血性胸腹水细胞核DNA定量分析技术
【摘要】 血性胸腹水加等量的50%酒精，可消除红细胞，涂片经Feulgen染色细胞核呈紫红色，背景清晰。将该涂片进行细胞核DNA含量分析，其结果给出细胞平均积分光密度与淋巴细胞平均积分光密度之比(DI值)，以及各种倍体细胞的百分比。提高了对血性胸腹水涂片细胞形态学表现的认识水平。
关键词 胸腹水 核DNA 定量分析
【文献标识码】 B 【文章编号】 1684-2030(2003)12-1124-02
血性胸腹水涂片中，镜下可见较多的红细胞，背景深染成红色;给查找癌细胞造成一定的困难。笔者用50%酒精，加入胸腹水中，以达到消除红细胞的目的，该方法去除了红细胞，背景染色清晰。涂片中细胞核DNA含量的变化，可直接作为反映细胞增殖能力的重要生物学指标。笔者应用Video Pro32彩色图像分析系统，对涂片细胞的DNA含量进行定量分析，以提高对细胞形态学表现的认识水平。具体介绍如下。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 材料 临床科室送检的血性胸腹水。
1.2 涂片制作 收到送检的血性胸腹水后立即加入等量的50%乙醇，摇匀混合后行2000r/min离心10min，倾去上清液，将沉渣作涂片，待半干时入乙醚乙醇(1:1)固定。
1.3 Feulgen染色 经固定的涂片稍水洗后，蒸馏水洗。用5mol/L盐酸稍洗后，室温下在5mol/L盐酸中水解40～60min。然后入Schiff液作用15～20min，硫洗液洗后，水洗10min。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
1.4 DNA含量的图像分析和统计 将染色后的切片置于显微镜下(40×)，对所测细胞进行准确定位后，由彩色摄像机提取细胞图像输入“Video Pro32”彩色图像分析系统，进行处理。最后用计算机统计出二倍体(2C)，三倍体～四倍体，五倍体和超五倍体细胞各占该病例病变细胞的百分数。
, 百拇医药
2 结果
50%乙醇处理的血性胸腹水，细胞保存完整，不变形，Feulgen染色细胞核呈紫红色，背景清晰，红细胞消失或淡染。图像定量分析给出细胞平均积分光密度与淋巴细胞平均积分光密度之比(DI值)，以及各种倍体细胞的百分比。
3 讨论
50%乙醇与胸腹水液体混合后，低渗酒精可使大部分红细胞迅速溶解，红细胞破裂溶解释出血红蛋白，此外乙醇对细胞具有固定作用，能使细胞染色清晰，结构完整。加入50%乙醇的血性胸腹水如来不及离心涂片，可置于4℃冰箱保存数小时后再制片，不会影响其细胞结构及染色效果。总之，用50%乙醇对血性胸腹水进行处理，可制出较满意的细胞涂片。Feulgen染色时，其中水解步骤很重要。笔者用5mol/L盐酸水解DNA，使暴露的醛基易与Schiff试剂结合，从而缩短了染色时间。
图像定量分析中，正常淋巴细胞DNA含量分析，采用 同例中的淋巴细胞。在Video Pro32彩色图像分析系统中，笔者自行设置运行程序，打开该程序便可进行细胞识别、分割、测量和统计。因为对照淋巴细胞应选择成熟的小淋巴细胞，且其选择及测量的准确与否，直接影响结果的判断。所以，在设置该程序时，尽量在选择淋巴细胞方面严格些，多设几个限制参数(如细胞核长宽比、面积、密度、形状、不规则率、灰度的限制)，以避免选用大淋巴或淋巴母细胞。这样通常测定30～50个淋巴细胞的积分光密度值，以其中间值(P50)作为二倍体(2C)DNA含量的对照值。
, 百拇医药
进行涂片细胞DNA含量分析时，应在同样的显微镜光照强度，放大倍数(40×)、尺寸定标及图像修整条件下，输入图像。输入的图像，除了注意避开重迭或趋向坏死的细胞核外，还应避免只选核大的细胞。片中各种形态的细胞都要兼顾，检测的细胞数量不能太少，应在100个以上。通过Video Pro32彩色图像分析系统，测量出细胞核的积分光密度值，作为涂片细胞DNA含量的相对值。
以测得淋巴细胞DNA积分光密度的中间值(P50)为参照。涂片细胞:2C(二倍体)5C的细胞作为异倍体细胞。为了方便计算及直观判断检测结果，笔者做了如下倍体直方图，以P50为横坐标(X轴)，其间各等分段值均为0.25;以百分比(%)为纵坐标(Y轴)。利用计算机画出所测的涂片细胞核DNA在每一递增了P50×0.25值时积分光密度的百分比直方图。使临床医师能根据此直方图了解该胸腹水各种倍体的细胞的分布情况，并很容易得出倍体直方图中X轴第1～5个等分段百分比之和即是2C细胞占该病例病变细胞的百分数。同样，3～4C、5C和异倍体细胞之百分数亦一目了然。应用VideoPro32彩色图像分析系统所进行的胸腹水涂片细胞核DNA含量分析，其结果对该病例良恶性鉴别、恶性程度和预后的判断，以及临床对病人治疗方案的选择都具有重要参考价值。
(收稿日期:2003-11-16)
作者单位:1350004福建医科大学病理学系2福建省卫生学校
