小剂量苦参碱诱导K562细胞凋亡的研究
【摘要】 目的 研究小剂量苦参碱对白血病细胞K562的凋亡诱导作用。方法 利用小剂量苦参碱对白血病细胞K562进行凋亡诱导实验，通过细胞形态学观察、细胞周期分析、流式细胞仪及凋亡细胞检测试剂盒检测凋亡细胞。结果 0.3g/L浓度苦参碱作用K562细胞5～7天，细胞呈现出凋亡的形态学特征，细胞周期受阻于G 1 期，亚二倍体细胞数随作用时间延长而增加，凋亡细胞试剂盒检测出凋亡细胞。结论 小剂量苦参碱可诱导白血病细胞K562凋亡，苦参碱有可能成为新的高效白血病治疗药物。
关键词 苦参碱 白血病 K562细胞 凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)12-1768-03
Study on apoptosis of leukaemia cell
K562 induced by small dose of matrine
, 百拇医药
Zhang Yongqing，Huang Gaosheng，Cao Yunxin，et al.
Department of Haematology，the Fourth Military Medical University，Xi’an 710032.
【Abstract】 Objective To study the effect of small dose of matrine on apoptotic induction of leukaemia cell K562.Methods Leukaemia cells K562were induced apoptosis by matrine in the concentration of0.3g/L.The apopˉtosis model was analysed by study of morphology，cell cycle phases，fluorescence activated cell analyser(FACS)and DNA Fragmentation Assay Kit.Results Apoptosis of K562cells were induced by5～7d exposure to0.3g/L maˉtrine.The number of sub G 1 phase increased in a time-dependent manner.Apoptotic cells was found by DNA Fragˉmentation Assay Kit in K562cells by7d exposure to matrine.Conclusion Small dose of matrine can induce leukaemia cells of K562apoptosis，marine may be a high potency apoptosis inducer of myeloid leukaemia cells.
, http://www.100md.com
Key words matrine leukaemia K562cell apoptosis
诱导白血病细胞凋亡是当今治疗白血病的主要策略之一。目前，白血病细胞凋亡诱导剂仍以砷等重金属制剂为主，其对白血病细胞虽有较强的凋亡诱导作用，但显而易见的毒副作用使患者很难长期坚持治疗。苦参碱是从槐类植物中分离出的一种生物碱 [1] ，有研究发现大剂量苦参碱(1g/L)可快速诱导白血病细胞凋亡 [2] ，但缺乏系统研究，且随着剂量增大苦参碱毒副作用会随之增大。为此，我们用小剂量苦参碱(0.3g/L)进行诱导白血病K562细胞凋亡实验，以期发现更适合临床应用的白血病细胞凋亡诱导剂。现将研究结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 急性髓系白血病细胞株K562购自美国ATCC公司，苦参碱标准品由中国生物制品、药品检定所提供，用RPMI1640培养基配制成浓度为30g/L苦参碱溶液，于-20℃保存备用。所用AnnexinV-FITC kit为法国IMˉMUNOTECH公司产品，程序性细胞死亡检测试剂盒(Apoalert DNA Fragmentation Assay Kit)为Clontech公司产品。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养 K562细胞接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，于37℃、饱和湿度、5%二氧化碳孵箱中常规培养，每3天换液、传代一次。
1.2.2 诱导凋亡方法 将增长至对数期K562细胞分别调节至1×10 5 /ml，分设实验组与对照组(每组3瓶细胞，实验所得数据用均数±标准差表示)，在实验组细胞悬液中加入苦参碱溶液至作用浓度为0.3g/L，对照组细胞只加等体积含10%小牛血清的RPMI1640培养液，置37℃、饱和湿度、5%二氧化碳孵箱中培养7天。
1.2.3 证实细胞凋亡方法 光镜、电镜观察细胞形态变化，Hoechst33258染色荧光显微镜观察凋亡细胞、流式细胞仪分析细胞周期改变、Annexin V FITC染色流式细胞仪检测诱导前后凋亡细胞数、程序性细胞死亡检测试剂盒检测凋亡细胞。
