阿魏酸钠对缺血预处理后大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用
【摘要】 目的 探讨阿魏酸钠联合缺血预处理对脑缺血再灌注损伤的保护作用。方法采用四血管阻断法复制大鼠全脑缺血模型，动物随机分为非缺血对照组，缺血对照组，缺血预处理组和阿魏酸钠联合缺血预处理组，采用尼氏染色和TUNEL染色法观察阿魏酸钠联合脑缺血预处理在脑缺血再灌注时对皮层和海马CA1区神经元数及凋亡细胞数的影响。结果 缺血对照组缺血6h大脑皮层及海马CA1区出现少量凋亡细胞，缺血12h凋亡细胞逐渐增多，至2天时达高峰，缺血后7天神经元大量丢失;缺血预处理组各时点凋亡细胞数明显低于缺血对照组，缺血后7天神经元无明显丢失;阿魏酸钠联合缺血预处理组各个时点凋亡细胞数较缺血对照组及缺血预处理组均显著减少，缺血后7天神经元无明显丢失。结论 阿魏酸钠联合缺血预处理可显著抑制缺血区神经细胞凋亡，加强脑缺血再灌注损伤的保护作用。
关键词 脑缺血 阿魏酸钠 缺血预处理 细胞凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)11-1608-02
, 百拇医药
Protective effects of sodium ferulate on global ischemic
reperfusion injury following cerebral ischemic-preconditioning
Deng Zhifeng，Li Ming，Wang Yang，et al.
Department of Neurosurgery，the Second Affiliated Hospital of Jiangxi Medical College，Nanchang 330006.
【Abstract】 Objective To study the protective effects of sodium ferulate(SF)combined with global cerebral ischemic preconditioning on cerebral ischemic reperfusion injury of rats.Methods Global cerebral ischemic was inˉduced in rats by four-vessel occlusion.All rats were divided randomly into sham group，cerebral ischemic group，isˉchemic preconditioning group and sodium ferulate combined with ischemic-preconditioning group.Nissl staining and terminal deoxynucleotidy 1transferase(TdT)-mediated dUTP nick end-labeling(TUNEL)were used to count the numbers of alive neuron and apoptosis in the cortex and hippocampal CA1of rats.Results In cerebral ischemic group，there were few apoptosis at6hours after global cerebral ischemic，nevertheless after12hour of global ischemic there were afew apoptosis in cortex and hippocampus CA1region，then after48hours of global ischemic the quantity of apoptosis arrived peak.The apoptotic cells in ischemic preconditioning group at various moment were less signifiˉcantly than those of animals in cerebral ischemic group.The apoptotic cells in sodium ferulate combined with ischemic-preconditioning group at various moment were less significantly than those of animals in cerebral ischemic group and ischemic preconditioning group.Conclusion Sodium ferulate combined with ischemic preconditioning can suppress the apoptosis in cortex and hippocampal CA1region induced by global ischemic，and produce the better neuronal proˉtection.
