兔半月板软骨损伤修复的实验研究
【摘要】 目的 探讨兔半月板软骨损伤修复的条件。方法 选用健康青紫兰兔48只，首先在兔半月板上造成统一的无血运区损伤模型。随机将兔分成四组，分别为空白对照组、FGF治疗组、FS治疗组和FGF/FS治疗组。术后2周、6周、12周分批处死动物，进行大体形态观察和组织学检查。结果 FS治疗组能形成疤痕组织愈合;FGF治疗组对无血运区裂伤愈合无明显影响，而对半月板边缘滑膜中成纤维细胞有促增殖作用;FGF/FS治疗组为纤维软骨样组织愈合，但其愈合组织与正常半月板组织仍有差异。结论 应用FGF与FS复合物治疗半月板无血运区的损伤是一条有效的治疗途径。
关键词 半月板损伤 成纤维细胞生长因子 纤维蛋白粘合剂
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)12-1062-02
An experimental study of meniscus repair
, 百拇医药
Xiong Jianyi，Wang Daping，Xiao jiande.
Department of Orthopaedic Surgery，The Second Hospital of Shenzhen，Guangdong518035.
【Abstract】 Objective To study the conditions of injuries in the avascular area of menisci.Methods 48healthy rabbits randomly divided into three groups，including control group、FS-filled group、FGF-filled group and FGF/FS-filled group.Models of meniscus injuries in avascular area were established.The animals were killed in two，six，twelve weeks postoperatively and menisci were taken and observed both grossey and microscopically.Results FS being placed in the avascular portion of the menisci can result in scar-like tissue healing.No significant effect was seen in group of bFGF，but proliferation promoting reaction on fibroblastsin synovial membrane at the margin of menisci did exist.The lesion within the avascular portion of the meniscus can be healed by using FGF/FS.The reparˉative tissue is a fibrocartilagious tissue which is different from the normal tissue.Conclusion It may represent a poˉtential method of the avascular meniscal repair by placing the composite of FGF and FS.
, 百拇医药
Key words Meniscus injury Fibroblast growth factor(FGF) Fibrin sealing(FS)
近年的研究表明，膝半月板具有重要的生理功能，半月板切除后可引起关节的退行性变性 [1] 。由于关月板游离缘(无血运区)损伤不能自然愈合，因此，研究半月板无血运区损伤愈合的条件就具有重要的意义。我们采用纤维蛋白粘合剂及成纤维细胞生长因子治疗半月板无血运区的损伤，取得了较好的结果。
1 材料与方法
1.1 FGF与FS复合物的制备 本实验所用重组碱性成纤维细胞生长因子(rbFGF)，由珠海东大海特生物工程有限公司提供，凝血酶由珠海经济特区生物化学制药厂生产。纤维蛋白原按Kjaergard [2] 报告的方法自行制备。FS的配制:分别用1ml等渗盐水溶解纤维蛋白原及凝血酶，再分别吸入注射器。治疗时，可直视下将两注射器同时推进，注射于治疗部位即可。bFGF/FS复合物的配制:分别用2ml等渗盐水溶解bFGF20μg，然后用溶液分别溶解凝血酶及纤维蛋白原，使bFGF浓度为10μg/ml，再分别吸入两个注射器备用。
, 百拇医药
