丹参对脑缺血后磷酸化cAMP反应元件结合蛋白表达的影响
【摘要】 目的 观察丹参对短暂性全脑缺血后大鼠海马CA1区及齿状回转录因子磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(pCREB)表达的影响，探讨丹参脑保护的可能机制。方法 采用四动脉阻断法制备大鼠全脑缺血模型，缺血15min。免疫组化染色观察海马CA1区及齿状回pCREB阳性细胞的表达特性;TUNEL法检测神经细胞凋亡。结果 丹参可提高海马CA1区pCREB阳性细胞的表达数量及持续时间，同时减少凋亡细胞数目。结论 脑缺血再灌注促进了pCREB的表达，丹参可通过提高其表达来发挥其神经保护作用。
关键词 CREB 脑缺血 丹参 大鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)12-1771-03
The effect of RSM on the expression of the
phospho-cAMP response element binding protein in hippocampus
, http://www.100md.com
following global ischemia-reperfusion
Shen Xia，Ge Wei，Liu Yonghai，et al.
Department of Neurology，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002.
【Abstract】 Objective To explore the possible neuroprotective mechanism of the Radix Salviae Miltiorrhizae(RSM)，we observed the effect of RSM on the distributions of the phospho-cAMP response element binding protein in hippocampus CA1and DG subfield of rats following global ischemia-reperfusion.Methods Adult mal
, 百拇医药
e Sprague-Dawley(SD)rats were subjected to the15minutes’transient cerebral is chemia induced by the four-vessel occlusion method.Using immunohistochemistry with anti-phospho-CREB antibody，we studied the distribution of pCREB imˉmune positive cells.We also observed the apoptotic cells by TUNEL staining.Results RSM can enhance the number and duration of pCREB positive cells;it can also alleviate apoptosis.Conclusion Global ischemia-reperfusion proˉmote the expression of pCREB，which maybe involved in protection after cerebral ischemia.
, http://www.100md.com
Key words CREB cerebral ischemia RSM rat
近年来发现转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)在中枢神经系统中起着关键作用，诸如促进神经细胞的存活、再生、分化等。目前已有实验证明急性短暂性脑缺血可活化CREB成为磷酸化CREB(pCREB)，并进一步通过下游基因产物的表达发挥着广泛的生物学作用。本研究拟通过免疫组化染色观察丹参对大鼠全脑缺血再灌注后海马pCREB表达及细胞凋亡的影响，来探讨丹参的神经细胞保护作用。
1 材料与方法
1.1 动物模型及样本的制备 成年健康雄性SD大鼠共45只，体重280～320g，购自徐州医学院实验动物中心。参照文献 [1] 采用四血管阻断法制备大鼠全脑缺血模型，缺血时间为15min，再灌注时间点分别为3、12、24、72h。假手术组5只，生理盐水组及丹参组每时间点各5只。丹参组大鼠于缺血前10min腹腔注射15g/kg丹参注射液(正大青春制药厂);生理盐水组于缺血前10min腹腔注射15g/kg生理盐水;假手术组动物仅灼烧双侧椎动脉，不夹闭双侧颈总动脉。于再灌注后的相应时间点对大鼠进行灌注固定。灌注后的大鼠断头，经4%多聚甲醛溶液固定24h后准备进行标 本的石蜡包埋并制备石蜡切片。
, 百拇医药
