复方中药制剂对脑缺血模型大鼠血小板聚集影响的实验研究
【摘要】 目的 探讨银杏叶提取物与水蛭素在抗血小板聚集上的协同作用。方法 将银杏叶提取物与水蛭素按2:25(mg/ml)的比例制成无菌注射液，分组经静脉注入脑缺血模型大鼠体内，并用生理盐水和水蛭素作为对照组，分别于6h后采血制备PRP与PPP，与ADP为诱导剂，用比浊法测定血小板聚集率。结果 复方中药制剂不同剂量组以及水蛭素均能降低血小板聚集率，延长血小板最大聚集率发生时间(P<0.01);复方制剂大剂量组的抗血小板聚集作用明显强于水蛭素组(P<0.01)。结论 银杏叶提取物与水蛭素在抗血小板聚集上具有一定的协同作用。
关键词 银杏叶 水蛭素 血小板 聚集率 大鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)11-0964-02
Experimental study of influence of the Chinese traditional medicine compound on blood platelet agglutination in model of rat ischemic cerebral infarction
, 百拇医药
Zhang Yongshun，Liu Jianqing，Guo Guoji
Emergency Treatment Center，Dong-guan Municipal Hu-Men Hospital，Guangdong523902.
【Abstract】 Objective To discuss cooperation of distillation of gingko leaf and hirudin on antiplatelet agglutiˉnation.Methods To execute asepsis injection liquid with distillation of gingko leaf and hirudin according to2:25(mg/ml).And inject it into ischemic cerebral infarction rat’s body from vein by grouping，and to take physiology salt solution and hirudin for contrasts，to pick blood respectively and prepare PRP and PPP，to determine quotient of anˉtiplatelet agglutination with nephelometery by revulsant ADP.Results All different dosage of the compound agent groups and hirudin can reduce the quotient of platelet conglomeration，and prolong time of maximum quotient of platelet conglomeration occurred(P<0.01);the inhibitory action on antiplatelet agglutination of the compound agent group in high dose is strong than group of hirudin obviously(P<0.01).Conclusion Distillation of gingko leaf and hirudin on antiplatelet agglutination have definite cooperating action on antiplatelet agglutination.
, http://www.100md.com
Key words gingko leaf hirudin platelet agglutination rat
缺血性脑血管病在临床上非常常见，由于本病死亡率和致残率都很高，严重危害着中老年人的生命和生活质量。因此，寻找有效的药物及时治疗缺血性脑血管病，已是当今医学界普遍关注的问题之一，如何选择适当的中药，合理组方，制成一定的剂型，使之在溶栓、抗凝、改善脑循环，抗自由基、保护脑细胞等功效上具有协同效应，也是未来中医治疗缺血性脑血管病的研究方向。为此，本文选择中药银杏叶和水蛭，对其有效成分在抗凝方面的协同性进行了初步探讨，现报道如下。
1 材料
1.1 药品 银杏叶提取物、水蛭素均由华中科技大学同济药学院药化实验室提供，将二者按2:25(mg/ml)的比例，加入一定的辅料和增溶剂，配成一定量的无菌注射溶液供实验用。
, http://www.100md.com 1.2 动物 健康Wistar大鼠，280±20g、雄性，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