1.2 动物实验 健康成年青紫兰兔48只，体重2.0～3.1Kg。随机分为空白对照组、FS治疗组、FGF治疗组和FGF/FS治疗组。2.5%戊巴比妥钠(2.5mg/kg)，静脉全麻;取双膝髌韧带内侧弧形切口，沿髌骨内上缘至胫骨结节处切开皮肤，用自制的半月板拉钩显露内侧半月板前角、体部及股骨髁软骨面;用镰状刀片于内侧半月板前角和体部中央做一个长0.7cm、宽0.3cm的全层裂伤，然后分别用FS或FGF/FS注入裂口，至填塞物与半月板表面平为止;FGF组每只兔每天每侧膝关节注射1mlbFGF2.0μg/ml一次，连续3周。空白对照组不用任何填塞处理。分别于术后2周、6周、12周处死动物，每组每期为4只共8个半月板，行大体形态观察和组织学检查。将半月板标本进行大体形态观察后，再置入10%甲醛溶液中固定1～3天，然后进行脱水、浸蜡与包埋，标本采用HE染色，光镜检查。
2 结果
2.1 大体观察 观察三组共48只兔手术侧膝关节无切口感染及关节积液，无半月板与关节面软骨粘连;空白对照组及FGF组半月板裂口均未愈合，未见组织填充;FS组及FGF/FS组的全部半月板伤口均已被组织填充。愈合组织的颜色比正常半月板组织深，裂口较术前变窄，其表面稍向内陷，愈合组织与邻近半月板组织粘连紧密。
, 百拇医药
2.2 组织学检查
2.2.1 FS组 术后2周，镜下见半月板缺损被纤维蛋白填充，偶可见少许成纤维细胞样细胞;术后6周，组织学上见缺损覆盖处组织与纤维组织相似，基质周围可见散在成纤维细胞样细胞;术后12周，见所有缺损被胶原纤维样组织填充，有较多的成纤维细胞样细胞，与邻近组织连接较紧密。
2.2.2 FGF组 术后1个月，半月板裂口均未见愈合，其边缘无软骨细胞增殖，亦无软骨同源细胞群。术后6周，半月板边缘滑膜中成纤维细胞、滑膜细胞明显增生，血管也见增生。但裂口均未见愈合。
2.2.3 FGF/FS组 术后2周见缺损为红色的纤维蛋白组织填充，充满整个缺损区，亦可见少量成纤维细胞样细胞;术后6周，镜下见缺损内被胶原纤维组织填充，成纤维细胞为其主要的细胞成份;术后12周，所有缺损均被纤维软骨样组织填充。可见软骨细胞特有的软骨陷窝及骨囊，但修复的组织与邻近正常的半月板组织仍有差异，愈合组织中仍可见成纤维细胞样细胞。
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2.2.4 对照组 术后2～12周共观察空白对照组半月板24个，其裂口均未见愈合，其边缘无软骨细胞增殖。
3 讨论
3.1 半月板无血运区损伤的自然转归 本实验的主要目的是探索半月板无血运区损伤愈合的条件。在实验设计时，有一组为空白对照组，至术后12周检查损伤的半月板，其裂口均未见愈合。此结果与国内外许多学者的研究结果一致，即半月板无血运区损伤后，不能自然愈合 [3] 。但近年的研究表明，半月板并非一定完全惰性的组织，在一定的条件下(如电刺激)，半月板无血运区的损伤可产生纤维组织愈合 [3] 。因此，笔者认为，半月板无血运区损伤不能自然愈合，要促使其愈合，必须借助于一定的外部条件。
3.2 纤维蛋白粘合剂在半月板损伤愈合中的作用 纤维蛋白粘合剂为一种低抗原性的生物大分子材料。八十年前，就发现它有伤口止血的作用。此后，FS的应用逐渐广泛，现在已知道，纤维蛋白在伤口愈合过程中起着重要作用，它在伤口内形成的网状物既可作为成纤维细胞移行生长的支架，又可作为一种止血物质。近年来，FS作为一种生物性载体的应用逐渐增多。有人研究了FS作为某些骨生长因子(如骨形态发生蛋白BMP)的生理释放系统，证明FS可逐渐释放骨生长因子，BMP/SF可增强BMP的诱导成骨活性。本实验组中，有一组为单用FS治疗组，其结果证实FS具有刺激伤口处成纤维细胞生长，诱导胶原纤维形成的作用，可形成疤痕组织愈合。根据本实验结果分析，笔者同意Arnoczkg的观点 [4，5] ，即半月板无血运区损伤不愈合的 主要原因是半月板创口内无纤维蛋白凝块，后者可作为细胞基质的支架，并对创口愈合的细胞成份起刺激作用。笔者认为，FS不仅可作为一种创口愈合的支架，而且也是一种较好的生物性载体，但单用FS治疗半月板损伤只能形成疤痕组织愈合，其治疗效果有待进一步提高。
, 百拇医药
3.3 FGF/FS在半月板损伤愈合中的作用 近十几年的研究表明，FGF的作用范围十分广泛，它有较强的诱导中胚层细胞转化为成纤维细胞的作用。通过体外细胞培养及动物体内实验证明，FGF在创伤愈合过程中起着重要的作用，它能刺激创口内各类细胞的增殖，这些细胞包括毛细血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和软骨细胞等。Webber等通过半月板软骨细胞培养证明，FGF能有效地刺激半月板软骨细胞内的DNA的合成，促进纤维软骨细胞进行有丝分裂及增殖作用。本实验结果表明，FGF/FS可增强FGF的生物学活性，其实验结果比单用FGF或单用FS的结果均要好，可形成纤维软骨样愈合。但其愈合组织与正常半月板纤维软骨组织仍有差异，其原因主要考虑为:(1)半月板损伤愈合的观察时间不够长，细胞尚未全部分化为成熟的纤维软骨细胞;(2)所给予的半月板损伤愈合的条件尚不完善，如还需要其他生长因子的相互作用等。单独应用FGF治疗半月板损伤，发现对无血运区半月板的损伤愈合无明显影响，考虑主要与半月板创口内无桥架材料以及FGF无保护剂型及载体，在体内易被吸收和降解等有关。