1.2 免疫组织化学染色 SP免疫组化试剂盒购自北京中山公司。组织切片以二甲苯脱蜡及系列酒精入水，PBS冲洗。3%H 2 O 2 室温孵育切片10min，PBS冲洗。微波抗原修复10min，PBS冲洗。以封闭液37℃湿盒中孵育切片60min。加抗pCREB抗体(一抗)(用抗体稀释液稀释成1:600)，4℃过夜，PBS冲洗。加生物素二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗。加SP复合物，37℃孵育30min，PBS冲洗。镜下观察DAB显色约5～10min，蒸馏水冲洗。脱水，透明，封片，显微镜观察。
1.3 TUNEL法染色 凋亡试剂盒购自华美试剂公司，实验步骤严格按照说明书进行。组织切片常规脱蜡至水，3%H 2 O 2 室温处理10min，加1:100新鲜稀释胃蛋白酶37℃消化10min，加标记缓冲液20μl/片，室温放置15min。取TdT和Biotin-11-dUTP各2μl，加入16μl标记缓冲液中，混匀后加入切片中，4℃标记过夜。PBS冲洗。加封闭液50μl/片，室温30min。用封闭液1:50稀释亲和素辣根过氧化物酶，50μl/片加至标本切片上，37℃孵育30min，PBS冲洗。DAB显色10～15min，镜下控制显色时间，水洗。脱水、透明、封片，显微镜下观察，被标记的凋亡细胞呈棕黄色。
, 百拇医药
1.4 H-E染色 常规方法行H-E染色。切片直接在光镜下观察，并在10×40倍视野下进行海马CA1区、齿状回神经元计数和形态学观察。
1.5 统计学方法 所有数据均以均数±标准差来表示。应用SPSS10.0统计软件，采用单因素方差分析进行处理。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 海马pCREB阳性细胞的表达 见表1。假手术组在海马各区均可见少量的pCREB阳性细胞。海马CA1区:生理盐水组于再灌注3h时出现表达，并迅速下降，24h同假手术组水平(见图1)。丹参组于3h时较生理盐水组阳性细胞数明显增高(P<0.01)(见图2)，12h达高峰后逐
渐下降，72h时仍高于假手术组。齿状回:生理盐水组在3h即可见 阳性细胞表达(见图3)，并维持高水平至72h后逐渐下降。再灌注各时相，生理盐水组、丹参组各组间齿状回pCREB的表达差异无显著性(P>0.05)。
, http://www.100md.com
2.2 细胞凋亡的结果 见表2。假手术组可见个别TUNEL阳性细胞。海马CA1区:生理盐水组于再灌注24h可见少量阳性细胞，72h达到高峰。丹参组与生理盐水组相比，于再灌注72h TUNEL阳性细胞数明显减少(P<0.01)。齿状回:生理盐水组于再灌注24h以后TUNEL阳性细胞表达渐多。丹参组与生理盐水组相比在齿状回表达差异无显著性(P>0.05)。
表1 pCREB阳性细胞计数(略)
表2 TUNEL阳性细胞计数 (略)
2.3 神经细胞形态学变化 海马CA1区:假手术组海马锥体细胞排列整齐紧密，细胞边界清楚，神经元核大而圆，透明;仅见个别锥体细胞体积缩小，核深染。生理盐水组于再灌注3h、12h海马组织未见有明显改变，24h有15%左右锥体细胞变性、核固缩、深染、有的细胞则表现为细胞肿胀、破裂，细胞间隙增大，周围炎症细胞浸润。72h有70%左右锥体细胞出现严重损伤，表现为细胞核固缩、破裂，细胞边界不清。丹参组与之相比于再灌注72h海马锥体细胞损伤程度明显减轻，坏死细胞数近50%。齿状回:假手术组可见圆形及卵圆形颗粒细胞，排列整齐紧密，高倍镜下可见这些神经元核大而圆，透明，核仁明显。丹参组与生理盐水组齿状回结构基本正常，再灌注72h以后仅见个别细胞体积缩小，核深染，两组相比存活细胞数差异无显著性(P>0.05)。
, http://www.100md.com
2.4 相关分析结果 直线相关分析发现，H-E染色海马存活细胞数和pCREB免疫阳性细胞数目呈正相关(r=0. 94，P<0.01)。
3 讨论
目前认为细胞内钙超载、自由基的过量产生、兴奋性氨基酸毒性是急性缺血性脑损伤的病理机制。随着脑缺血的分子机制的深入研究，发现在损伤发生的同时还激活了内源性保护机制，这将给缺血性脑血管病的治疗提供新思路。近年研究表明，转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)在中枢神经系统中起着关键作用，如促进神经元的再生、存活、修复等 [2，3] 。已有动物实验表明，脑缺血可促进磷酸化CREB(pCREB)的表达，并可能通过诱导其下游基因产物如脑源性神经生长因子、Bcl-2、c-Fos等的表达促进缺血后神经元的存活、再生 [4～6] 。
, http://www.100md.com 本实验观察到，在大鼠全脑缺血15min再灌注3h在海马各区即可见pCREB阳性细胞的表达，与以往报道相似 [7，8]。本实验选择对缺血敏感性不同海马CA1区及齿状回作为观察对象发现，在CA1区仅在3h出现高峰，24h已降至假手术组水平。而在齿状回在3h表达显著高且持续至72h方出现下降趋势，持续时间较长。实验显示，pCREB阳性细胞均为核着色，且可见核形态完整，提示脑缺血后可能促使pCREB在存活细胞中表达，提供了一种促存活信号。
进一步的相关分析表明，海马CA1区及齿状回pCREB免疫阳性细胞与H-E染色观察到的相应亚区存活细胞数目呈正相关，而与TUNEL阳性细胞数无明显相关关系，提示pCREB的表达可能具有促细胞存活作用并主要通过减轻细胞坏死而实现。