, 百拇医药
2 结果
苦参碱诱导K562细胞第5天，细胞开始抱团生长，部分细胞有出芽现象，可见细胞碎片。第7天，实验组细胞呈“葡萄串”样生长，细胞碎片及出芽细胞显著增多。电镜下观察到了凋亡早期细胞“出芽”及凋亡晚期细胞核固缩及凋亡小体形成等不同时期凋亡细胞的典型形态学特征(图1)。苦参碱诱导K562细胞7天，G 1 期细胞由(23.2±3.3)%增加至(48.7±3.7)%(P<0.05);分别取诱导第1、3、5、7天细胞，流式细胞仪检测亚G 1 期细胞数分别为(2.5±1.8)%，(5.8±2.3)%，(16.5±5.3)%，(28.8±5.6)%(后两组高于前两组，P<0.05)(图2)。
Hoechst33258染色显示，对照组细胞呈均匀蓝色荧光，形态完整;苦参碱诱导组细胞胞核呈明亮蓝色荧光，可见胞核浓聚、碎裂，胞浆仍为蓝色，形态不规则，在离心力作用下，部分细胞胞体破碎、变形(图3)
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经Annexin V染色，流式细胞仪检测，K562细胞对照组、诱导第3、5、7天凋亡细胞数为(2.2±0.5)%，(9.3±3.2)%，(23.5±5.1)%，(48.6±7.6)%(分别见图4A，4B，4C，4D，各组间差异有显著性P<0.05)。
苦参碱诱导7d后K562细胞，经凋亡细胞检测试剂盒检测出凋亡细胞及凋亡小体，而在对照组细胞未测出(见图5)。
图2 苦参碱作用不同时间组K562亚G 1 期细胞数比例略
图4 流式细胞仪检测K562细胞凋亡略
3 讨论
凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程，伴有典型的细胞形态和生化改变。凋亡是机体某种细胞数量保持平衡的重要机制。白血病发病机制虽不十分清楚，但凋亡障碍是各类白血病的共性。因此，诱导白血病细胞凋亡是治疗白血病的主要措施之一。目前，临床应用较多的凋亡诱导剂仍是砷制剂，不仅毒副作用大，且仅对部分类型的髓系白血病效果较好。最近研究发现，锑制剂亦具有较强的诱导白血病细胞凋亡作用 [3] ，但它们均为重金属制剂，明显的毒副作用使得临床很难推广应用。因此，当务之急是研发出高效、低毒的白血病细胞凋亡诱导剂。
, 百拇医药
苦参碱是一种生物碱，因为其具有保肝、抗炎药效 [4] ，作为一种保肝、抗病毒药物已在临床普遍使用，证实在一定剂量下无明显毒副作用。临床及实验研究表明，苦参碱还能通过抑制肿瘤增殖 [5] ，限制肿瘤细胞转移 [6] ，促进肿瘤细胞凋亡 [7] 等多机制起到抗肿瘤作用。张百红等 [8] 发现30mg/L浓度苦参碱可诱导肝癌细胞系SMMC-7211细胞凋亡。但关于苦参碱引起白血病细胞凋亡的报道甚少。最近张彦等 [2] 用1g/L浓度苦参碱诱导K562细胞，24h即发现细胞凋亡的形态学改变，但未进一步系统研究，且随苦参碱剂量增大其毒副作用可能会增加。然而更小剂量的苦参碱能否诱导白血病细胞凋亡，目前尚无定论。本研究结果显示，0.3g/L浓度苦参碱作用K562细胞5天，细胞形态学上表现为抱团生长、出芽，并有细胞碎片出现。诱导第7天，细胞呈“葡萄串”样生长。电镜观察到了处于不同凋亡时期细胞的典型形态学特征。目前，检测凋亡细胞的方法有很多，但 对培养细胞凋亡进行的定性和定量的检测方法中，最佳的选择是流式细胞仪 [8] 。流式细胞仪检测发现，苦参碱诱导K562细胞第5～7天，亚G 1 期细胞数显著增多，细胞受阻于G 1 期。细胞周期受阻后细胞一般退出增殖周期，走向以下两途径:凋亡与分化。通过Annexin V FITC染色流式细胞仪分析及Hoechst33258染色结果进一步证实苦参碱可诱导白血病K562细胞退出增殖周期，走向凋亡。为了证实<0.3g/Lg剂量苦参碱能否继续诱导K562细胞凋亡，同步进行了0.2g/L、0.1g/L浓度的苦参碱的诱导K562细胞7天实验，发现0.2g/L浓度苦参碱以诱导K562细胞分化为主，同时伴有凋亡，0.1g/L只诱导K562细胞分化不能诱导其凋亡(待发表资料)。所以，0.3g/L浓度苦参碱可能是诱导白血病细胞凋亡的最适浓度。
, 百拇医药
有学者发现，苦参碱诱导胃腺癌细胞系凋亡，仍因抑制BCL-2表达下调有关 [9] ，而这一途径在苦参碱诱导其它肿瘤细胞凋亡中是否具有普遍性，有待进一步证实。另外，在用同一浓度苦参碱诱导急性淋巴母细胞白血病细胞系JM7天的实验中，未发现细胞凋亡现象。以上结果提示，苦参碱诱导肿瘤细胞凋亡可能与肿瘤细胞的起源及类型有关，0.3g/L浓度苦参碱能诱导髓系白血病细胞K562凋亡，苦参碱可能是髓系白血病细胞的高效能凋亡诱导剂。
(本文图1、3、5略)
参考文献
1 Lai JP，He XW，Jiang Y，et al.Preparative separation and determination of
matrine from the Chinese medicinal plant Sophora flavescens Ait by molecularly imprinted solid-phase extraction.Anal Bioanal Chem，2003，375(2):264-269.