, 百拇医药
Key words cerebral ischemic sodium ferulate ischemic preconditioning apoptosis
阿魏酸钠(sodium ferulate，SF)为桂皮酸类化合物，具有清除和抑制氧自由基、抗脂质过氧化作用 [1] 。一次或多次短暂亚致死性脑缺血预处理可以诱导脑组织产生缺血耐受，从而对其后较严重的脑缺血产生保护作用。研究显示单纯应用缺血预处理或阿魏酸钠均能减少缺血后的神经元凋亡的发生 [2，3] ，但两者联合应用能否加强缺血再灌注脑损伤的保护作用尚不清楚。本实验采用阿魏酸钠联合脑缺血预处理，观察两者联合应用对缺血再灌注脑损伤的保护效果。
1 材料与方法
1.1 实验动物与试剂 雄性Wistar大鼠85只(江西医学院实验动物科学部提供)，体重250～300g。原位细胞凋亡检测试剂盒(美国Promega公司)。
, 百拇医药
1.2 方法 参照Pulsinell四血管阻断法 [4] 复制大鼠全脑缺血模型。大鼠随机分为四组:(1)非缺血对照组(10只):仅结扎双侧椎动脉而不夹闭双侧颈总动脉。(2)缺血对照组(25只):结扎双侧椎动脉48h，夹闭颈总动脉10min。(3)缺血预处理组(25只):结扎双侧椎动脉48h，夹闭颈总动脉2min后24h再次夹闭颈总动脉10min;(4)阿魏酸钠联合缺血预处理组(SF+缺血预处理组25只):缺血预处理后，再次夹闭颈总动脉前30min，尾静脉注射阿魏酸钠(200mg/kg)。非缺血对照组分为再灌注后2、7天二个亚组(各5只);缺血对照组、缺血预处理组及阿魏酸钠联合缺血预处理组又分为再灌注后6、12、24h、2天、7天五个亚组(各5只)。各组在相应时点将大鼠断头取脑，于视交叉后2.2mm切取冠状脑片，厚约3mm。标本常规石蜡包埋，连续横形切片，HE染色。甲苯胺蓝染色法对各7天亚组进行尼氏染色。原位末端脱氧核苷酸(TdT)标记法(TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)检测神经元凋亡，阳性细胞为胞核呈棕褐色。图像分析仪上以×40物镜下取5个视野分别计数神经元和凋亡细胞数。
, 百拇医药
1.3 统计学处理 所有数据均以ˉx±s表示，采用SPSS10.0软件分析，组间比较采用q检验。
2 结果
2.1 HE、尼氏染色结果 非缺血对照组、缺血预处理组和阿魏酸钠联合缺血预处理组在缺血2天、7天时大脑皮层及海马CA1区神经元排列整齐，细胞核明显，核仁清楚，尼氏小体丰富，海马结构正常;三组各时点神经元计数无显著变化。缺血对照组在缺血7天时，皮层及海马CA1区神经元数显著减少，神经元结构基本正常，海马区神经元排列散乱，失去正常海马结构，有少量胶质细胞增生。各组神经元计数结果见表1。
表1 各组大脑皮层及海马CA1神经元计数结果 (略)
2.2 神经元凋亡检测结果 缺血对照组缺血6h大脑皮层及海马CA1区出现少量凋亡细胞，缺血12h凋亡细胞逐渐增多，至2天时达高峰，凋亡细胞主要分布于皮层和海马CA1区。缺血预处理组，缺血6h，大脑皮层偶见凋亡细胞，海马CA1区未见凋亡细胞;缺血12h，大脑皮层及海马CA1区出现少量凋亡细胞，至2天时凋亡细胞数达到最高，但各时点凋亡细胞数明显低于缺血对照组。阿魏酸钠联合缺血预处理组在各个时点凋亡细胞数较缺血对照组及缺血预处理组均显著减少。结果见表2。
, 百拇医药
表2 各组大脑皮层及海马CA1区TUNEL 阳性细胞计数结果 (略)
3 讨论
缺血性脑卒中是中枢神经系统最常见的脑血管疾病，占全部脑血管病的43%～65%。在脑缺血造成的脑损害中，细胞凋亡起着十分重要的作用。研究发现亚致死性全脑缺血(缺血5～10min)中，细胞的丢失以凋亡为主 [5] 。脑缺血预处理是指脑组织预先短暂缺血后，诱导脑组织产生内源性保护机制，使之在一定程度上免受或减轻再次发生的缺血性脑损伤。脑缺血再灌注后产生大量的氧自由基(ROS)是引起缺血性脑损伤的重要因素，ROS可导致细胞内过氧化还原状态的失衡，诱导某些基因的表达引起细胞凋亡;ROS很容易与生物大分子反应，可直接损伤或通过一系列过氧化链式反应引起广泛生物结构的破坏 [6] 。应用转基因技术使细胞内过氧化物酶高表达，清除氧自由基，可明显减轻缺血性脑损伤 [7] 。因此，采用自由基清除剂可能保护细胞而减少细胞凋亡的发生。阿魏酸钠为桂皮酸类化合物，是中药当归及川芎的有效成分。生化药理学研究已经证明阿魏酸钠具有清除和抑制氧自由基的作用。章建军等 [3] 观察到阿魏酸钠可在一定程度上抑制脑缺血再灌注引起的细胞凋亡。本研究通过TUNEL法和尼氏染色法观察了缺血后不同时相点皮层及海马CA1区神经元凋亡细胞数和神经元存活数，实验结果显示全脑缺血10min可通过诱导缺血区神经元凋亡，导致缺血后7天神经元的大量丢失;缺血预处理通过一定程度上减少缺血区神经元的凋亡，在缺血后7天内提供明确的神经元保护作用;阿魏酸钠联合缺血预处理在缺血后48h内几乎能防止神经元凋亡的发生，并且在其后的一段时间内(7天内)未见神经元明显丢失。结果提示阿魏酸钠联合缺血预处理较单纯应用缺血预处理或阿魏酸钠可更有效地减少缺血再灌注后细胞凋亡，加强缺血再灌注损伤的保护作用。这对缺血性脑卒中的防治具有一定的指导意义。笔者将对阿魏酸钠联合缺血预处理对神经元的长期保护效应及保护机制作进一步深入探讨。
, 百拇医药
参考文献
1 靖会，姚凌云，李教社，等.国内阿魏酸钠的药理学研究进展.西北药学杂志，2002，17(5):216-218.
2 章建军，阮旭中，张苏明，等.阿魏酸钠对脑缺血大鼠海马CA1区神经元凋亡的影响.中国临床神经科学，1998，6(3):125-128.
3 王锷，郭曲练，谭秀娟，等.大鼠脑缺血预处理神经细胞凋亡的研究.中华麻醉学杂志，2000，20(7):423-425.
4 Pulsinelli WA，Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric isˉchemia