丹参是传统的活血化瘀药物，在缺血性脑血管病治疗中有着确切的疗效，其作用机制仍在研究之中。本实验中发现，在丹参的作用下海马CA1区pCREB阳性细胞表达明显增多且表达持续时间延长，而且，丹参还可减少缺血后CA1区的凋亡细胞数目，减轻神经细胞坏死程度。对于缺血后pCREB表达较强且持久的齿状回颗粒细胞，还有多种尚不清楚的机制使其未显示出明显的病理损伤的表现，故丹参的作用体现的不甚显著。
, http://www.100md.com
丹参何以提高缺血后海马pCREB的表达呢?在大鼠局灶性脑缺血模型中发现，pCREB的表达均以缺血周围区最为强而持久，缺血中心区的表达则较弱且短暂。其原因可能是由于缺血中心区的血供下降严重、能量耗竭已不足以具备合成新的蛋白质的能力。而缺血周围区血流量一定程度的下降即诱发pCREB的表达，而其下降的程度也不足以抑制新的蛋白的合成。因此推测，在脑缺血发生后一定程度上血流量的改善有可能促进pCREB的表达。既往研究表明，丹参可降低梗死区肾上腺素(NE)的含量，抑制血栓素(TXB)的合成，改善微循环，降低血管阻力，有利于侧支循环的建立 [9] 。因此，丹参提高pCREB表达的可能机制 为在一定程度上改善了微循环，提高了血流量。
(本文图片略)
参考文献
1 Pulsinelli WA，Buchan AM.The four-vessel occlusion rat model:method for complete occlusion of vertebral arteries and control of collatˉeral circulation.
, http://www.100md.com
Stroke，1988，19(7):913-914.
2 Finkbeiner S.CREB couples neurotrophin signals to survival messages.Neuron，2000，25(1):11-14.
3 Lonze BE，Ginty DD.Function and regulation of CREB family tranˉscription factors in the nervous system.Neuron，2002，35(4):605-623.
4 Mabuchi T，Kitagawa K，Kuwabara K，et all.Phosphorylation of cAMP response
element-binding protein in hippocampal neurons as a protecˉtive response after
, 百拇医药
exposure to glutamate in vitro and ischemia in vivo.J Neurosci，2001，21(23):
9204-9213.
5 Freeland K，Boxer LM，Latchman DS.The cyclic AMP response eleˉment in the
Bcl-2promoter confers inducibility by hypoxia in neuronal cells.Brain Res Mol Brain Res，2001，92(1-2):98-106.
6 Kuramoto N，Azuma Y，Inoue K，et all.Correlation between potentiaˉtion of
, 百拇医药
AP1DNA binding and expression of c-Fos in association with phosphorylation of CREB at serine133in thalamus of gerbils with isˉchemia.Brain Res，1998，806(2):152-164.
7 Hu BR，Fux CM，Martone ME，et all.Persistent phosphorylation of cyclic AMP
responsive element-binding protein and activating tranˉscription factor-2trans
cription factors following transient cerebral isˉchemia in rat brain.Neuroscien
, http://www.100md.com
ce，1999，89(2):437-452.
8 Jin K，Mao XO，Simon RP，Greenberg DA.Cyclic AMP response element binding protein(CREB)and CREB binding protein(CBP)in global cerebral ischemia.J Mol Neurosci，2001，16(1):49-56.
9 刘军，匡培根，李斌.丹参对大鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的实验研究.中国神经免疫学和神经病学杂志，1998，5(2):77-81.