, 百拇医药
2 张彦，蒋纪恺，刘小珊，等.苦参碱诱导K562白血病细胞分化和凋亡的实验研究.中华血液学杂志，1999，20(6):315-316.
3 于文强，孙秉中，柴玉波，等.三氧化二砷诱导急性早幼粒细胞白血病细胞凋亡的研究.细胞与分子免疫学杂志，2002，18(6):592-594
4 Zhu XH，Qiu YD，Shi MK.et al.Effect of matrine on cold ischemia and reperfusion injury of sinusoidal endothelial cells in rat orthotopic liver transplantation.Acta Pharmacol Sin，2003，24(2):169-174.
5 司维可，尚桃元，康格非.苦参碱对人肝癌HepG2的细胞形态影响和相关增殖因素的变化.第三军医大学学报，2000，22(6):553-556.
, http://www.100md.com
6 林洪生，李树奇，裴迎霞，等.川芎嗪苦参碱对癌细胞与内皮细胞粘附及粘附因子表达的影响.中国新药杂志，1999，8(6):384-386.
7 陈伟忠，林勇，谢渭芬.苦参碱抗肿瘤机制的研究进展.肿瘤学杂志，2002，8(1):4-6.
8 彭黎明，王会礼.细胞凋亡的基础与临床.北京:人民卫生出版社，2000，16-26.
9 张百红，岳红去，李新民，等.苦参碱对胃腺癌细胞SGC-7901BCL-2表达的影响.中国肿瘤临床与康复，2000，7(3):34-35.
基金项目:国家自然科学基金资助课题(No.30171186)
作者单位:1 710032西安第四军医大学西京医院血液科
2 第四军医大学病理学教研室
3 第四军医大学免疫学教研室
(编辑 李年令), http://www.100md.com(张永清)
关键词 苦参碱 白血病 K562细胞 凋亡
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)12-1768-03
Study on apoptosis of leukaemia cell
K562 induced by small dose of matrine
, 百拇医药
Zhang Yongqing，Huang Gaosheng，Cao Yunxin，et al.
Department of Haematology，the Fourth Military Medical University，Xi’an 710032.
【Abstract】 Objective To study the effect of small dose of matrine on apoptotic induction of leukaemia cell K562.Methods Leukaemia cells K562were induced apoptosis by matrine in the concentration of0.3g/L.The apopˉtosis model was analysed by study of morphology，cell cycle phases，fluorescence activated cell analyser(FACS)and DNA Fragmentation Assay Kit.Results Apoptosis of K562cells were induced by5～7d exposure to0.3g/L maˉtrine.The number of sub G 1 phase increased in a time-dependent manner.Apoptotic cells was found by DNA Fragˉmentation Assay Kit in K562cells by7d exposure to matrine.Conclusion Small dose of matrine can induce leukaemia cells of K562apoptosis，marine may be a high potency apoptosis inducer of myeloid leukaemia cells.