1.3 试剂与器械 10%水合氯醛，ADP(Sigma产品)，3.8%枸橼酸钠液，水蛭素(配成8mg/ml无菌液)，手术剪，止血钳，动脉夹，直镊，弯头镊，缝合线，直径3mm尼龙线，LBY-NJ 2 全自动四通道血小板聚集仪(北京普利生仪器中心)，硅化离心管，微量移液器(10μl、20μl)，离心机等。
2 方法 [1，2]
2.1 分组 取Wistar雄性大鼠30只、体重280±20g，随机分成5组、每组6只，即生理盐水对照组、复方制剂注射液组、水蛭素组(8mg/kg)。其中复方制剂组分为低剂量L组(1ml/kg)、中等剂量M组(2ml/kg)、大剂量H组(4ml/kg)。
2.2 制备脑缺血模型及采血 大鼠称重，10%水合氯醛0.3～0.4ml/100mg腹腔内注射，麻醉后仰卧位，四肢固定于手术台上，颈部备皮并消毒后做正中皮肤切口，钝性分离皮下组织、浅深肌肉，分别暴露并游离出颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉、翼腭动脉，分别结扎颈外动脉、翼腭动脉及颈总动脉近心端;在颈总动脉靠近颈外动脉与颈内动脉分叉处剪一小口将直径3mm的尼龙线经小口沿颈内动脉方向插入颅内，深度约17～20mm，至大脑中动脉处，将尼龙线连同血管一起结扎，剪去多余的尼龙线，制成脑缺血模型;同时各组均采用颈外静脉给药，6h后断头取血3ml，放入有枸橼酸钠抗凝剂的硅化离心管中(血与抗凝剂比例为9:1);用塑料膜封闭离心管口，将离心管倾倒3次，使血液与抗凝剂充分混匀，用滤纸擦去管壁上残留的血液，加盖备用。
, 百拇医药
2.3 制备PRP与PPP 将上述血标本以800r/min离心10min，用微量移液器小心取出上清液，得富血小板血浆即PRP。余下血标本以3000r/min离心15min，用微量移液器小心取出上清液，得贫血小板血浆即PPP，留作空白对照用。
2.4 比浊法测定血小板聚集率 取PRP与PPP各50μml，分别置于比浊管内，以ADP(0.5μmol/L)为诱导剂，37℃环 境中按“全自动血小板聚集仪说明书”测定方法测定血小板聚集率。
2.5 统计学处理 实验数据以X±s表示，用F检验进行组间差异性比较，P<0.05为显著性标准。
3 结果与结论
实验结果见表1。
表1 各组对由ADP诱导的大鼠急性脑缺血模型血小板聚集率的影响(略)
, 百拇医药
从表1可以看出，生理盐水组血小板聚集率明显高于用药组。银杏提取物与水蛭素组成的复方制剂不同剂量组以及水蛭素皆能降低血小板聚集率，延长血小板最大聚集率发生时间。从1min、3min、5min血小板聚集率来看，用药组血小板最大聚集时间相对延长，而且用药组血小板具有解聚快的特点，尤以高剂量组最明显。实验表明:复方制剂大剂量用药组的抗血小板聚集作用明显强于单用水蛭素组，而中等剂量和低剂量组的抗血小板聚集作用，与水蛭素组相比无明显差异。提示:银杏叶提取物与水蛭素在抗血小板聚集作用上可能具有协同作用，二者联合应用可以提高水蛭素的抗凝血作用。
4 讨论
水蛭和银杏在我国医学的药物应用上虽然均具有悠久的历史，但只是近些年来人们才对其有了更深刻的了解和认识。目前已知水蛭素是一种单链环肽化合物，相对分子量为7000道尔顿，是目前发现的抗凝作用最强，出血等副作用最小的抗凝物质 [3，4] 。银杏叶的有效成分银杏内酯是天然、高效、专一的血小板激活因子(PAF)受体拮抗剂，具有抗凝、降低血粘度、改善微循环的作用 [5～7] 。有关单用水蛭素和银杏叶抗凝血和治疗脑缺血的报道很多，但是二者的协同性研究尚未见报道。本文设计并研究这一复方制 剂，目的是为以后复方制剂的开发与应用提供理论依据和实验方法，本实验初步证实，银杏叶提取物可以增强水蛭素的抗凝血活性，但是二者以多大比例混合才能得到最大的抗凝效果，以及其抗凝的量效关系，有待进一步的研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 翟晓强.黄芪、水蛭、地龙不同配伍治疗缺血性中风实验研究.山东中医药大学学报，2000，30(9):662.
2 王晓明，吴岩，李亚珍，等.水蛭注射液对大鼠血小板聚集和血栓形成的影响.中成药，1998，20(4):27.
3 Arkwardt F.The development of hirudin as an antithrombotic drug.Thrombosis Research，1994，74(1):1.
4 Thurieau C，Simonet S，Paladino J，et al.New N 2 -guanidinobenzoyl derivatives of hirudin54～65containing stabilized carboxyl or phosohoˉryl groups on the side chain of phenylalanine-63.J Med Chem，1994，37(50):625.
, 百拇医药
5 徐江平，芮耀成.银杏叶提取物对脑血管病防治作用的研究进展.国外医学·老年医学分册，1999，20(5):200.
6 章剑今，王敏，余逸波.银杏叶抗血栓及改善微循环作用的实验研究.中国中西医结合杂志，1995，16(5):320.