基金项目:江苏省教育厅基金资助(编号为:01KJD320035)
作者单位:1 221002江苏徐州徐州医学院附属医院神经内科
2 221002江苏省徐州市中医院神经内科
(编辑 曲全), 百拇医药(沈霞)
关键词 CREB 脑缺血 丹参 大鼠
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)12-1771-03
The effect of RSM on the expression of the
phospho-cAMP response element binding protein in hippocampus
, http://www.100md.com
following global ischemia-reperfusion
Shen Xia，Ge Wei，Liu Yonghai，et al.
Department of Neurology，the Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College，Xuzhou 221002.
【Abstract】 Objective To explore the possible neuroprotective mechanism of the Radix Salviae Miltiorrhizae(RSM)，we observed the effect of RSM on the distributions of the phospho-cAMP response element binding protein in hippocampus CA1and DG subfield of rats following global ischemia-reperfusion.Methods Adult mal
, 百拇医药
e Sprague-Dawley(SD)rats were subjected to the15minutes’transient cerebral is chemia induced by the four-vessel occlusion method.Using immunohistochemistry with anti-phospho-CREB antibody，we studied the distribution of pCREB imˉmune positive cells.We also observed the apoptotic cells by TUNEL staining.Results RSM can enhance the number and duration of pCREB positive cells;it can also alleviate apoptosis.Conclusion Global ischemia-reperfusion proˉmote the expression of pCREB，which maybe involved in protection after cerebral ischemia.
, http://www.100md.com
Key words CREB cerebral ischemia RSM rat
近年来发现转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)在中枢神经系统中起着关键作用，诸如促进神经细胞的存活、再生、分化等。目前已有实验证明急性短暂性脑缺血可活化CREB成为磷酸化CREB(pCREB)，并进一步通过下游基因产物的表达发挥着广泛的生物学作用。本研究拟通过免疫组化染色观察丹参对大鼠全脑缺血再灌注后海马pCREB表达及细胞凋亡的影响，来探讨丹参的神经细胞保护作用。
1 材料与方法
1.1 动物模型及样本的制备 成年健康雄性SD大鼠共45只，体重280～320g，购自徐州医学院实验动物中心。参照文献 [1] 采用四血管阻断法制备大鼠全脑缺血模型，缺血时间为15min，再灌注时间点分别为3、12、24、72h。假手术组5只，生理盐水组及丹参组每时间点各5只。丹参组大鼠于缺血前10min腹腔注射15g/kg丹参注射液(正大青春制药厂);生理盐水组于缺血前10min腹腔注射15g/kg生理盐水;假手术组动物仅灼烧双侧椎动脉，不夹闭双侧颈总动脉。于再灌注后的相应时间点对大鼠进行灌注固定。灌注后的大鼠断头，经4%多聚甲醛溶液固定24h后准备进行标 本的石蜡包埋并制备石蜡切片。
, 百拇医药
1.2 免疫组织化学染色 SP免疫组化试剂盒购自北京中山公司。组织切片以二甲苯脱蜡及系列酒精入水，PBS冲洗。3%H 2 O 2 室温孵育切片10min，PBS冲洗。微波抗原修复10min，PBS冲洗。以封闭液37℃湿盒中孵育切片60min。加抗pCREB抗体(一抗)(用抗体稀释液稀释成1:600)，4℃过夜，PBS冲洗。加生物素二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗。加SP复合物，37℃孵育30min，PBS冲洗。镜下观察DAB显色约5～10min，蒸馏水冲洗。脱水，透明，封片，显微镜观察。