, 百拇医药
参考文献
1 Debber RJ，Harris Mg，Hough AJ.Serum-free culture of rabbit menisˉcal fibrochondrocytes:proliferative response.J Orthop Res，1988，6:13-19.
2 Kjaergard HK，Weis Fough Us，Sorensen H，et al.A simple method of preparation of autologous fibrin by means of ethanol.Surg Gymecol Obˉstet，1992，175:72-78.
3 刘晋才，黄海洋.电刺激半月板无血运区愈合的组织学特征.中华骨科杂志，1996，16:47-49.
, 百拇医药
4 Arnoczky Sp，Warren RF，Spivak Jm.Meniscal repair using an exogeˉnous fibrin clot.J Bone Joint Surg，1988，70-A:1209-1215.
5 Liu Y，Chen F，Liu W，et al.Repairing large porcine full-thickness deˉfects of articular cartilage using autologous chondrocyte-engineered carˉtilage.Tissue Eng，2002，8(4):709.
(收稿日期:2003-12-15)
作者单位:518035广东省深圳市第二人民医院骨三科
(编辑晓 勇), 百拇医药(熊建义)
关键词 半月板损伤 成纤维细胞生长因子 纤维蛋白粘合剂
【文献标识码】 A 【文章编号】 1684-2030(2003)12-1062-02
An experimental study of meniscus repair
, 百拇医药
Xiong Jianyi，Wang Daping，Xiao jiande.
Department of Orthopaedic Surgery，The Second Hospital of Shenzhen，Guangdong518035.
【Abstract】 Objective To study the conditions of injuries in the avascular area of menisci.Methods 48healthy rabbits randomly divided into three groups，including control group、FS-filled group、FGF-filled group and FGF/FS-filled group.Models of meniscus injuries in avascular area were established.The animals were killed in two，six，twelve weeks postoperatively and menisci were taken and observed both grossey and microscopically.Results FS being placed in the avascular portion of the menisci can result in scar-like tissue healing.No significant effect was seen in group of bFGF，but proliferation promoting reaction on fibroblastsin synovial membrane at the margin of menisci did exist.The lesion within the avascular portion of the meniscus can be healed by using FGF/FS.The reparˉative tissue is a fibrocartilagious tissue which is different from the normal tissue.Conclusion It may represent a poˉtential method of the avascular meniscal repair by placing the composite of FGF and FS.