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Key words matrine leukaemia K562cell apoptosis
诱导白血病细胞凋亡是当今治疗白血病的主要策略之一。目前，白血病细胞凋亡诱导剂仍以砷等重金属制剂为主，其对白血病细胞虽有较强的凋亡诱导作用，但显而易见的毒副作用使患者很难长期坚持治疗。苦参碱是从槐类植物中分离出的一种生物碱 [1] ，有研究发现大剂量苦参碱(1g/L)可快速诱导白血病细胞凋亡 [2] ，但缺乏系统研究，且随着剂量增大苦参碱毒副作用会随之增大。为此，我们用小剂量苦参碱(0.3g/L)进行诱导白血病K562细胞凋亡实验，以期发现更适合临床应用的白血病细胞凋亡诱导剂。现将研究结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料 急性髓系白血病细胞株K562购自美国ATCC公司，苦参碱标准品由中国生物制品、药品检定所提供，用RPMI1640培养基配制成浓度为30g/L苦参碱溶液，于-20℃保存备用。所用AnnexinV-FITC kit为法国IMˉMUNOTECH公司产品，程序性细胞死亡检测试剂盒(Apoalert DNA Fragmentation Assay Kit)为Clontech公司产品。
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1.2 方法
1.2.1 细胞培养 K562细胞接种于含10%小牛血清的RPMI1640培养基中，于37℃、饱和湿度、5%二氧化碳孵箱中常规培养，每3天换液、传代一次。
1.2.2 诱导凋亡方法 将增长至对数期K562细胞分别调节至1×10 5 /ml，分设实验组与对照组(每组3瓶细胞，实验所得数据用均数±标准差表示)，在实验组细胞悬液中加入苦参碱溶液至作用浓度为0.3g/L，对照组细胞只加等体积含10%小牛血清的RPMI1640培养液，置37℃、饱和湿度、5%二氧化碳孵箱中培养7天。
1.2.3 证实细胞凋亡方法 光镜、电镜观察细胞形态变化，Hoechst33258染色荧光显微镜观察凋亡细胞、流式细胞仪分析细胞周期改变、Annexin V FITC染色流式细胞仪检测诱导前后凋亡细胞数、程序性细胞死亡检测试剂盒检测凋亡细胞。
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2 结果
苦参碱诱导K562细胞第5天，细胞开始抱团生长，部分细胞有出芽现象，可见细胞碎片。第7天，实验组细胞呈“葡萄串”样生长，细胞碎片及出芽细胞显著增多。电镜下观察到了凋亡早期细胞“出芽”及凋亡晚期细胞核固缩及凋亡小体形成等不同时期凋亡细胞的典型形态学特征(图1)。苦参碱诱导K562细胞7天，G 1 期细胞由(23.2±3.3)%增加至(48.7±3.7)%(P<0.05);分别取诱导第1、3、5、7天细胞，流式细胞仪检测亚G 1 期细胞数分别为(2.5±1.8)%，(5.8±2.3)%，(16.5±5.3)%，(28.8±5.6)%(后两组高于前两组，P<0.05)(图2)。
Hoechst33258染色显示，对照组细胞呈均匀蓝色荧光，形态完整;苦参碱诱导组细胞胞核呈明亮蓝色荧光，可见胞核浓聚、碎裂，胞浆仍为蓝色，形态不规则，在离心力作用下，部分细胞胞体破碎、变形(图3)
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经Annexin V染色，流式细胞仪检测，K562细胞对照组、诱导第3、5、7天凋亡细胞数为(2.2±0.5)%，(9.3±3.2)%，(23.5±5.1)%，(48.6±7.6)%(分别见图4A，4B，4C，4D，各组间差异有显著性P<0.05)。
苦参碱诱导7d后K562细胞，经凋亡细胞检测试剂盒检测出凋亡细胞及凋亡小体，而在对照组细胞未测出(见图5)。
图2 苦参碱作用不同时间组K562亚G 1 期细胞数比例略
图4 流式细胞仪检测K562细胞凋亡略
3 讨论
凋亡是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程，伴有典型的细胞形态和生化改变。凋亡是机体某种细胞数量保持平衡的重要机制。白血病发病机制虽不十分清楚，但凋亡障碍是各类白血病的共性。因此，诱导白血病细胞凋亡是治疗白血病的主要措施之一。目前，临床应用较多的凋亡诱导剂仍是砷制剂，不仅毒副作用大，且仅对部分类型的髓系白血病效果较好。最近研究发现，锑制剂亦具有较强的诱导白血病细胞凋亡作用 [3] ，但它们均为重金属制剂，明显的毒副作用使得临床很难推广应用。因此，当务之急是研发出高效、低毒的白血病细胞凋亡诱导剂。