in the unanesthetized rat.Stroke，1979，10:267-272.
, http://www.100md.com
5 raham SH，Chen J.Programmed cell death in cerebral ischemia.J Cereb Blood FlowMetab，2001，21:99-109.
6 Lemasters JJ，Nieminen AL，Qina T，et al.The mitochondrial permeabiliˉty transition in cell death:a common mechanism in necrosis，apoptosis and autophagy.
Biochim Biophys Acta，1998，1366(1-2):177-196.
7 Murakami K，Kondo T，Epstein CJ，et al.Overexpression of CuZn-suˉperoxide dismutase reduces hippocampal injury after global ischemia in transgenic mice.Stroke，1996，28:1797-1804.
基金项目:江西省自然科学基金(编号0040037)
作者单位:1 330006江西医学院第二附属医院神经外科
2 江西医学院生理学教研室
3 江西医学院泌尿外科研究所
(编辑 曲全), 百拇医药(邓志锋)
关键词 脑缺血 阿魏酸钠 缺血预处理 细胞凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)11-1608-02
, 百拇医药
Protective effects of sodium ferulate on global ischemic
reperfusion injury following cerebral ischemic-preconditioning
Deng Zhifeng，Li Ming，Wang Yang，et al.
Department of Neurosurgery，the Second Affiliated Hospital of Jiangxi Medical College，Nanchang 330006.
【Abstract】 Objective To study the protective effects of sodium ferulate(SF)combined with global cerebral ischemic preconditioning on cerebral ischemic reperfusion injury of rats.Methods Global cerebral ischemic was inˉduced in rats by four-vessel occlusion.All rats were divided randomly into sham group，cerebral ischemic group，isˉchemic preconditioning group and sodium ferulate combined with ischemic-preconditioning group.Nissl staining and terminal deoxynucleotidy 1transferase(TdT)-mediated dUTP nick end-labeling(TUNEL)were used to count the numbers of alive neuron and apoptosis in the cortex and hippocampal CA1of rats.Results In cerebral ischemic group，there were few apoptosis at6hours after global cerebral ischemic，nevertheless after12hour of global ischemic there were afew apoptosis in cortex and hippocampus CA1region，then after48hours of global ischemic the quantity of apoptosis arrived peak.The apoptotic cells in ischemic preconditioning group at various moment were less signifiˉcantly than those of animals in cerebral ischemic group.The apoptotic cells in sodium ferulate combined with ischemic-preconditioning group at various moment were less significantly than those of animals in cerebral ischemic group and ischemic preconditioning group.Conclusion Sodium ferulate combined with ischemic preconditioning can suppress the apoptosis in cortex and hippocampal CA1region induced by global ischemic，and produce the better neuronal proˉtection.