7 马怡，黑爱莲，金有豫，等.银杏叶注射液对实验性大鼠局灶性脑缺血的保护作用.首都医科大学学报，1999，20(1):21.
(收稿日期:2003-06-05)
作者单位：1523902广东省东莞市虎门医院脑中风急救治疗中心
2华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科
(编辑一 坤), 百拇医药(张永顺)
关键词 银杏叶 水蛭素 血小板 聚集率 大鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-077X(2003)11-0964-02
Experimental study of influence of the Chinese traditional medicine compound on blood platelet agglutination in model of rat ischemic cerebral infarction
, 百拇医药
Zhang Yongshun，Liu Jianqing，Guo Guoji
Emergency Treatment Center，Dong-guan Municipal Hu-Men Hospital，Guangdong523902.
【Abstract】 Objective To discuss cooperation of distillation of gingko leaf and hirudin on antiplatelet agglutiˉnation.Methods To execute asepsis injection liquid with distillation of gingko leaf and hirudin according to2:25(mg/ml).And inject it into ischemic cerebral infarction rat’s body from vein by grouping，and to take physiology salt solution and hirudin for contrasts，to pick blood respectively and prepare PRP and PPP，to determine quotient of anˉtiplatelet agglutination with nephelometery by revulsant ADP.Results All different dosage of the compound agent groups and hirudin can reduce the quotient of platelet conglomeration，and prolong time of maximum quotient of platelet conglomeration occurred(P<0.01);the inhibitory action on antiplatelet agglutination of the compound agent group in high dose is strong than group of hirudin obviously(P<0.01).Conclusion Distillation of gingko leaf and hirudin on antiplatelet agglutination have definite cooperating action on antiplatelet agglutination.
, http://www.100md.com
Key words gingko leaf hirudin platelet agglutination rat
缺血性脑血管病在临床上非常常见，由于本病死亡率和致残率都很高，严重危害着中老年人的生命和生活质量。因此，寻找有效的药物及时治疗缺血性脑血管病，已是当今医学界普遍关注的问题之一，如何选择适当的中药，合理组方，制成一定的剂型，使之在溶栓、抗凝、改善脑循环，抗自由基、保护脑细胞等功效上具有协同效应，也是未来中医治疗缺血性脑血管病的研究方向。为此，本文选择中药银杏叶和水蛭，对其有效成分在抗凝方面的协同性进行了初步探讨，现报道如下。
1 材料
1.1 药品 银杏叶提取物、水蛭素均由华中科技大学同济药学院药化实验室提供，将二者按2:25(mg/ml)的比例，加入一定的辅料和增溶剂，配成一定量的无菌注射溶液供实验用。
, http://www.100md.com 1.2 动物 健康Wistar大鼠，280±20g、雄性，华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。
1.3 试剂与器械 10%水合氯醛，ADP(Sigma产品)，3.8%枸橼酸钠液，水蛭素(配成8mg/ml无菌液)，手术剪，止血钳，动脉夹，直镊，弯头镊，缝合线，直径3mm尼龙线，LBY-NJ 2 全自动四通道血小板聚集仪(北京普利生仪器中心)，硅化离心管，微量移液器(10μl、20μl)，离心机等。
2 方法 [1，2]