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苦参碱是一种生物碱，因为其具有保肝、抗炎药效 [4] ，作为一种保肝、抗病毒药物已在临床普遍使用，证实在一定剂量下无明显毒副作用。临床及实验研究表明，苦参碱还能通过抑制肿瘤增殖 [5] ，限制肿瘤细胞转移 [6] ，促进肿瘤细胞凋亡 [7] 等多机制起到抗肿瘤作用。张百红等 [8] 发现30mg/L浓度苦参碱可诱导肝癌细胞系SMMC-7211细胞凋亡。但关于苦参碱引起白血病细胞凋亡的报道甚少。最近张彦等 [2] 用1g/L浓度苦参碱诱导K562细胞，24h即发现细胞凋亡的形态学改变，但未进一步系统研究，且随苦参碱剂量增大其毒副作用可能会增加。然而更小剂量的苦参碱能否诱导白血病细胞凋亡，目前尚无定论。本研究结果显示，0.3g/L浓度苦参碱作用K562细胞5天，细胞形态学上表现为抱团生长、出芽，并有细胞碎片出现。诱导第7天，细胞呈“葡萄串”样生长。电镜观察到了处于不同凋亡时期细胞的典型形态学特征。目前，检测凋亡细胞的方法有很多，但 对培养细胞凋亡进行的定性和定量的检测方法中，最佳的选择是流式细胞仪 [8] 。流式细胞仪检测发现，苦参碱诱导K562细胞第5～7天，亚G 1 期细胞数显著增多，细胞受阻于G 1 期。细胞周期受阻后细胞一般退出增殖周期，走向以下两途径:凋亡与分化。通过Annexin V FITC染色流式细胞仪分析及Hoechst33258染色结果进一步证实苦参碱可诱导白血病K562细胞退出增殖周期，走向凋亡。为了证实<0.3g/Lg剂量苦参碱能否继续诱导K562细胞凋亡，同步进行了0.2g/L、0.1g/L浓度的苦参碱的诱导K562细胞7天实验，发现0.2g/L浓度苦参碱以诱导K562细胞分化为主，同时伴有凋亡，0.1g/L只诱导K562细胞分化不能诱导其凋亡(待发表资料)。所以，0.3g/L浓度苦参碱可能是诱导白血病细胞凋亡的最适浓度。
, 百拇医药
有学者发现，苦参碱诱导胃腺癌细胞系凋亡，仍因抑制BCL-2表达下调有关 [9] ，而这一途径在苦参碱诱导其它肿瘤细胞凋亡中是否具有普遍性，有待进一步证实。另外，在用同一浓度苦参碱诱导急性淋巴母细胞白血病细胞系JM7天的实验中，未发现细胞凋亡现象。以上结果提示，苦参碱诱导肿瘤细胞凋亡可能与肿瘤细胞的起源及类型有关，0.3g/L浓度苦参碱能诱导髓系白血病细胞K562凋亡，苦参碱可能是髓系白血病细胞的高效能凋亡诱导剂。
(本文图1、3、5略)
参考文献
1 Lai JP，He XW，Jiang Y，et al.Preparative separation and determination of
matrine from the Chinese medicinal plant Sophora flavescens Ait by molecularly imprinted solid-phase extraction.Anal Bioanal Chem，2003，375(2):264-269.
, 百拇医药
2 张彦，蒋纪恺，刘小珊，等.苦参碱诱导K562白血病细胞分化和凋亡的实验研究.中华血液学杂志，1999，20(6):315-316.
3 于文强，孙秉中，柴玉波，等.三氧化二砷诱导急性早幼粒细胞白血病细胞凋亡的研究.细胞与分子免疫学杂志，2002，18(6):592-594
4 Zhu XH，Qiu YD，Shi MK.et al.Effect of matrine on cold ischemia and reperfusion injury of sinusoidal endothelial cells in rat orthotopic liver transplantation.Acta Pharmacol Sin，2003，24(2):169-174.
5 司维可，尚桃元，康格非.苦参碱对人肝癌HepG2的细胞形态影响和相关增殖因素的变化.第三军医大学学报，2000，22(6):553-556.
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6 林洪生，李树奇，裴迎霞，等.川芎嗪苦参碱对癌细胞与内皮细胞粘附及粘附因子表达的影响.中国新药杂志，1999，8(6):384-386.
7 陈伟忠，林勇，谢渭芬.苦参碱抗肿瘤机制的研究进展.肿瘤学杂志，2002，8(1):4-6.
8 彭黎明，王会礼.细胞凋亡的基础与临床.北京:人民卫生出版社，2000，16-26.
9 张百红，岳红去，李新民，等.苦参碱对胃腺癌细胞SGC-7901BCL-2表达的影响.中国肿瘤临床与康复，2000，7(3):34-35.
基金项目:国家自然科学基金资助课题(No.30171186)
作者单位:1 710032西安第四军医大学西京医院血液科
2 第四军医大学病理学教研室
3 第四军医大学免疫学教研室
(编辑 李年令), http://www.100md.com(张永清)