, 百拇医药
Key words cerebral ischemic sodium ferulate ischemic preconditioning apoptosis
阿魏酸钠(sodium ferulate，SF)为桂皮酸类化合物，具有清除和抑制氧自由基、抗脂质过氧化作用 [1] 。一次或多次短暂亚致死性脑缺血预处理可以诱导脑组织产生缺血耐受，从而对其后较严重的脑缺血产生保护作用。研究显示单纯应用缺血预处理或阿魏酸钠均能减少缺血后的神经元凋亡的发生 [2，3] ，但两者联合应用能否加强缺血再灌注脑损伤的保护作用尚不清楚。本实验采用阿魏酸钠联合脑缺血预处理，观察两者联合应用对缺血再灌注脑损伤的保护效果。
1 材料与方法
1.1 实验动物与试剂 雄性Wistar大鼠85只(江西医学院实验动物科学部提供)，体重250～300g。原位细胞凋亡检测试剂盒(美国Promega公司)。
, 百拇医药
1.2 方法 参照Pulsinell四血管阻断法 [4] 复制大鼠全脑缺血模型。大鼠随机分为四组:(1)非缺血对照组(10只):仅结扎双侧椎动脉而不夹闭双侧颈总动脉。(2)缺血对照组(25只):结扎双侧椎动脉48h，夹闭颈总动脉10min。(3)缺血预处理组(25只):结扎双侧椎动脉48h，夹闭颈总动脉2min后24h再次夹闭颈总动脉10min;(4)阿魏酸钠联合缺血预处理组(SF+缺血预处理组25只):缺血预处理后，再次夹闭颈总动脉前30min，尾静脉注射阿魏酸钠(200mg/kg)。非缺血对照组分为再灌注后2、7天二个亚组(各5只);缺血对照组、缺血预处理组及阿魏酸钠联合缺血预处理组又分为再灌注后6、12、24h、2天、7天五个亚组(各5只)。各组在相应时点将大鼠断头取脑，于视交叉后2.2mm切取冠状脑片，厚约3mm。标本常规石蜡包埋，连续横形切片，HE染色。甲苯胺蓝染色法对各7天亚组进行尼氏染色。原位末端脱氧核苷酸(TdT)标记法(TdT mediated dUTP nick end labeling，TUNEL)检测神经元凋亡，阳性细胞为胞核呈棕褐色。图像分析仪上以×40物镜下取5个视野分别计数神经元和凋亡细胞数。
, 百拇医药
1.3 统计学处理 所有数据均以ˉx±s表示，采用SPSS10.0软件分析，组间比较采用q检验。
2 结果
2.1 HE、尼氏染色结果 非缺血对照组、缺血预处理组和阿魏酸钠联合缺血预处理组在缺血2天、7天时大脑皮层及海马CA1区神经元排列整齐，细胞核明显，核仁清楚，尼氏小体丰富，海马结构正常;三组各时点神经元计数无显著变化。缺血对照组在缺血7天时，皮层及海马CA1区神经元数显著减少，神经元结构基本正常，海马区神经元排列散乱，失去正常海马结构，有少量胶质细胞增生。各组神经元计数结果见表1。
表1 各组大脑皮层及海马CA1神经元计数结果 (略)
2.2 神经元凋亡检测结果 缺血对照组缺血6h大脑皮层及海马CA1区出现少量凋亡细胞，缺血12h凋亡细胞逐渐增多，至2天时达高峰，凋亡细胞主要分布于皮层和海马CA1区。缺血预处理组，缺血6h，大脑皮层偶见凋亡细胞，海马CA1区未见凋亡细胞;缺血12h，大脑皮层及海马CA1区出现少量凋亡细胞，至2天时凋亡细胞数达到最高，但各时点凋亡细胞数明显低于缺血对照组。阿魏酸钠联合缺血预处理组在各个时点凋亡细胞数较缺血对照组及缺血预处理组均显著减少。结果见表2。
, 百拇医药
表2 各组大脑皮层及海马CA1区TUNEL 阳性细胞计数结果 (略)
3 讨论