1.3 TUNEL法染色 凋亡试剂盒购自华美试剂公司，实验步骤严格按照说明书进行。组织切片常规脱蜡至水，3%H 2 O 2 室温处理10min，加1:100新鲜稀释胃蛋白酶37℃消化10min，加标记缓冲液20μl/片，室温放置15min。取TdT和Biotin-11-dUTP各2μl，加入16μl标记缓冲液中，混匀后加入切片中，4℃标记过夜。PBS冲洗。加封闭液50μl/片，室温30min。用封闭液1:50稀释亲和素辣根过氧化物酶，50μl/片加至标本切片上，37℃孵育30min，PBS冲洗。DAB显色10～15min，镜下控制显色时间，水洗。脱水、透明、封片，显微镜下观察，被标记的凋亡细胞呈棕黄色。
, 百拇医药
1.4 H-E染色 常规方法行H-E染色。切片直接在光镜下观察，并在10×40倍视野下进行海马CA1区、齿状回神经元计数和形态学观察。
1.5 统计学方法 所有数据均以均数±标准差来表示。应用SPSS10.0统计软件，采用单因素方差分析进行处理。P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1 海马pCREB阳性细胞的表达 见表1。假手术组在海马各区均可见少量的pCREB阳性细胞。海马CA1区:生理盐水组于再灌注3h时出现表达，并迅速下降，24h同假手术组水平(见图1)。丹参组于3h时较生理盐水组阳性细胞数明显增高(P<0.01)(见图2)，12h达高峰后逐
渐下降，72h时仍高于假手术组。齿状回:生理盐水组在3h即可见 阳性细胞表达(见图3)，并维持高水平至72h后逐渐下降。再灌注各时相，生理盐水组、丹参组各组间齿状回pCREB的表达差异无显著性(P>0.05)。
, http://www.100md.com
2.2 细胞凋亡的结果 见表2。假手术组可见个别TUNEL阳性细胞。海马CA1区:生理盐水组于再灌注24h可见少量阳性细胞，72h达到高峰。丹参组与生理盐水组相比，于再灌注72h TUNEL阳性细胞数明显减少(P<0.01)。齿状回:生理盐水组于再灌注24h以后TUNEL阳性细胞表达渐多。丹参组与生理盐水组相比在齿状回表达差异无显著性(P>0.05)。
表1 pCREB阳性细胞计数(略)
表2 TUNEL阳性细胞计数 (略)
2.3 神经细胞形态学变化 海马CA1区:假手术组海马锥体细胞排列整齐紧密，细胞边界清楚，神经元核大而圆，透明;仅见个别锥体细胞体积缩小，核深染。生理盐水组于再灌注3h、12h海马组织未见有明显改变，24h有15%左右锥体细胞变性、核固缩、深染、有的细胞则表现为细胞肿胀、破裂，细胞间隙增大，周围炎症细胞浸润。72h有70%左右锥体细胞出现严重损伤，表现为细胞核固缩、破裂，细胞边界不清。丹参组与之相比于再灌注72h海马锥体细胞损伤程度明显减轻，坏死细胞数近50%。齿状回:假手术组可见圆形及卵圆形颗粒细胞，排列整齐紧密，高倍镜下可见这些神经元核大而圆，透明，核仁明显。丹参组与生理盐水组齿状回结构基本正常，再灌注72h以后仅见个别细胞体积缩小，核深染，两组相比存活细胞数差异无显著性(P>0.05)。
, http://www.100md.com
2.4 相关分析结果 直线相关分析发现，H-E染色海马存活细胞数和pCREB免疫阳性细胞数目呈正相关(r=0. 94，P<0.01)。
3 讨论
目前认为细胞内钙超载、自由基的过量产生、兴奋性氨基酸毒性是急性缺血性脑损伤的病理机制。随着脑缺血的分子机制的深入研究，发现在损伤发生的同时还激活了内源性保护机制，这将给缺血性脑血管病的治疗提供新思路。近年研究表明，转录因子cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)在中枢神经系统中起着关键作用，如促进神经元的再生、存活、修复等 [2，3] 。已有动物实验表明，脑缺血可促进磷酸化CREB(pCREB)的表达，并可能通过诱导其下游基因产物如脑源性神经生长因子、Bcl-2、c-Fos等的表达促进缺血后神经元的存活、再生 [4～6] 。
, http://www.100md.com 本实验观察到，在大鼠全脑缺血15min再灌注3h在海马各区即可见pCREB阳性细胞的表达，与以往报道相似 [7，8]。本实验选择对缺血敏感性不同海马CA1区及齿状回作为观察对象发现，在CA1区仅在3h出现高峰，24h已降至假手术组水平。而在齿状回在3h表达显著高且持续至72h方出现下降趋势，持续时间较长。实验显示，pCREB阳性细胞均为核着色，且可见核形态完整，提示脑缺血后可能促使pCREB在存活细胞中表达，提供了一种促存活信号。
进一步的相关分析表明，海马CA1区及齿状回pCREB免疫阳性细胞与H-E染色观察到的相应亚区存活细胞数目呈正相关，而与TUNEL阳性细胞数无明显相关关系，提示pCREB的表达可能具有促细胞存活作用并主要通过减轻细胞坏死而实现。
