键取决于mRNA的质量，即是否被蛋白质、DNA以及RNA酶污染降解。抽提的总RNA及纯化的mRNA可通过紫外分光光度计测A 260 /A 280 比值判断是否有蛋白质污染，本实验中测值为2.0，表明基本无污染。实验中要特别注意减少RNA的降解，由于RNA酶广泛存在，其活性很难完成控制，而且变性后易复性，因此抽提纯化时必须注意所用器具、药品的处理，保证无污染。
表1 略
我们实验的主要目的是建立组织mRNA在卵母细胞上表达的模型，为进一步研究各类受体的结构与功能打下基础，从实验结果上看达到了预期目的。
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参考文献
1 Gurdon J B，Lane c d，Wood H R，et al.Use of frog eggs and oocytes for the study of messager RNA and its translation in living cells.Nature(lond)，1971，233:177-182.
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12 Dutar P，Nicoll RA.A physiological role for GABA B receptors_in the central neurons system.Nature，1998，332:156-158.
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14 Si JQ，Li ZW，Hu HZ，et al.Inhibitory effect of baclofen on GABA-induced depolarization and GABA-activated current in Primary Sensoˉry neurons.Neuroscience，1997，81:821-827.
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作者单位:1 430080 武汉科技大学医学院
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(收稿日期:2003-09-03)
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