, 百拇医药
Key words Meniscus injury Fibroblast growth factor(FGF) Fibrin sealing(FS)
近年的研究表明，膝半月板具有重要的生理功能，半月板切除后可引起关节的退行性变性 [1] 。由于关月板游离缘(无血运区)损伤不能自然愈合，因此，研究半月板无血运区损伤愈合的条件就具有重要的意义。我们采用纤维蛋白粘合剂及成纤维细胞生长因子治疗半月板无血运区的损伤，取得了较好的结果。
1 材料与方法
1.1 FGF与FS复合物的制备 本实验所用重组碱性成纤维细胞生长因子(rbFGF)，由珠海东大海特生物工程有限公司提供，凝血酶由珠海经济特区生物化学制药厂生产。纤维蛋白原按Kjaergard [2] 报告的方法自行制备。FS的配制:分别用1ml等渗盐水溶解纤维蛋白原及凝血酶，再分别吸入注射器。治疗时，可直视下将两注射器同时推进，注射于治疗部位即可。bFGF/FS复合物的配制:分别用2ml等渗盐水溶解bFGF20μg，然后用溶液分别溶解凝血酶及纤维蛋白原，使bFGF浓度为10μg/ml，再分别吸入两个注射器备用。
, 百拇医药
1.2 动物实验 健康成年青紫兰兔48只，体重2.0～3.1Kg。随机分为空白对照组、FS治疗组、FGF治疗组和FGF/FS治疗组。2.5%戊巴比妥钠(2.5mg/kg)，静脉全麻;取双膝髌韧带内侧弧形切口，沿髌骨内上缘至胫骨结节处切开皮肤，用自制的半月板拉钩显露内侧半月板前角、体部及股骨髁软骨面;用镰状刀片于内侧半月板前角和体部中央做一个长0.7cm、宽0.3cm的全层裂伤，然后分别用FS或FGF/FS注入裂口，至填塞物与半月板表面平为止;FGF组每只兔每天每侧膝关节注射1mlbFGF2.0μg/ml一次，连续3周。空白对照组不用任何填塞处理。分别于术后2周、6周、12周处死动物，每组每期为4只共8个半月板，行大体形态观察和组织学检查。将半月板标本进行大体形态观察后，再置入10%甲醛溶液中固定1～3天，然后进行脱水、浸蜡与包埋，标本采用HE染色，光镜检查。
2 结果
2.1 大体观察 观察三组共48只兔手术侧膝关节无切口感染及关节积液，无半月板与关节面软骨粘连;空白对照组及FGF组半月板裂口均未愈合，未见组织填充;FS组及FGF/FS组的全部半月板伤口均已被组织填充。愈合组织的颜色比正常半月板组织深，裂口较术前变窄，其表面稍向内陷，愈合组织与邻近半月板组织粘连紧密。
, 百拇医药
2.2 组织学检查
2.2.1 FS组 术后2周，镜下见半月板缺损被纤维蛋白填充，偶可见少许成纤维细胞样细胞;术后6周，组织学上见缺损覆盖处组织与纤维组织相似，基质周围可见散在成纤维细胞样细胞;术后12周，见所有缺损被胶原纤维样组织填充，有较多的成纤维细胞样细胞，与邻近组织连接较紧密。
2.2.2 FGF组 术后1个月，半月板裂口均未见愈合，其边缘无软骨细胞增殖，亦无软骨同源细胞群。术后6周，半月板边缘滑膜中成纤维细胞、滑膜细胞明显增生，血管也见增生。但裂口均未见愈合。
2.2.3 FGF/FS组 术后2周见缺损为红色的纤维蛋白组织填充，充满整个缺损区，亦可见少量成纤维细胞样细胞;术后6周，镜下见缺损内被胶原纤维组织填充，成纤维细胞为其主要的细胞成份;术后12周，所有缺损均被纤维软骨样组织填充。可见软骨细胞特有的软骨陷窝及骨囊，但修复的组织与邻近正常的半月板组织仍有差异，愈合组织中仍可见成纤维细胞样细胞。
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2.2.4 对照组 术后2～12周共观察空白对照组半月板24个，其裂口均未见愈合，其边缘无软骨细胞增殖。
3 讨论
3.1 半月板无血运区损伤的自然转归 本实验的主要目的是探索半月板无血运区损伤愈合的条件。在实验设计时，有一组为空白对照组，至术后12周检查损伤的半月板，其裂口均未见愈合。此结果与国内外许多学者的研究结果一致，即半月板无血运区损伤后，不能自然愈合 [3] 。但近年的研究表明，半月板并非一定完全惰性的组织，在一定的条件下(如电刺激)，半月板无血运区的损伤可产生纤维组织愈合 [3] 。因此，笔者认为，半月板无血运区损伤不能自然愈合，要促使其愈合，必须借助于一定的外部条件。