(编辑罗 彬), 百拇医药(郑)
关键词 胸腹水 核DNA 定量分析
【文献标识码】 B 【文章编号】 1684-2030(2003)12-1124-02
血性胸腹水涂片中，镜下可见较多的红细胞，背景深染成红色;给查找癌细胞造成一定的困难。笔者用50%酒精，加入胸腹水中，以达到消除红细胞的目的，该方法去除了红细胞，背景染色清晰。涂片中细胞核DNA含量的变化，可直接作为反映细胞增殖能力的重要生物学指标。笔者应用Video Pro32彩色图像分析系统，对涂片细胞的DNA含量进行定量分析，以提高对细胞形态学表现的认识水平。具体介绍如下。
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1 材料与方法
1.1 材料 临床科室送检的血性胸腹水。
1.2 涂片制作 收到送检的血性胸腹水后立即加入等量的50%乙醇，摇匀混合后行2000r/min离心10min，倾去上清液，将沉渣作涂片，待半干时入乙醚乙醇(1:1)固定。
1.3 Feulgen染色 经固定的涂片稍水洗后，蒸馏水洗。用5mol/L盐酸稍洗后，室温下在5mol/L盐酸中水解40～60min。然后入Schiff液作用15～20min，硫洗液洗后，水洗10min。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。
1.4 DNA含量的图像分析和统计 将染色后的切片置于显微镜下(40×)，对所测细胞进行准确定位后，由彩色摄像机提取细胞图像输入“Video Pro32”彩色图像分析系统，进行处理。最后用计算机统计出二倍体(2C)，三倍体～四倍体，五倍体和超五倍体细胞各占该病例病变细胞的百分数。
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2 结果
50%乙醇处理的血性胸腹水，细胞保存完整，不变形，Feulgen染色细胞核呈紫红色，背景清晰，红细胞消失或淡染。图像定量分析给出细胞平均积分光密度与淋巴细胞平均积分光密度之比(DI值)，以及各种倍体细胞的百分比。
3 讨论
50%乙醇与胸腹水液体混合后，低渗酒精可使大部分红细胞迅速溶解，红细胞破裂溶解释出血红蛋白，此外乙醇对细胞具有固定作用，能使细胞染色清晰，结构完整。加入50%乙醇的血性胸腹水如来不及离心涂片，可置于4℃冰箱保存数小时后再制片，不会影响其细胞结构及染色效果。总之，用50%乙醇对血性胸腹水进行处理，可制出较满意的细胞涂片。Feulgen染色时，其中水解步骤很重要。笔者用5mol/L盐酸水解DNA，使暴露的醛基易与Schiff试剂结合，从而缩短了染色时间。
图像定量分析中，正常淋巴细胞DNA含量分析，采用 同例中的淋巴细胞。在Video Pro32彩色图像分析系统中，笔者自行设置运行程序，打开该程序便可进行细胞识别、分割、测量和统计。因为对照淋巴细胞应选择成熟的小淋巴细胞，且其选择及测量的准确与否，直接影响结果的判断。所以，在设置该程序时，尽量在选择淋巴细胞方面严格些，多设几个限制参数(如细胞核长宽比、面积、密度、形状、不规则率、灰度的限制)，以避免选用大淋巴或淋巴母细胞。这样通常测定30～50个淋巴细胞的积分光密度值，以其中间值(P50)作为二倍体(2C)DNA含量的对照值。
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进行涂片细胞DNA含量分析时，应在同样的显微镜光照强度，放大倍数(40×)、尺寸定标及图像修整条件下，输入图像。输入的图像，除了注意避开重迭或趋向坏死的细胞核外，还应避免只选核大的细胞。片中各种形态的细胞都要兼顾，检测的细胞数量不能太少，应在100个以上。通过Video Pro32彩色图像分析系统，测量出细胞核的积分光密度值，作为涂片细胞DNA含量的相对值。
以测得淋巴细胞DNA积分光密度的中间值(P50)为参照。涂片细胞:2C(二倍体)5C的细胞作为异倍体细胞。为了方便计算及直观判断检测结果，笔者做了如下倍体直方图，以P50为横坐标(X轴)，其间各等分段值均为0.25;以百分比(%)为纵坐标(Y轴)。利用计算机画出所测的涂片细胞核DNA在每一递增了P50×0.25值时积分光密度的百分比直方图。使临床医师能根据此直方图了解该胸腹水各种倍体的细胞的分布情况，并很容易得出倍体直方图中X轴第1～5个等分段百分比之和即是2C细胞占该病例病变细胞的百分数。同样，3～4C、5C和异倍体细胞之百分数亦一目了然。应用VideoPro32彩色图像分析系统所进行的胸腹水涂片细胞核DNA含量分析，其结果对该病例良恶性鉴别、恶性程度和预后的判断，以及临床对病人治疗方案的选择都具有重要参考价值。
(收稿日期:2003-11-16)
作者单位:1350004福建医科大学病理学系2福建省卫生学校
(编辑罗 彬), 百拇医药(郑)