2.1 分组 取Wistar雄性大鼠30只、体重280±20g，随机分成5组、每组6只，即生理盐水对照组、复方制剂注射液组、水蛭素组(8mg/kg)。其中复方制剂组分为低剂量L组(1ml/kg)、中等剂量M组(2ml/kg)、大剂量H组(4ml/kg)。
2.2 制备脑缺血模型及采血 大鼠称重，10%水合氯醛0.3～0.4ml/100mg腹腔内注射，麻醉后仰卧位，四肢固定于手术台上，颈部备皮并消毒后做正中皮肤切口，钝性分离皮下组织、浅深肌肉，分别暴露并游离出颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉、翼腭动脉，分别结扎颈外动脉、翼腭动脉及颈总动脉近心端;在颈总动脉靠近颈外动脉与颈内动脉分叉处剪一小口将直径3mm的尼龙线经小口沿颈内动脉方向插入颅内，深度约17～20mm，至大脑中动脉处，将尼龙线连同血管一起结扎，剪去多余的尼龙线，制成脑缺血模型;同时各组均采用颈外静脉给药，6h后断头取血3ml，放入有枸橼酸钠抗凝剂的硅化离心管中(血与抗凝剂比例为9:1);用塑料膜封闭离心管口，将离心管倾倒3次，使血液与抗凝剂充分混匀，用滤纸擦去管壁上残留的血液，加盖备用。
, 百拇医药
2.3 制备PRP与PPP 将上述血标本以800r/min离心10min，用微量移液器小心取出上清液，得富血小板血浆即PRP。余下血标本以3000r/min离心15min，用微量移液器小心取出上清液，得贫血小板血浆即PPP，留作空白对照用。
2.4 比浊法测定血小板聚集率 取PRP与PPP各50μml，分别置于比浊管内，以ADP(0.5μmol/L)为诱导剂，37℃环 境中按“全自动血小板聚集仪说明书”测定方法测定血小板聚集率。
2.5 统计学处理 实验数据以X±s表示，用F检验进行组间差异性比较，P<0.05为显著性标准。
3 结果与结论
实验结果见表1。
表1 各组对由ADP诱导的大鼠急性脑缺血模型血小板聚集率的影响(略)
, 百拇医药
从表1可以看出，生理盐水组血小板聚集率明显高于用药组。银杏提取物与水蛭素组成的复方制剂不同剂量组以及水蛭素皆能降低血小板聚集率，延长血小板最大聚集率发生时间。从1min、3min、5min血小板聚集率来看，用药组血小板最大聚集时间相对延长，而且用药组血小板具有解聚快的特点，尤以高剂量组最明显。实验表明:复方制剂大剂量用药组的抗血小板聚集作用明显强于单用水蛭素组，而中等剂量和低剂量组的抗血小板聚集作用，与水蛭素组相比无明显差异。提示:银杏叶提取物与水蛭素在抗血小板聚集作用上可能具有协同作用，二者联合应用可以提高水蛭素的抗凝血作用。
4 讨论
水蛭和银杏在我国医学的药物应用上虽然均具有悠久的历史，但只是近些年来人们才对其有了更深刻的了解和认识。目前已知水蛭素是一种单链环肽化合物，相对分子量为7000道尔顿，是目前发现的抗凝作用最强，出血等副作用最小的抗凝物质 [3，4] 。银杏叶的有效成分银杏内酯是天然、高效、专一的血小板激活因子(PAF)受体拮抗剂，具有抗凝、降低血粘度、改善微循环的作用 [5～7] 。有关单用水蛭素和银杏叶抗凝血和治疗脑缺血的报道很多，但是二者的协同性研究尚未见报道。本文设计并研究这一复方制 剂，目的是为以后复方制剂的开发与应用提供理论依据和实验方法，本实验初步证实，银杏叶提取物可以增强水蛭素的抗凝血活性，但是二者以多大比例混合才能得到最大的抗凝效果，以及其抗凝的量效关系，有待进一步的研究。
, http://www.100md.com
参考文献
1 翟晓强.黄芪、水蛭、地龙不同配伍治疗缺血性中风实验研究.山东中医药大学学报，2000，30(9):662.
2 王晓明，吴岩，李亚珍，等.水蛭注射液对大鼠血小板聚集和血栓形成的影响.中成药，1998，20(4):27.
3 Arkwardt F.The development of hirudin as an antithrombotic drug.Thrombosis Research，1994，74(1):1.
4 Thurieau C，Simonet S，Paladino J，et al.New N 2 -guanidinobenzoyl derivatives of hirudin54～65containing stabilized carboxyl or phosohoˉryl groups on the side chain of phenylalanine-63.J Med Chem，1994，37(50):625.
, 百拇医药
5 徐江平，芮耀成.银杏叶提取物对脑血管病防治作用的研究进展.国外医学·老年医学分册，1999，20(5):200.
6 章剑今，王敏，余逸波.银杏叶抗血栓及改善微循环作用的实验研究.中国中西医结合杂志，1995，16(5):320.
7 马怡，黑爱莲，金有豫，等.银杏叶注射液对实验性大鼠局灶性脑缺血的保护作用.首都医科大学学报，1999，20(1):21.
(收稿日期:2003-06-05)
作者单位：1523902广东省东莞市虎门医院脑中风急救治疗中心
2华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科
(编辑一 坤), 百拇医药(张永顺)