丹参是传统的活血化瘀药物，在缺血性脑血管病治疗中有着确切的疗效，其作用机制仍在研究之中。本实验中发现，在丹参的作用下海马CA1区pCREB阳性细胞表达明显增多且表达持续时间延长，而且，丹参还可减少缺血后CA1区的凋亡细胞数目，减轻神经细胞坏死程度。对于缺血后pCREB表达较强且持久的齿状回颗粒细胞，还有多种尚不清楚的机制使其未显示出明显的病理损伤的表现，故丹参的作用体现的不甚显著。
, http://www.100md.com
丹参何以提高缺血后海马pCREB的表达呢?在大鼠局灶性脑缺血模型中发现，pCREB的表达均以缺血周围区最为强而持久，缺血中心区的表达则较弱且短暂。其原因可能是由于缺血中心区的血供下降严重、能量耗竭已不足以具备合成新的蛋白质的能力。而缺血周围区血流量一定程度的下降即诱发pCREB的表达，而其下降的程度也不足以抑制新的蛋白的合成。因此推测，在脑缺血发生后一定程度上血流量的改善有可能促进pCREB的表达。既往研究表明，丹参可降低梗死区肾上腺素(NE)的含量，抑制血栓素(TXB)的合成，改善微循环，降低血管阻力，有利于侧支循环的建立 [9] 。因此，丹参提高pCREB表达的可能机制 为在一定程度上改善了微循环，提高了血流量。
(本文图片略)
参考文献
1 Pulsinelli WA，Buchan AM.The four-vessel occlusion rat model:method for complete occlusion of vertebral arteries and control of collatˉeral circulation.
, http://www.100md.com
Stroke，1988，19(7):913-914.
2 Finkbeiner S.CREB couples neurotrophin signals to survival messages.Neuron，2000，25(1):11-14.
3 Lonze BE，Ginty DD.Function and regulation of CREB family tranˉscription factors in the nervous system.Neuron，2002，35(4):605-623.
4 Mabuchi T，Kitagawa K，Kuwabara K，et all.Phosphorylation of cAMP response
element-binding protein in hippocampal neurons as a protecˉtive response after
, 百拇医药
exposure to glutamate in vitro and ischemia in vivo.J Neurosci，2001，21(23):
9204-9213.
5 Freeland K，Boxer LM，Latchman DS.The cyclic AMP response eleˉment in the
Bcl-2promoter confers inducibility by hypoxia in neuronal cells.Brain Res Mol Brain Res，2001，92(1-2):98-106.
6 Kuramoto N，Azuma Y，Inoue K，et all.Correlation between potentiaˉtion of
, 百拇医药
AP1DNA binding and expression of c-Fos in association with phosphorylation of CREB at serine133in thalamus of gerbils with isˉchemia.Brain Res，1998，806(2):152-164.
7 Hu BR，Fux CM，Martone ME，et all.Persistent phosphorylation of cyclic AMP
responsive element-binding protein and activating tranˉscription factor-2trans
cription factors following transient cerebral isˉchemia in rat brain.Neuroscien
, http://www.100md.com
ce，1999，89(2):437-452.
8 Jin K，Mao XO，Simon RP，Greenberg DA.Cyclic AMP response element binding protein(CREB)and CREB binding protein(CBP)in global cerebral ischemia.J Mol Neurosci，2001，16(1):49-56.
9 刘军，匡培根，李斌.丹参对大鼠脑缺血再灌注损伤保护机制的实验研究.中国神经免疫学和神经病学杂志，1998，5(2):77-81.
基金项目:江苏省教育厅基金资助(编号为:01KJD320035)
作者单位:1 221002江苏徐州徐州医学院附属医院神经内科
2 221002江苏省徐州市中医院神经内科
(编辑 曲全), 百拇医药(沈霞)