3.2 纤维蛋白粘合剂在半月板损伤愈合中的作用 纤维蛋白粘合剂为一种低抗原性的生物大分子材料。八十年前，就发现它有伤口止血的作用。此后，FS的应用逐渐广泛，现在已知道，纤维蛋白在伤口愈合过程中起着重要作用，它在伤口内形成的网状物既可作为成纤维细胞移行生长的支架，又可作为一种止血物质。近年来，FS作为一种生物性载体的应用逐渐增多。有人研究了FS作为某些骨生长因子(如骨形态发生蛋白BMP)的生理释放系统，证明FS可逐渐释放骨生长因子，BMP/SF可增强BMP的诱导成骨活性。本实验组中，有一组为单用FS治疗组，其结果证实FS具有刺激伤口处成纤维细胞生长，诱导胶原纤维形成的作用，可形成疤痕组织愈合。根据本实验结果分析，笔者同意Arnoczkg的观点 [4，5] ，即半月板无血运区损伤不愈合的 主要原因是半月板创口内无纤维蛋白凝块，后者可作为细胞基质的支架，并对创口愈合的细胞成份起刺激作用。笔者认为，FS不仅可作为一种创口愈合的支架，而且也是一种较好的生物性载体，但单用FS治疗半月板损伤只能形成疤痕组织愈合，其治疗效果有待进一步提高。
, 百拇医药
3.3 FGF/FS在半月板损伤愈合中的作用 近十几年的研究表明，FGF的作用范围十分广泛，它有较强的诱导中胚层细胞转化为成纤维细胞的作用。通过体外细胞培养及动物体内实验证明，FGF在创伤愈合过程中起着重要的作用，它能刺激创口内各类细胞的增殖，这些细胞包括毛细血管内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和软骨细胞等。Webber等通过半月板软骨细胞培养证明，FGF能有效地刺激半月板软骨细胞内的DNA的合成，促进纤维软骨细胞进行有丝分裂及增殖作用。本实验结果表明，FGF/FS可增强FGF的生物学活性，其实验结果比单用FGF或单用FS的结果均要好，可形成纤维软骨样愈合。但其愈合组织与正常半月板纤维软骨组织仍有差异，其原因主要考虑为:(1)半月板损伤愈合的观察时间不够长，细胞尚未全部分化为成熟的纤维软骨细胞;(2)所给予的半月板损伤愈合的条件尚不完善，如还需要其他生长因子的相互作用等。单独应用FGF治疗半月板损伤，发现对无血运区半月板的损伤愈合无明显影响，考虑主要与半月板创口内无桥架材料以及FGF无保护剂型及载体，在体内易被吸收和降解等有关。
, 百拇医药
参考文献
1 Debber RJ，Harris Mg，Hough AJ.Serum-free culture of rabbit menisˉcal fibrochondrocytes:proliferative response.J Orthop Res，1988，6:13-19.
2 Kjaergard HK，Weis Fough Us，Sorensen H，et al.A simple method of preparation of autologous fibrin by means of ethanol.Surg Gymecol Obˉstet，1992，175:72-78.
3 刘晋才，黄海洋.电刺激半月板无血运区愈合的组织学特征.中华骨科杂志，1996，16:47-49.
, 百拇医药
4 Arnoczky Sp，Warren RF，Spivak Jm.Meniscal repair using an exogeˉnous fibrin clot.J Bone Joint Surg，1988，70-A:1209-1215.
5 Liu Y，Chen F，Liu W，et al.Repairing large porcine full-thickness deˉfects of articular cartilage using autologous chondrocyte-engineered carˉtilage.Tissue Eng，2002，8(4):709.
(收稿日期:2003-12-15)
作者单位:518035广东省深圳市第二人民医院骨三科
(编辑晓 勇), 百拇医药(熊建义)