缺血性脑卒中是中枢神经系统最常见的脑血管疾病，占全部脑血管病的43%～65%。在脑缺血造成的脑损害中，细胞凋亡起着十分重要的作用。研究发现亚致死性全脑缺血(缺血5～10min)中，细胞的丢失以凋亡为主 [5] 。脑缺血预处理是指脑组织预先短暂缺血后，诱导脑组织产生内源性保护机制，使之在一定程度上免受或减轻再次发生的缺血性脑损伤。脑缺血再灌注后产生大量的氧自由基(ROS)是引起缺血性脑损伤的重要因素，ROS可导致细胞内过氧化还原状态的失衡，诱导某些基因的表达引起细胞凋亡;ROS很容易与生物大分子反应，可直接损伤或通过一系列过氧化链式反应引起广泛生物结构的破坏 [6] 。应用转基因技术使细胞内过氧化物酶高表达，清除氧自由基，可明显减轻缺血性脑损伤 [7] 。因此，采用自由基清除剂可能保护细胞而减少细胞凋亡的发生。阿魏酸钠为桂皮酸类化合物，是中药当归及川芎的有效成分。生化药理学研究已经证明阿魏酸钠具有清除和抑制氧自由基的作用。章建军等 [3] 观察到阿魏酸钠可在一定程度上抑制脑缺血再灌注引起的细胞凋亡。本研究通过TUNEL法和尼氏染色法观察了缺血后不同时相点皮层及海马CA1区神经元凋亡细胞数和神经元存活数，实验结果显示全脑缺血10min可通过诱导缺血区神经元凋亡，导致缺血后7天神经元的大量丢失;缺血预处理通过一定程度上减少缺血区神经元的凋亡，在缺血后7天内提供明确的神经元保护作用;阿魏酸钠联合缺血预处理在缺血后48h内几乎能防止神经元凋亡的发生，并且在其后的一段时间内(7天内)未见神经元明显丢失。结果提示阿魏酸钠联合缺血预处理较单纯应用缺血预处理或阿魏酸钠可更有效地减少缺血再灌注后细胞凋亡，加强缺血再灌注损伤的保护作用。这对缺血性脑卒中的防治具有一定的指导意义。笔者将对阿魏酸钠联合缺血预处理对神经元的长期保护效应及保护机制作进一步深入探讨。
, 百拇医药
参考文献
1 靖会，姚凌云，李教社，等.国内阿魏酸钠的药理学研究进展.西北药学杂志，2002，17(5):216-218.
2 章建军，阮旭中，张苏明，等.阿魏酸钠对脑缺血大鼠海马CA1区神经元凋亡的影响.中国临床神经科学，1998，6(3):125-128.
3 王锷，郭曲练，谭秀娟，等.大鼠脑缺血预处理神经细胞凋亡的研究.中华麻醉学杂志，2000，20(7):423-425.
4 Pulsinelli WA，Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric isˉchemia
in the unanesthetized rat.Stroke，1979，10:267-272.
, http://www.100md.com
5 raham SH，Chen J.Programmed cell death in cerebral ischemia.J Cereb Blood FlowMetab，2001，21:99-109.
6 Lemasters JJ，Nieminen AL，Qina T，et al.The mitochondrial permeabiliˉty transition in cell death:a common mechanism in necrosis，apoptosis and autophagy.
Biochim Biophys Acta，1998，1366(1-2):177-196.
7 Murakami K，Kondo T，Epstein CJ，et al.Overexpression of CuZn-suˉperoxide dismutase reduces hippocampal injury after global ischemia in transgenic mice.Stroke，1996，28:1797-1804.
基金项目:江西省自然科学基金(编号0040037)
作者单位:1 330006江西医学院第二附属医院神经外科
2 江西医学院生理学教研室
3 江西医学院泌尿外科研究所
(编辑 曲全), 百拇医药(邓志锋)